Name: 後肢虚血の治療のための胚性幹細胞由来血管内皮細胞 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-23T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 学ぶ 後肢虚血治療における胚性幹細胞由来血管内皮細胞の移植と生体発光イメージングによる追跡法。末梢動脈疾患治療への応用可能性を評価する実験手法です。

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著者はアンドレアアクステル聡伊藤、MD、ジェフVelotta、MD、グラントホイト、ロバートC.ロビンス、MD、金玉、M​​D、ティムドイル博士、および技術支援のためのスタンフォード大学小動物のイメージングコアを感謝。また、作者は獣医機器のサポートのためにAMビックフォード社に感謝。この研究は国立衛生研究所（R01 HL - 75774、R01 CA098303、R21 HL085743、1K12 HL087746）、カリフォルニア大学のカリフォルニア州のたばこ関連病研究プログラム（15IT - 0257と1514RT - 0169）からの研究補助金によって支えられて、および再生医療（RS1 - 00183）のためのカリフォルニア工科大学。 NHは、アメリカ心臓協会からのフェローシップでサポートされています。心臓協会ができます。

1。内皮細胞へのマウスES細胞の分化<ol><li>内皮細胞にES細胞を区別するためのプロトコルは別の場所で記述し、このプロトコル2,3の焦点ではありません。簡単に言えば、細胞は区別するために許可され、そしてそのようなCD31または血管内皮カドヘリン（VE -カドヘリン）のような内皮細胞マーカー陽性の細胞は、蛍光活性化細胞選別（FACS）によって精製されています。 </li></ol> 2。ダブル融合レポーター遺伝子とレンチウイルス形質導入の建設<ol><li>生物発光は、ホタルルシフェラーゼ（変動を確認）などのレポーター遺伝子を発現するように変更されている細胞を追跡するために使用することができます。このアプリケーションでは、我々の細胞は内部のユビキチンプロモーターの制御下に両方の変動を確認し、強化された緑色蛍光タンパク質（EGFP）融合遺伝子が含まれています。セルを変更するために、バイオセーフティ基準と同様に増加した形質導入効率を達成するために重要な最適化された遺伝的要素を含むトランスジーンレンチウイルスベクターは、変動を確認- EGFP融合レポーター遺伝子を運ぶ私たちの研究室で開発PFU - FGのベクトルが安定するために使用することができます。分化後の細胞を伝達する。この融合構築物は、移植細胞の生物発光と蛍光の追跡の両方が有効になります。レポーター遺伝子を発現する標識された細胞のウイルス粒子、伝達し、生産を生成するための手順は、他の4説明されています。 </li></ol> 3。虚血後肢にESC -由来の内皮細胞の移植<ol><li>細胞移植のための後肢虚血を受けているマウスを用意することで手順を開始します。これを行うには、1L/minの流量で100％酸素でイソフルラン1〜3％を含む麻酔導入チャンバーにマウスを置きます。 </li><li>それは外的刺激に反応しなくなるまで誘導チャンバ内でマウスを残す。その後、誘導室から動物を削除します。 </li><li>その後、手術台の上に仰臥位に動物を配置し、1L/minの流量で100％酸素でイソフルラン1〜3％連続流に接続してください。 </li><li> three交互betadineとアルコールスクラブと後肢の皮膚を拭いてください。 </li><li>肌がきれいにされると、（PBS）リン酸緩衝生理食塩水の30μLを、100万ESC -由来の内皮細胞を得る。 28ゲージの針に、これらの細胞をロードする。 </li><li>細胞の準備が整うと、静かに持ち上げて、より良い腓腹筋の場所を視覚化するために後肢を拡張。足が拡張されている間、基本的な筋肉に皮膚を通して針を挿入する。骨に接近しないように注意してください。静かにゆっくりと腓腹筋に30μLの細胞混合物を注入する。筋肉内注射の場合、30μLの注入可能な量の限界に近いです。我々の経験で、彼らは注射針での損失量を排除する、それ故、28ゲージのインスリン注射が好ましい。 </li><li>注入が完了すると、回復のケージにマウスを返し、目を覚ましになるまで継続的に監視する。動物は、数時間で回復し、移植細胞のin vivo生物発光イメージングを続行することができます。 </li></ol> 4。 in vivoでのESC -由来の内皮細胞の生物発光イメージング<ol><li>移植ESC由来endothelials細胞は内部のユビキチンプロモーターの制御下で変動を確認し、EGFPの融合遺伝子の両方を発現するように変更されました。従って、生物発光は、虚血後肢内の細胞を追跡するために使用することができます。 </li><li>このステップを開始するには、生物発光イメージングシステムとリビングの画像取得ソフトウエアをオンにします。その後、収集システムを初期化し、視野の大きさを指定します。 </li><li>背景放射を吸収するために、イメージングボックスの上に横に、場所黒のマット紙。 </li><li>イメージングボックスの準備が整ったら、1L/minの出力で酸素のイソフルラン1〜3％を含む麻酔導入チャンバーにマウスを置きます。それは外的刺激に反応しなくなるまで誘導チャンバ内でマウスを残す。その後、誘導室から動物を削除します。 </li><li>必要に応じて電気カミソリを使用して、両方の後肢から毛を取り除く。 </li><li>腹膜に体重1g当たり、D -ルシフェリンの10μLを注入する。 D -ルシフェリンをPBS中の15 mg / mLのフィルタリングストック溶液に予め用意されています。 </li><li>ルシフェリンが注入されると、イソフルランの連続的な流れに接続して仰臥位で、黒い紙、上の画像ボックスに動物を配置。 </li><li>イメージングボックスに動物を配置し、イソフルランに接続する。 </li><li>画像が飽和されていない最適な露光時間を決定するために、10〜60秒のために画像を取得するために始める。画像が飽和状態になった場合、露光時間を減らす。生物発光シグナルは非常に弱い場合は、露出時間を増やします。 </li><li> Usinグラム最適な露光時間は、信号が最大としてフェードに達するまで毎に1-3分の画像を取得し続けます。買収が完了したら、ファイルを保存します。 </li><li>データを分析するために、注射部位をカバーする観測領域（ROI）を選択します。ネガティブコントロールとして、同様のROIは、非手術足のために選択することができます。ソフトウェアを使用して、各時点に対してROIのための光子/秒/ cm 2で /ステラジアン（P / S / cm 2で / SR）の単位で表現されている合計の輝きを、測定する。最大値は、最終的なデータで使用する必要があります。データはまた、将来の使用のためのExcelスプレッドシートにエクスポートすることができます。 </li><li>一度すべてのデータが取得されている、回復のケージに動物を戻すと、動物の目を覚ましまで継続的に監視する。 </li><li>時間をかけて細胞を追跡するために、この手順を繰り返します。 </li><li>希望する時点で、動物は、組織機能の評価のために安楽死することができます。 </li></ol> 5。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/old/1034_2009_1_22_4/figure 1.png" alt="図1" width="600" height="600" />左の虚血後肢における移植細胞の代表的な生物発光画像を図1に示されています。生物発光の買収時には、強度は時間とともに増加し、時間の経過中に得られた最大値を最終値として報告されるべきである。

<ol><li>Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Murine model of hindlimb ischemia.</a> JoVE. , (2008).</li>
<li>Levenberg, S., Golub, J. S., Amit, M., Itsakovitz-Eldor, J., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells derived from human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 4391-4396 (2002).</li>
<li>Yamashita, J., Itoh, H., Hirashima, M., Ogawa, M., Nishikawa, S., Yurugi, T., Naito, M., Nakao, K., Nishikawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flk1-positive+cells+derived+from+embryonic+stem+cells+serve+as+vascular+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Flk1-positive cells derived from embryonic stem cells serve as vascular progenitors.</a> Nature. 408, 926-926 (2000).</li>
<li>De, A., Yaghoubi, S. S., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+lentiviral+vectors+in+noninvasive+molecular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Applications of lentiviral vectors in noninvasive molecular imaging.</a> Methods Mol Biol. 433, 177-202 (2008).</li>
<li>Niiyama, H., Kai, H., Yamamoto, T., Shimada, T., Sasaki, K., Murohara, T., Egashira, K., Imaizumi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+endogenous+monocyte+chemoattractant+protein-1+in+ischemia-induced+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Roles of endogenous monocyte chemoattractant protein-1 in ischemia-induced neovascularization.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 44, 661-666 (2004).</li>
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<li>Ray, P., De, A., Min, J. J., Tsien, R. Y., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tri-fusion+multimodality+reporter+gene+expression+in+living+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects.</a> Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).</li>
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<li>Cao, F., Lin, S., Xie, X., Ray, P., Patel, M., Zhang, X., Drukker, M., Dylla, S. J., Connolly, A. J., Chen, X., Weissman, I. L., Gambhir, S. S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+visualization+of+embryonic+stem+cell+survival%2C+proliferation%2C+and+migration+after+cardiac+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery.</a> Circulation. 113, 1005-1114 (2006).</li>
<li>Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+bioluminescence+reporter+gene+imaging+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo bioluminescence reporter gene imaging of human embryonic stem cells.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

ESCは、ために分化し、血管内皮細胞を含むすべての3つの胚芽層を、前記の細胞系譜を生じさせる能力の彼らの可塑性の組織の虚血の治療において有望な細胞源です。 ES細胞に関連する倫​​理的な問題を克服するために、誘導多能性幹細胞（性IPSC）倫理的な問題を克服する代替の多能性幹細胞の源とすることができる。 ESCのほかに、そのような内皮前駆細胞（EPC）と造血幹細胞（HSC）のような成体幹細胞を使用することもできますが、これらの細胞型は、PAD患者で治療効果を制限している可能性があります。細胞の筋肉内送達は、低侵襲と実行が容易であり、配信のこのモードは、可溶性因子またはプラスミドの配信に適している。しかし、大腿動脈または尾静脈に血管系、全身送達に移植された細胞のアクセスを容易にするために筋肉内注射の代わりに使用することができます。 生物発光イメージングは​​、細胞の生存率の高スループットと非侵襲的な追跡を行うことの利点を提供しています。このようなレーザードップラー血流や血管新生の組織学的分析としての機能アッセイと組み合わせることで、一緒にこれらの技術は、研究者は後肢虚血の回復に細胞移植の治療効果を評価できるようにすることができます。 結論として、我々は...

<table><tbody><tr><td>手術器具</td><td>器具</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>注射針</td><td>器具</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>28G インスリン注射器が推奨される</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-ルシフェリン</td><td>試薬</td><td>Biosynth International, Inc</td><td></td><td>D-ルシフェリンをあらかじめ PBS 中 15 mg/mL のろ過済みストック溶液として調製しておく</td></tr><tr><td>IVIS 200 生物発光イメージングシステムおよび解析ソフトウェア</td><td>装置</td><td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/IVIS%20Series" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Xenogen Corporation</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

後肢虚血の治療のための胚性幹細胞由来血管内皮細胞

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

脚と足に酸素化血液と栄養分を供給する末梢動脈の狭窄から末梢動脈疾患（PAD）の結果は、この病理は、このような間欠性跛行（歩くと痛み）、痛みを伴う虚血性潰瘍、あるいは四肢を脅かす壊疽などの症状を引き起こします。これは、一般的に血管内皮、すべての血液やリンパ管の管腔表面を投資する内皮細胞の単層は、血管の恒常性と血管再生で主要な役割を果たしていると考えられている。その結果、内皮細胞の幹細胞ベースの再生には、PADを治療するための有望なアプローチがあります。 このビデオでは、我々は胚性幹細胞（ESC）由来の生物発光イメージングによるホーミング細胞と生存の非侵襲的な追跡が続くPADのモデルとして一方的hindimbの虚血の治療のための内皮細胞の移植を示しています。細胞送達およびイメージングのための特定の材料および手順について説明する。このプロトコルは、新山らによる後肢虚血の誘導を記述する別のパブリケーションに従います。1

胚性幹細胞の配信のための外科的処置は、虚血後肢への細胞由来の内皮細胞は、生物発光イメージングによる非侵襲的な追跡と、示されている。

末梢動脈疾患（PAD）は、脚や足に酸素供給血および栄養素を供給する末梢動脈の狭窄によって引き起こされます。これは...

末梢動脈疾患。PADは、脚および足に血液と酸素を供給する末梢動脈の狭窄により生じ、血管機能不全を引き起こします。幹細胞がPADの治療に使用可能かどうかを判断するため、虚血を誘導した後、胚性幹細胞由来の血管内皮細胞を後肢に注入します。これらの細胞はホタルルシフェラーゼを発現するように改変されているため、生体発光イメージングによって追跡することができ、それらが損傷部位に集積し、治療効果を持つかどうかを判定することが可能です。こんにちは、ジョン・クックです。スタンフォード大学心血管医学部門の医学教授を務めています。当研究室では、血管新生と血管再生に関心を持っています。このビデオでは、博士研究員であるNan Wong博士とHir Niyama博士が、後肢虚血における治療的細胞移植の手順と、細胞生存の非侵襲的イメージングについて紹介します。これらの手順には、片側後肢虚血の治療に向けた胚性幹細胞およびstereo細胞の投与、およびバイルミネッセンスイメージングによる細胞ホーミングと生存の非侵襲的追跡が含まれます。それでは始めていきましょう。まず、細胞移植を行うために、後肢虚血処置を施した8ヶ月齢のSV129系統マウスを準備します。マウスを、100%酸素中に1～3%のイソフルランを含ませ、流量1 L/minで設定した麻酔導入チャンバーに入れます。マウスが外部刺激に反応しなくなるまで、導入チャンバー内に保持します。その後、動物を導入チャンバーから取り出します。次に、動物を手術台の上に仰向けに配置し、100% Oxygenを1 L/minの流量で流しながら、1〜3% ISOを連続投与します。後肢の皮膚を、ベタジンとアルコールを用いて交互に3回拭き取ります。皮膚の洗浄後、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）30 µLに懸濁した100万個のマウス胚性幹細胞由来血管内皮細胞を用意します。これらの細胞を28Gの針に充填します。細胞の準備ができたら、後肢をゆっくりと持ち上げて伸ばし、腓腹筋の位置を確認しやすくします。脚を伸ばしたまま、皮膚を通して下層の筋肉に針を刺します。骨に触れないよう注意しながら、30 µLの細胞混合液を腓腹筋にゆっくりと緩徐に注入してください。筋肉内注射において、30 µLは注入可能な液量の限界に近いです。そのため、我々の経験から、注射針内での液量損失を防ぐことができる28ゲージのインスリン用注射器が推奨されます。注射完了後、マウスを回復用ケージに戻してください。動物を数時間回復させた後、移植細胞のin vivo生物発光イメージングを行います。移植したESC由来血管内皮細胞は、内部ユビキチンプロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼ遺伝子と強化緑色蛍光タンパク質融合遺伝子の両方を発現するように改変されています。したがって、生物発光を用いて虚血後肢内の細胞を追跡することが可能です。このステップを開始するために、生物発光イメージングシステムと生体イメージ取得ソフトウェアを起動します。次に、取得システムを初期化します。その後、視野の寸法を指定してください。次に、背景放射を吸収させるため、イメージングボックスに黒色のマット紙を敷きます。イメージングボックスの準備が整ったら、1 L/minの流量で酸素に1〜3%のイソフルランを混合した麻酔導入チャンバーにマウスを入れます。マウスが外部刺激に反応しなくなるまで、導入チャンバー内に留めておきます。その後、動物を導入チャンバーから取り出します。体重1gあたり10 µLのルシフェリンを腹腔内に注射します。ルシフェリンは、PBSを用いて15 mg/mLのろ過済みストック溶液としてあらかじめ調製しておきます。ルシフェラーゼを注入した後、動物を仰向けにし、イソフルランの持続的なフローに接続した状態で、イメージングボックス内の黒い紙の上に置きます。画像が飽和しない最適な露光時間を決定するため、10〜60秒間画像を収集します。画像が飽和した場合は、露光時間を短縮してください。生物発光信号が非常に弱い場合は、露光時間を延長してください。最適な露光時間を用いて、信号が最大に達し、その後減衰するまで、1〜3分おきに画像取得を継続します。各取得が完了した後、データ解析のためにファイルを保存し、陰性対照として注入部位をカバーする関心領域（ROI）を選択します。非手術側の脚に対しても、同様のROIを選択できます。ソフトウェアを使用して、各ファイルの同じROIにおける全放射輝度を測定します。最終的なデータには最大値を使用してください。データは、後の解析のためにExcelスプレッドシートにエクスポートすることも可能です。すべてのデータの取得が完了したら、動物を回復ケージに戻し、覚醒するまで観察してください。細胞を追跡するために、この手順を繰り返します。任意の時点で、組織機能の評価のために動物を安楽死させることができます。ここでは、細胞注入から1日後の左虚血後肢における移植細胞の代表的な生物発光イメージングのタイムコースを示しています。赤色の円で囲まれた部分は、細胞が導入された関心領域（ROI）です。色は移植細胞数と相関しており、青色や緑色と比較して、赤色や黄色は生物発光強度がより強いことを示しています。ご覧の通り、対照肢にはバイオルミネッセンスは見られませんが、細胞を注入した肢では、バイオルミネッセンスの取得中に強いバイオルミネッセンスが認められます。本図において、ROI内のバイオルミネッセンス信号は時間とともに増加して最大値に達し、その後減少します。最大輝度によって測定されたバイオルミネッセンスの最大値は、取得開始から27分後に得られます。データ解析には、この最大値を報告する必要があります。ここまで、後肢虚血の治療におけるESC由来細胞の連続投与および追跡方法について説明しました。この手順に先立つ後肢虚血の誘発方法については、ERらによる別のJoVEビデオで実演されています。この手順を行う際は、細胞の皮下漏出を防ぐため、PBSに懸濁して注入する細胞液量を最大30 µLに制限することが重要です。また、バイオルミネッセンス画像を取得する際は、露光時間を長くしすぎて画像強度が飽和しないようにしてください。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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後肢虚血の治療のための胚性幹細胞由来血管内皮細胞

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