全ゲノムアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーションの技術デモンストレーション

Summary

このビデオでは、アーカイブホルマリン固定材料など、さまざまなソースから単離することができるDNAの唯一の25から100 ngを用いてヒトゲノム全体をスキャンして全ゲノムタイリングのパスアレイCGH、のためのハイブリダイゼーションプロトコルの技術的なデモンストレーションです。

Abstract

アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（アレイCGH）はゲノム¹のDNAセグメントまたは遺伝子量の損益を検出する方法です。この技術の最近の進歩により、がんやその他の遺伝性疾患²の遺伝子変異の同定のための全ゲノムの高解像度の比較を有効にしている。サブメガベース解像度タイルセットの配列（またはSMRT）の配列は、約100キロベースペア（KB）のセグメント^2をヒトゲノムにまたがる約3万重複する細菌人工染色体（BAC）クローンのセットで構成されます。これらのBACの目標は、個々に合成し、単一のガラススライド^2-4二重にスポットされています。アレイCGHは、競合ハイブリダイゼーションの原理に基づいています。サンプルとリファレンスのDNAは、差動シアニン- 3で標識し、シアニン- 5蛍光色素、及び配列に共同ハイブリダイズさせる。潜伏期間の後にバインドされていないサンプルは、スライドから洗浄され、配列が結像される。 SeeGH（www.flintbox.ca）と呼ばれる自由に利用できるカスタムソフトウェアパッケージは、収集した大量のデータを処理するために使用されます - 単一の実験では、53892のデータポイントを生成します。 SeeGHは垂直に染色体の位置を^5,6に整列されている各BACのターゲットで2サンプル間のLOG2信号の強度比を可視化する。 SMRTの配列は、サイズ⁷の50キロバイトのような小さな変化を検出することができます。 SMRTの配列は、DNAの利益、損失、増幅およびホモ接合の欠失を含むDNA再構成のさまざまなイベントを検出することができます。 SMRTの配列のユニークな利点は1つが、ホルマリン固定パラフィン包埋サンプルから単離されたDNAを使用できることです。非増幅DNA（25 - 100ng）の低入力要件と組み合わせるとこのようなマイクロダイセクション^7,8で生成されるものとして貴重なサンプルのプロファイリングが可能になります。これは、十分な標識サンプルの結合は検出のための信号を生成することができます各BACのハイブリダイゼーションのターゲットの大きなサイズに起因する。このプラットフォームのもう一つの利点は、退屈な組織マイクロダイセクション⁸の必要性を減少させる、組織の不均一性の許容範囲です。このビデオプロトコルは、全ゲノムのタイルのパスのSMRTの配列のために買収を通知することによって入力のDNAをラベリングからステップバイステップのチュートリアルです。

Protocol

プローブラベリング

注：常に光にCYE染料の限界露出（これは暗い領域で作業するか、アルミ箔等のカバーでチューブを保護することによって達成することができます）

1. 組み合わせる：
   （リファレンスとサンプルは1反応管のためのセットアップ1反応チューブ）
   • DNA（25〜400 ng）を
   • 5Xランダムプライマーの緩衝液5μL（最終濃度：5Xプロメガクレノーバッファおよび7μg/μLのランダム八量体）
   • 蒸留H ₂ Oと17.0μL、総容積に希釈する
2. 100℃10分間沸騰℃に1分間氷にすぐに転送する。
3. 10X dNTPミックス（2mMのdATPを用い、dGTPを、dTTPの、さ1.2mm dCTPを）4μLを加える。
4. CyeDyesを追加します。
   • サンプルDNAへのCy - 3標識dCTPの2μLを（2ナノモル）追加
   • リファレンスDNA（例えば、Novagen社のヒトゲノムDNA）へのCy - 5標識dCTPの2μLを（2ナノモル）追加
5. 2.5クレノウのμL（9 U /μL、プロメガ社製）とミックスを追加。
6. 37℃で一晩*（〜18時間）。
   
   *一晩ハイブリダイゼーションの時間に悪影響を実験室のスケジュールに合わせてラベルのプロセスに影響を与えることなく、14〜24時間の間で調整することができます。

SAMPLEをクリーンアップ

（ハイブリダイゼーション用プローブのクリーンアップと準備の組み合わせ）

1. マイクロコンYM - 30カラムを使用する：
   • カラムに100μLCOT - 1 DNA（1μg/μL）を追加します。ピペットチップでメンブレンに触れないでください。
   • プール反応（リファレンスとサンプル）とカラムに追加します。
   • 10分間13000グラムで提供されるチューブやスピンで列を置きます。
   • 膜に200μLの蒸留H ₂ 0を追加し、洗うようにスピンを繰り返します。
   • チューブを廃棄し、45μLハイブリダイゼーション溶液を追加：（ロシュのDIG Easy）
   オプション：追加5μLせん断ニシン精子DNA（10μg/μLユニット、プロメガ社製）
   
   • マイクロコン、新しいラベルが付いたチューブの場所、および3分間3000gでスピン反転。

法人設立の計算

1. 1.5μLと光度計分光光度計を用いて測定する蛍光物質の混入を取り外します。ブランクとしてハイブリダイゼーションバッファーを用いて（DIGイージー）画面の指示に従います。 （必要に応じて測定後、台座からサンプルを回復することができます。）
   
   （ 注：いずれかのチャネルでは3.0ピコモル/μL以下の法人設立には、変数の結果を示している。）
   
   
2. 85変性℃で10分間。
3. 45℃の場所プローブ° C 30分〜1時間（COT - 1 DNAのアニーリングが可能。）用

アレイハイブリダイゼーション

1. カバースリップ上に場所44μLプローブ溶液（22ミリメートル× 60ミリメートル）（フィッシャーサイエンティフィック）。利用可能な場合は、スライド上に暖かいまたはヒートブロック℃の温度を維持するために45に予め温めておいたカバーを置きます。
2. カバースリップとプローブ溶液上にスライド、ハイブリダイゼーション溶液との接触を可能にするスライドのうち低い方の端を合わせます。カバースリップが表面張力でスライドにアタッチされるまで下げるために引き続き。スライドを反転。
3. ハイブリダイゼーションカセット（Telechem）、事前に温め、45 ° C、及び（ハイブリダイゼーションの間に湿度を制御するために）下の溝に水を10μLを追加するにスライドを置きます。
4. 36のシールのカセットとインキュベート - 45℃40時間℃、

洗濯ARRAY

注：すべての洗浄溶液は、pH7.0でいる

ハイブリダイゼーションカセットからスライドの除去は重要です。のDIG Easyは、すぐに室温で結晶化する。スライドはすぐに浸漬し、カバーガラスは洗浄溶液で除去する必要があります。

1. 約60 0.1XSSC mLを加え、0.1％SDS液（pH7.0、45℃）ハイブリダイゼーションチャンバーを開く前にコプリンジャーにソリューションを洗う。を追加
2. ソリューションを洗浄し、（それがオフにスライドしてください）​​カバースリップを削除するスライドを追加し、チャンバーオープン。
3. ℃1分ごとに攪拌しながらスライドを0.1XSSCで3回+ 45 0.1％SDSを洗ってください。
4. 新鮮な0.1XSSCでスライドを3回すすいでください*.目に見えるSDSの洗浄からの残留気泡がないはずです。
   
   *スライドは、遠心分離し、（〜15分）をスキャンする準備ができるまで、最後の洗浄溶液中に残ることができる。
   
   
5. 3分間、700 gで50 mLのファルコンチューブにスライドを遠心分離します。
6. すぐに（信号強度が時間と共に低下します。）スライドをスキャン

Discussion

低品質のDNAは、適切なハイブリダイゼーションのプロファイルを提供することはありません。それはそのサンプルとリファレンスDNAを確保するために不可欠であるようなハイブリダイゼーション実験を開始する前に、ランダムプライムラベリングステップを妨げる可能性フェノール、RNA、塩、等のような汚染物質から自由である。例えば、トリスのDNAの再懸濁 - 水の代わりにEDTA（TE）は、高塩濃度として推奨されていないが標識反応を阻害することができる。我々はDNAの量だけでなく、全体の吸光度曲線の形と280分の260、230分の260の比率の両方を測定する光度計分光光度計を用いてDNAの品質を測定することをお勧めします。

洗濯：ハイブリダイゼーションカセットからスライドを削除し、加熱された洗浄液に移すことがDIG Easyハイブリダイゼーション溶液は非常に迅速に結晶化するようにハイブリダイゼーションプロセスの重要なステップです。それは、洗浄溶液のpHが中性になることが重要であると結合していないプローブを除去しながら洗浄溶液の温度は、厳しさのために重要です。スライドを乾燥させた後、それはすぐにスキャンしていない場合、またはあなたが後でそれらを再スキャンする場合、スキャン後、暗所でそ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5X Klenow バッファー	試薬	Promega Corp.
ランダムオクタマー	試薬	Alpha DNA
10X dNTP mix	試薬	Promega Corp.		2mM dATP, dGTP, dTTP, 1.2mM dCTP
Cy-3 標識 dCTP	試薬	GE Healthcare
Cy-5 標識試薬 dCTP	試薬	GE Healthcare
ヒトゲノム DNA 参照	試薬	Novagen, EMD Millipore		可能な参照の例
Klenow	試薬	Promega Corp.
YM-30 カラム	試薬	EMD Millipore
Cot-1 DNA	Reagent	Invitrogen
DIG Easy	Reagent	Roche Group
Sheared Herring Sperm DNA	Reagent	Promega Corp.
カバースリップ	試薬	Fisher Scientific		22mm x 60mm
Hybridization Cassette	Tool	Telechem