1.6: 組み換え食品の遺伝子検査

1. 食品サンプルからの DNA の抽出

1. 200 1,000 μ L のボリューム調節可能なマイクロ ピペット、ピペットを使ったり 2 スクリュー キャップ チューブのそれぞれに購入した PCR ミックス行列の 500 μ L を追加します。PCR マトリックスを均等にミックスする各因数のピペットで、上下のピペットします。
2. 1 つのスクリュー キャップ チューブ「非遺伝子組み換え」と「テスト」ラベルを付けます。
3. 認定の非遺伝子組み換え食品の 0.5 g を量り、乳鉢に入れてください。
4. 2.5 mL の蒸留水を加えて、スラリーを形成する 2 分乳棒で粉をひきます。
5. もう一つの 2.5 mL の蒸留水を追加し、杵スラリーはピペットに十分に滑らかになるまで研削を続けます。
6. ピペット 50 μ L を 500 μ L の PCR プレミックスを含むスクリュー キャップ チューブ地面スラリーのラベル「非遺伝子組み換え」卒業のピペットで 50 μ L のマークを使用。チューブを要約します。
7. 1.3-1.6 食品試料を準備する手順を繰り返します。
8. ピペット 50 μ L スクリュー キャップ チューブに地上テスト食品スラリーの「テスト」というラベルの付いた。チューブを要約します。
9. 渦非遺伝子組み換え食品、検査食の PCR は 95 ° C の水浴 5 分で 1 分と場所管用チューブします。渦が利用できない場合は、チューブに水浴に配置する前に混合する数回をフリックします。
10. 5 分間、遠心分離機でチューブを配置します。固体ペレットは、管の下部に形成する必要があります。場合は 5 分、ペレット フォームまで 2 分間隔、再び遠心分離後は、ペレットは形成されていません。
11. チューブは、PCR のためすぐに使用または 1 週間冷蔵庫で保存できます。

2。 PCR の反作用の設定

1. PCR チューブ 1-6 の番号し、それらの初期します。数字は、表 1に記載されている以下のチューブ内容に対応する必要があります。
2. オープン キャップ付きマイクロ チューブ ホルダーでラベル付けされた各 PCR チューブを配置します。
3. 新鮮なヒントを使用すると、追加するたびに、各 PCR チューブに表 1に示されているプライマーの 20 μ L を追加します。チューブをキャップします。
4. 新鮮なヒントを使用すると、各チューブのため、各 PCR の管、ピペットの上澄みからのみしている、管の下部に固体ペレットを回避するのに、表 1に示されている DNA のサンプルの 20 μ L を追加します。
5. 各 DNA のサンプルは、対応する PCR チューブに戻は後、は、上下に軽くピペッティングによる DNA とプライマーを混合するピペットを使用してください。チューブを要約します。
6. サーマルサイクラー内 PCR チューブに置きのサーマルサイクラーをプログラムします。
   1 : 初期変性94 ° c 2 分サイクルします。
   94 ° c 1 分増幅: 40 サイクル (変性)、59 ° C (焼鈍) 1 分と 2 分 (拡張子) のための 72 ° C。
   最終的な拡張: 72 ° C、10 分で 1周します。
   保持: 4 ° C 無期限に。

3. 3% の Agarose のゲルの準備

1. ラボやマスキング テープ、ゲル トレイの開いた端部をしっかりとテープを使用します。テープは溶融 agarose の漏れを防ぐためにトレイの端にシールを確認します。
2. 3 g 以上の 250 mL の三角フラスコに agarose の重量を量り。
3. 100 mL の 1 の x TAE のバッファー (購入または濃縮物から調製した) を追加します。
4. 磁気のホット プレートを使用すると、攪拌棒、ビーカー アガロースをバッファー、およびソリューションに完全に溶解するまで熱が沸騰とが明確になります。また、オーブンにビーカーを置き、すべて 10 s、混合物を沸騰するまで繰り返しと明確なターンを混ぜて攪拌棒を使用して 30 秒間隔のための加熱は電子レンジを使用できます。
5. アガロース溶液の蒸発を防ぐ、還流として 250 mL フラスコの開口部に 50 mL 三角フラスコを反転します。
6. 60 ° C に冷却するアガロース溶液を許可し、各録音されたゲル トレイに 30-50 mL を注ぐ。
7. ゲルの井戸を作成するノッチの最初のペアにゲル櫛を配置します。
8. テープと櫛を削除する前に完全に冷却するゲルを許可します。ゲルが固めるし、クリアから曇りのときに準備ができて、約 10-20 分。

4 PCR 産物の電気泳動

1. ゲル トレイの上にあらかじめ用意された 3% の agarose のゲルを置くか注がれた 3% の agarose のゲルをキャストに使用されているゲル トレイを使用します。
2. 陰極 (ブラック) 末尾に近い井戸を用いた電気泳動室にゲル トレイをスライドさせます。
3. 商工会議所、十分なゲル トレイの上部バッファーの 2 ミリメートルを持っていることに 1 x TAE バッファーを注ぐ。
4. PCR チューブをサーマルサイクラーとマイクロ チューブ ホルダーの場所から取得します。
5. 毎回新鮮なピペット チップを使用して、購入したオレンジ g ローディングの染料 (LD) 各サンプルに 10 μ L を加え、よく混ぜます。
6. 分子量ルーラーの負荷 20 μ l と順序でゲルに各サンプルの 20 μ L (表 2) を示します。
7. 100 V で 30 分のゲルの電気泳動を実行します。
8. トレイから削除する商工会議所とスライドのゲルからゲル トレイを取り外します。染色トレイにジェルを塗布します。
9. ご購入の DNA ゲル染色ゲル全体に染色を配布するためのトレイを慎重に揺れ、5 分間でゲルを浸します。
10. 洗浄容器にゲルを転送し、リンス水道水 (40-55 ° C) 約 10 秒。
11. 最良の結果のための穏やかな揺れで 6 分間温かい水道水で 3 倍を洗浄することによりすすぐ。必要に応じて、目的のコントラストに到達するまで、暖かい水で染め色を続行します。

表 1。適切な管数やプライマー、DNA のサンプルの一覧です。

表 2。20 μ L の分子量定規と各サンプルの 20 μ L をゲルに読み込むに適切な順序。

遺伝子組み換え食品とは、DNAが特別に改変された成分を含む製品です。これらの修飾の存在は、ポリメラーゼ連鎖反応と呼ばれる技術を使用して検出できます。

食品の遺伝子組み換えは、健康と環境の安全性に関する懸念が議論されているため、物議を醸す問題となっています。関心のある食品サンプルから遺伝子組み換えDNAを検出する能力により、遺伝子組み換え生物(GMO)を食品供給に使用することの安全性と潜在的な危険性について、知識に基づいた意思決定が可能になります。

ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、食品DNAを増幅して、遺伝子組み換え配列の有無を判断するために使用されます。次に、ゲル電気泳動により、増幅されたDNAをアガロースゲルマトリックスに引き込み、修飾マーカーまたは非修飾マーカーに対応する異なるサイズのDNAバンドを分離します。次に、これらは、GMOが含まれていることが知られている、または改変されていないことが知られている食品のコントロールバンドと比較されます。

このビデオでは、食品サンプルから遺伝子組み換えDNAを検出する原理、遺伝子組み換えプロセスで使用されるDNAを抽出してマーカーを増幅する方法、および食品サンプル中のGMOの有無を確立する方法について説明します。

ポリメラーゼ連鎖反応は、遺伝子組み換え食品に挿入されたDNAの配列を特定します。DNAは比較的安定な分子であるため、コーンチップスや野菜ハンバーガーなどの高度に加工された製品からでも、増幅に適した生存可能なDNA断片を単離することができます。 挿入された遺伝子の発現を制御するために少数の調節DNA配列が使用されるため、これらの配列はGM作物の大部分に存在します。この手順では、最も一般的に使用される2つ、35Sプロモーター遺伝子とノパリンシンターゼターミネーター遺伝子を特定します。35S配列は強力なプロモーターであり、挿入された遺伝子に付着すると、一定で高レベルの発現を促進します。ノパリン合成酵素ターミネーターは、所望の終点で挿入された遺伝子の転写を止めるために含まれる。

PCRは、PCR反応チューブの温度を厳密に制御するマシンであるサーマルサイクラーで加熱と冷却を繰り返すサイクルを伴います。サンプルを94に加熱しますか?CはDNA鎖を変性させ、分離させます。45から65の間への急速冷却?Cは、プライマーが分離されたDNA鎖にアニールすることを可能にします。最後に、72に再加熱しますか?Cにより、Taqポリメラーゼ酵素はプライマーを伸ばし、標的領域を完全に複製することができます。

購入した植物プライマーを各サンプルに添加し、植物DNAを含むサンプルで増幅します。35SおよびNOS用のGMOポジティブテンプレートは、GMOのポジティブコントロールを提供するために使用されます。認定された非GMOは、ネガティブコントロールとして使用されます。これらの制御反応のいずれかが予期しないバンドを示している場合、テストサンプルの結果は信頼できません。

増幅されたDNAは、電気泳動によってアガロースゲルを通過します。PCR産物を色素と混合し、ウェルにロードします。DNAは負に帯電しており、チャンバのカソード端でゲルにロードされると、電流が印加されるとアノード端に向かって移動します。大きなDNA断片はゲルマトリックス中を簡単に移動できないため、カソードの近くに留まり、小さな配列はアノード末端に向かって移動するため、異なるサイズのDNAが明確なバンドに分離されます。

電気泳動後、ゲル染色は分離したDNAバンドの可視化に役立ちます。

GMO検出の背後にある原理と、GMO同定のためのPCRおよび電気泳動の使用について理解したところで、これを実験室でどのように実行できるかを見てみましょう。

関心のある食品が特定されたら、分析を開始できます。DNAを抽出するには、2本のきれいなスクリューキャップチューブを取り、これらのそれぞれに500?購入したDNA単離試薬のL、試薬を均一に混合するために、アリコート間で混合物を上下にピペットで移動させるようにしてください。チューブの1つに「non-GMO」とラベルを付け、もう1つに「Test」とラベルを付けます。

次に、0.5gの認定非GMO食品を計量し、きれいな乳鉢に入れます。蒸留水2.5mLを加え、乳棒で2分間挽いてスラリー状にします。さらに2.5 mLの蒸留水を加え、ピペットで動かすのに十分なほど滑らかになるまでスラリーを粉砕し続けます。

ピペット50 ?既知の非GMOスラリーのLをDNA単離試薬を含む「non-GMO」標識スクリューキャップチューブに。次に50を追加しますか?「テスト」とマークされたスクリューキャップチューブへのテスト食品サンプルスラリーのL。食品サンプルとDNA試薬が入った2本のチューブを1分間ボルテックスします。次に、チューブを95°Cのウォーターバスに入れます。Cで5分間最後に、チューブを遠心分離機に5分間入れます。検査の結果、チューブの底に固体ペレットが形成されます。5分経ってもペレットが形成されない場合は、ペレットが形成されるまで2分間隔で再度遠心分離します。サンプルは、すぐにPCRに使用したり、冷蔵庫で最大1週間保存したりできるようになりました。

まず、6本目のPCRチューブです。これらの番号は、表に記載されているチューブの内容物に対応します。標識された各PCRチューブを、キャップを開けた状態でマイクロチューブホルダーに入れます。

追加ごとに新しいヒントを使用して、20 ?表に示されているLプライマーを各PCRチューブに使用します。次に、20 ?表に示されているDNAサンプルのLを各PCRチューブに送る。ピペットを上下に動かして混ぜます。ペレット状のサンプルの場合は、上清からのみピペットで移動し、チューブの底にある固体ペレットを避けてください。最後に、PCRチューブをサーマルサイクラーにセットし、表に示されている加熱および冷却ステップを繰り返すようにプログラムします。

3%アガロースゲルを電気泳動チャンバーに入れ、ウェルをカソード端に近づけます。TAEバッファーをチャンバーに追加して、ゲルトレイの2 mm上に覆います。サーモサイクラーからPCRチューブを回収し、マイクロチューブホルダーに入れます。毎回新しいピペットチップを使用して、10 ?購入したDNAのLを各サンプルにローディング色素をローディングし、よく混ぜ合わせます。

毎回新しいチップを使用して、アガロースゲルのウェルに20 ?分子量定規のLを1つのウェルに入れ、20?この表に示すように、各サンプルのLを後続のウェルに入れます。電気泳動チャンバーを100Vで30分間運転するように設定します。

ゲルの泳動が終了したら、ゲルチャンバーのプラグを慎重に抜き、トレイを取り外し、ゲルを染色トレイにスライドさせます。購入した100倍ゲル染色剤にゲルを5分間浸漬し、トレイを静かに振って染色液を分散させます。染色したら、ゲルを洗浄容器に移し、水道水で約10秒間すすぎます。温かい水道水で3回ずつ3分間洗って汚れを落とし、それぞれを穏やかに振ると最良の結果が得られます。必要に応じて、希望のコントラストに達するまで温水で脱染を続けます。

レーン4に200bpのバンドが存在するかどうかは、テスト食品にGMOが含まれているかどうかを示します。植物プライマーは、サンプルから植物DNAが正常に抽出されたかどうかを判断します。非GMO食品管理は、偽陽性の結果が発生した場合の指標です。非GMO食品管理が陽性と出た場合、それはPCRがどこかの時点で汚染されていたことを意味します。GMO陽性テンプレートコントロールは、偽陰性の指標です。GMO陽性テンプレートコントロールが増幅しない場合、PCR反応に問題があり、試験食品からのGMO陰性結果は信頼できません。

ゲルを白または黄色の紙の上に置いて、DNAバンドを強調する対照的な背景を提供するか、UVライトボックスを使用してコントラストを高めることができます。

遺伝子組み換え成分について食品や製品を試験する能力は、多くの科学的または規制上のアプリケーションに関連しています。

遺伝子組み換え作物からのトランスジェニックDNAが野生作物集団のゲノムに侵入する可能性があるという証拠がいくつかあります。例えば、花粉媒介者は、遺伝子組み換え源からの花粉で野生型植物を受精させることにより、この移動を促進することができる。これらの挿入された遺伝子の拡散が生態系全体に与える影響は十分に理解されていないため、これは懸念事項です。野生個体群のPCR検査は、遺伝子インサートの潜在的な拡散または成功した封じ込めに関するデータを提供することができます。

遺伝子組み換え成分の表示の欠如、または誤った表示は、消費者の懸念事項になる可能性があります。これは、消費者の消費の好み、またはGMプロセス中にアレルゲンが導入される可能性があるためですが、後者については議論の余地があります。一部の国では、遺伝子組み換え成分を食品包装に記載することが義務付けられています。そのような国の規制当局は、食品表示の正確性を確認するためにPCR検査を使用する場合があります。

作物に導入された遺伝子組み換えが農薬耐性を付与する場合、いくつかの研究では「スーパー雑草」の生成について懸念が提起されています。基本的に、これらは、侵入や交配などのメカニズムを通じて農薬に対する耐性を獲得する、最初は改変の対象とされていない任意の植物であり得る。これらの植物は、インサートのない植物よりもうまく広がることができ、制御が難しくなる可能性があります。遺伝子組み換えのためのPCR検査は、このような潜在的な集団を浮き彫りにし、追跡し、この広がりが問題となるかどうかを判断するのに役立ちます。

JoVEの遺伝子組み換え食品のテストの紹介をご覧になりました。PCRを使用して遺伝子組み換え食品を同定する原理、食品からDNAを抽出して増幅する方法、食品サンプルが遺伝子組み換えされているかどうかを判断する方法を理解する必要があります。ご覧いただきありがとうございます!