固相合成

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1. 樹脂の読み込み

100 mL ペプチド合成容器 2 chlorotrityl 塩化 (CTC) 樹脂 (1.1 ミリモル/g、0.360 g、0.400 mmol) を追加します。N の下で 30 分間、膨張するようにし、20 mL DMF 追加_2.
真空下でビーズをドレインし、10 mL の DMF を追加します。
500 mg fmoc 保護翼 OH を追加 (1.60 m モル) と 2.5 mL i -Pr₂エタネルセプトと N₂ 15 分のミックス。
真空下で溶媒をドレインし、15 分間 fmoc 保護翼ああで読み込みを繰り返します。
真空下で溶媒をドレインし 10 ml DMFunder N₂ビーズを洗浄し、真空 3 下でドレイン x。

2. 難病 fmoc 保護グループ

DMF で 10 mL 20 %4 methylpiperidine を追加して 15 分間 N₂の下でビーズをかき混ぜます。
真空下で溶媒をドレインし、難病を繰り返します。
3、真空下で N₂ドレイン下 10 mL DMF でビーズを洗う x。

3. カイザーテストを実行します。

カイザーテストを実行 1-2 滴の溶液 (0.5 mL 0.01 M KCN、24.5 mL ピリジン)、ソリューション B を追加 (1 g ニンヒドリン、20 mL のn-ブタノール)、およびソリューション C (20 g のフェノール、10 mL のn-ブタノール) 2 つの試験管にそれぞれ。他は反応を監視しながら、1 つのテストチューブはコントロールになります。
反応試験管と 110 ° c. に 2 つの試験管を加熱する反応容器から樹脂のいくつかのビーズを追加します。
難病が完了すると、試験管の内容は濃い青/紫の色になります。難病が不完全または障害が発生した、ソリューションが黄色のままになります。コントロールテストチューブと反応テストチューブを比較します。

4. 次のビルディングブロックの結合

真空下で溶媒をドレインします。
10 mL のNとビーズを洗う-メチル-2-ピロリドン N₂真空下で溶媒を下水管の下。
次の結合を開始する追加 10 mL NMP、620 mgFmoc Phe-オハイオ州 (1.6 モル)、610 mg HBTU (1.6 モル) と 2.5 mLi -Pr₂エタネルセプト、バブルの N₂ 30 分の下に樹脂ができ。
真空下で溶媒をドレインします。
3、真空下で N₂ドレイン下 10 mL DMF でビーズを洗う x。
カイザーを実行 (手順 3.1 3.3 参照) をテストカップリングの完成を見る。ビーズや試験管でのソリューションは、黄色いはずです。

5. 樹脂をペプチドの切断

2.1 2.3 の手順を使用して残りの fmoc 保護グループを切断します。
真空下で溶媒を排出後は、ガレージと 3 h の N₂バブル 40 mL 胸の谷間ソリューション (95 %tfa、2.5% H₂O、2.5% のヒント) を追加します。
ペプチド合成装置に新しい受信フラスコを置き、新しいフラスコに真空下で目的のペプチドを含む theTFA 溶液を排水します。

6. 沈殿物とペプチドの solation

4 円錐バイアルに TFA 溶液を分離し、ペプチドを沈殿させる各バイアルに 25 mL の冷たいエーテル (− 20 ° C) を追加します。
遠心分離機のバイアル (3,000 rpm、0-4 ° C) 20 分の円錐形の瓶から残りの TFA とエーテルの溶液を捨て、白色固体として必要なジペプチドを余裕にペプチド沈殿物に集中します。

Overview

Procedure

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 樹脂の読み込み

100 mL ペプチド合成容器 2 chlorotrityl 塩化 (CTC) 樹脂 (1.1 ミリモル/g、0.360 g、0.400 mmol) を追加します。N の下で 30 分間、膨張するようにし、20 mL DMF 追加_2.
真空下でビーズをドレインし、10 mL の DMF を追加します。
500 mg fmoc 保護翼 OH を追加 (1.60 m モル) と 2.5 mL i -Pr₂エタネルセプトと N₂ 15 分のミックス。
真空下で溶媒をドレインし、15 分間 fmoc 保護翼ああで読み込みを繰り返します。
真空下で溶媒をドレインし 10 ml DMFunder N₂ビーズを洗浄し、真空 3 下でドレイン x。

2. 難病 fmoc 保護グループ

DMF で 10 mL 20 %4 methylpiperidine を追加して 15 分間 N₂の下でビーズをかき混ぜます。
真空下で溶媒をドレインし、難病を繰り返します。
3、真空下で N₂ドレイン下 10 mL DMF でビーズを洗う x。

3. カイザーテストを実行します。

カイザーテストを実行 1-2 滴の溶液 (0.5 mL 0.01 M KCN、24.5 mL ピリジン)、ソリューション B を追加 (1 g ニンヒドリン、20 mL のn-ブタノール)、およびソリューション C (20 g のフェノール、10 mL のn-ブタノール) 2 つの試験管にそれぞれ。他は反応を監視しながら、1 つのテストチューブはコントロールになります。
反応試験管と 110 ° c. に 2 つの試験管を加熱する反応容器から樹脂のいくつかのビーズを追加します。
難病が完了すると、試験管の内容は濃い青/紫の色になります。難病が不完全または障害が発生した、ソリューションが黄色のままになります。コントロールテストチューブと反応テストチューブを比較します。

4. 次のビルディングブロックの結合

真空下で溶媒をドレインします。
10 mL のNとビーズを洗う-メチル-2-ピロリドン N₂真空下で溶媒を下水管の下。
次の結合を開始する追加 10 mL NMP、620 mgFmoc Phe-オハイオ州 (1.6 モル)、610 mg HBTU (1.6 モル) と 2.5 mLi -Pr₂エタネルセプト、バブルの N₂ 30 分の下に樹脂ができ。
真空下で溶媒をドレインします。
3、真空下で N₂ドレイン下 10 mL DMF でビーズを洗う x。
カイザーを実行 (手順 3.1 3.3 参照) をテストカップリングの完成を見る。ビーズや試験管でのソリューションは、黄色いはずです。

5. 樹脂をペプチドの切断

2.1 2.3 の手順を使用して残りの fmoc 保護グループを切断します。
真空下で溶媒を排出後は、ガレージと 3 h の N₂バブル 40 mL 胸の谷間ソリューション (95 %tfa、2.5% H₂O、2.5% のヒント) を追加します。
ペプチド合成装置に新しい受信フラスコを置き、新しいフラスコに真空下で目的のペプチドを含む theTFA 溶液を排水します。

6. 沈殿物とペプチドの solation

4 円錐バイアルに TFA 溶液を分離し、ペプチドを沈殿させる各バイアルに 25 mL の冷たいエーテル (− 20 ° C) を追加します。
遠心分離機のバイアル (3,000 rpm、0-4 ° C) 20 分の円錐形の瓶から残りの TFA とエーテルの溶液を捨て、白色固体として必要なジペプチドを余裕にペプチド沈殿物に集中します。

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Transcript

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

固相合成とは、不溶性物質に結合した状態で生成物を合成する方法です。

固相合成は、ペプチド、核酸、オリゴ糖などの生物学的オリゴマーやポリマーの製造によく使用されます。これらの分子は、モノマーと呼ばれる小さな分子サブユニットの鎖で構成されています。オリゴマーやポリマーの合成には、モノマーを正しい順序で添加する必要があるため、多くのステップを踏む必要があります。

多段階合成の問題点は、中間生成物と呼ばれる各ステップの安定生成物の精製と単離により、全体的な収率が低下することです。固相合成では、中間生成物は合成全体を通じて固体支持体に結合したままになります。これにより、溶液相試薬、溶媒、および副生成物を洗い流すことができ、ステップ間で各中間生成物を精製して分離する必要がなくなります。

このビデオでは、固相ペプチド合成の手順を説明し、化学における固相合成のいくつかのアプリケーションを紹介します。

固相合成では、分子は一連の反応で固体支持体上で合成されます。例えば、オリゴマーやポリマーは、一度に1つのモノマーを合成して最終製品を形成します。成長中のオリゴマーまたはポリマーは、試薬で支持体から分離または切断されるまで、固体支持体に強く結合したままになります。

各モノマーは、ポリマー鎖の一部となるために少なくとも2つの結合部位を持つ必要がありますが、モノマーが正しい原子に結合するようにするためには、一度に1つの結合部位しか利用できません。これは、合成の1つ以上のステップで反応しない官能基である保護基によって達成されます。結合部位は、分子を特定の試薬で処理して保護基を反応性官能基に変換することにより、回復または脱保護されます。

固相合成を開始するには、出発物質を特別に設計された樹脂または不溶性ポリマーに結合させる必要があります。次に、結合した出発物質を脱保護して、鎖内の第2のモノマーの結合を可能にします。次に、鎖中の第2のモノマーの溶液を、モノマー間の結合を容易にするためのカップリング剤と共に添加する。

2番目のモノマーが出発物質に結合すると、得られる二量体中間生成物は脱保護されます。このプロセスは、標的のオリゴマーまたはポリマーが形成されるまで繰り返されます。生成物は固体支持体から溶液に切断され、そこから精製、単離、分析することができます。

固相合成は、アミノ酸の鎖であるペプチドの合成によく使用されます。アミノ酸には、アミン基、カルボキシル基、置換基、または「側鎖」があります。アミンは最初に保護されます。脱保護されると、アミンは次のアミノ酸のカルボキシル基とペプチド結合を形成します。

固相合成の原理を理解したところで、固相ペプチド合成の手順を見ていきましょう。ここでは、最初の2つのアミノ酸の付加を実演します。

手順を開始するには、廃棄物用の受け入れフラスコを100 mLの手動ペプチド合成容器に接続します。次に、0.360gの2-クロロトリチル塩化物樹脂を容器に入れます。窒素ガスラインを容器のサイドアームに接続し、バキュームラインを鋸歯状のホースアダプターに接続します。

20 mLのジメチルホルムアミドを樹脂に加え、窒素ガスの流れの下で樹脂ビーズを30分間膨潤させます。次に、真空を適用して溶剤を排出します。

10 mLのDMF、1.6 mmolのFmoc保護アミノ酸、および2.5 mLのN、N-ジイソプロピルエチルアミンを容器に加えます。溶液を混合する窒素ガスの下で15分間泡立て、保護されたアミノ酸を樹脂に充填します。

真空下で溶媒を除去し、2回目のローディングを行います。溶媒を取り除いた後、DMFの10mL部分に装填したレジンビーズを3回攪拌し、各洗浄液を受入フラスコに排出します。

次に、DMF中の4-メチルピペリジンの20%溶液10mLをロードしたビーズに加えます。混合物を15分間泡立てて、Fmoc基を除去します。

溶剤を排出し、保護解除手順を繰り返します。前回と同様に、ロードしたレジンを3回洗浄し、水気を切ります。ビーズは、次のステップの準備ができるまで溶剤で保管します。

ロードした化合物が完全に脱保護されていることを確認するには、まず、各カイザー試験溶液を1〜2滴2つの試験管に入れます。

試験管に数個のビーズを入れ、オイルバスで両方のチューブを110度に加熱します。樹脂混合物が濃い青色から紫色に変わった場合、脱保護は完了し、混合物中にアミン基が存在することを示します。

カップリングステップを開始するには、まずN2ガスの流れ下でビーズを10 mLのNMPで洗浄します。

次に、10 mLのNMP、1.6 mmolの次のFmoc保護アミノ酸、1.6 mmolのカップリング剤HBTU、および2.5 mLのDIPEAをロードした樹脂に加えます。

N2ガスを樹脂混合物に30分間泡立ててから、溶剤を排出します。前回と同様に、10mLのDMFでビーズを3回洗浄し、水気を切ります。

カイザーテストを繰り返します。ビーズと溶液が黄色に変わり、アミン基が存在しないことを示している場合、カップリングは正常に発生しています。

次に、DMF中の20%4-メチルピペリジンで新しいFmoc基を切断し、10mLのDMFでビーズを洗浄します。標的ペプチドに残っている各アミノ酸について、カップリングと脱保護を繰り返します。

最後のアミノ酸を保護解除し、レジンビーズを洗浄した後、40 mLのペプチド切断液を加えて、ペプチド製品をレジンから分離します。

樹脂混合物に窒素ガスを3時間泡立ててから、受け入れフラスコを交換します。樹脂混合物から真空下で新しい受入フラスコに溶液を移します。

最終製品を生成するには、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去します。

固相合成は、生物学や化学で広く使用されています。いくつかの例を見てみましょう。

固相合成は、エネルギー貯蔵などの重要な生物学的役割を持つ単糖モノマーの短鎖であるオリゴ糖への多くの新しい合成経路を開きました。ペプチド結合とは異なり、糖間の各結合には立体中心が含まれています。オリゴ糖を合成するには、モノマーが正しい順序であるだけでなく、結合も正しい立体化学を持っている必要があります。固相合成技術は、各モノマーを高度に立体選択的なプロセスで結合するために開発されましたが、今日では自動化が十分に進められています。

固相合成は、コンビナトリアルケミストリーの一般的なアプローチであり、1つの合成プロセスで化合物の多くのバリアントを合成する方法です。装填された樹脂は、さまざまなモノマーや分子と反応するために、簡単に部分に分割できます。各反応の後、部分を洗浄し、再結合する。これは、必要な数の製品が生成されるまで繰り返されます。この手法は、新しい化合物の生成や、化合物の幅広い分子との反応性の評価に使用できるため、製薬研究に特に役立ちます。

JoVEの固相合成の紹介をご覧になりました。これで、固相合成の基本原理、固相ペプチド合成の手順、および有機化学における固相合成の使用方法の例をいくつか理解できたと思います。ご覧いただきありがとうございます!

Learning Objectives

Questions that this video will help you answer

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