Name: 後脚虚血症のマウスモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 51 s
Description: 学ぶマウス後脚虚血症モデルの手術法とレーザードップラー血流イメージングによる確認法。末梢動脈疾患と血管再生の研究に有用な実験手法を解説します。

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著者はアンドレアアクステル聡伊藤、MD、ジェフVelotta、MD、グラントホイト、ロバートC.ロビンス、MD、金玉、M​​D、ティムドイル博士、および技術支援のためのスタンフォード大学小動物のイメージングコアを感謝。また、作者は獣医機器のサポートのためにAMビックフォード社に感謝。この研究は国立衛生研究所（R01 HL - 75774、R01 CA098303、R21 HL085743、1K12 HL087746）、カリフォルニア大学のカリフォルニア州のたばこ関連病研究プログラム（15IT - 0257と1514RT - 0169）からの研究補助金によって支えられて、および再生医療（RS1 - 00183）のためのカリフォルニア工科大学。 NHは、アメリカ心臓協会からのフェローシップでサポートされています。

1。片側後脚虚血の誘導<ol><li>この操作に必要な外科的なツールが含まれます：細かい尖ったピンセット、鉗子、春のはさみ、外科はさみ、針ホルダー、およびリトラクターを指摘した。それは市販のリトラクターよりも小さいので、我々はペーパークリップを使って私たち自身のリトラクタを行います。オートクレーブまたはホットビーズ滅菌器で、手術前にこれらのツールを滅菌する。焼灼器ツールと滅菌細かい尖った綿棒も、この手術のために必要となります。それは手順の実行中に必要に応じてツールをヒントに再滅菌することをお勧めします。 </li><li>ツールの準備が整うと、1L/minの流量で100％酸素でイソフルラン1〜3％を含む麻酔導入チャンバーにマウスを置きます。 </li><li>それは外的刺激に反応しなくなるまで誘導チャンバ内でマウスを残す。その後、誘導室から動物を削除します。それはイソフルランの演算子の曝露を減らすために、蓋を開ける前ボックスから麻酔薬をフラッシュすることをお勧めします。 </li><li>その後、事前に手術台に仰臥位に動物を配置し、イソフルランの連続的な流れに接続します。電気シェーバーを使用して、後肢から毛を取り除く。徹底的に髪を削除するには、脱毛クリームを適用します。 </li><li>手術台の上にドレープ加熱パッド上に仰臥位にマウスを置き、イソフルランの連続的な流れに接続します。テープの切れ端で後肢を拡張して固定します。後肢が安全になると、三交互betadineとアルコールスクラブで皮膚を拭いてください。外科的処置の残りの部分では、後肢地域の拡大図を得るために10倍または20倍の倍率で解剖顕微鏡を使用してください。 </li><li>細かい鉗子と外科はさみを使用して、大腿内側に向かって膝から、約1 cmの長さ、皮膚の切開を行います。 </li><li>リン酸緩衝生理食塩水を使用して（PBS）、微細な先の尖った綿棒を湿らせ軽く太ももの筋肉を周囲の皮下脂肪組織を拭う。 </li><li>次に、切り込みを入れると、基礎となる大腿動脈を明らかにするために皮下脂肪組織を解剖して横方向に焼灼を適用します。 </li><li>傷口を開くことと、下肢の血管の良い眺めを得るためにリトラクターを使用してください。 </li><li>神経血管束を公開する膜大腿骨シースを通して微細な鉗子と細かい尖った綿棒、静かにピアスを使用する。 </li><li>その後、細かい鉗子や綿棒のクリーンセットを使用して、脚の付け根に近い近位の場所で大腿静脈と神経から大腿動脈を摘出し、分離する。解剖した後、大腿動脈の近位端の下に7〜0絹縫合糸の鎖を渡します。ダブルノットを使用して近位大腿動脈を閉塞。第二のタイとtransectedされ、間にセグメントの長さを残すために、できるだけ傷の近位等の容器にネクタイを置きます。 </li><li>膝に近い遠位の​​位置で大腿静脈から大腿動脈を分離。膝窩動脈の近位大腿動脈の遠位端の下に7〜0縫合糸の鎖を渡します。ダブルノットを使用して血管を閉塞させる。 </li><li>ノットの最初のセットにちょうど近重結び目の2番目のセットと遠位大腿動脈を閉塞。縫合糸のこの番目のセットは、トランザクションの手順中に動脈を把持するために使用されます。 </li><li>同様に、グリップの目的のために、結び目の最初のセットにちょうど遠位二重結び目の2番目のセットとの近位大腿動脈を閉塞。 </li><li>細かい尖った綿棒と春のはさみと遠位と近位の結び目の間に大腿動脈のセグメントを横断する。ピアス大腿静脈の壁はない、十分に注意してください。 </li><li>リトラクターを削除し、5から0 Vicryl縫合糸を使用して切開を閉じてください。これらの縫合糸は、彼らが自分自身で解散と、後で削除する必要はありません。 </li><li>切開がクローズされると、回復のケージで覆われた加熱パッドの上に動物を配置し、目を覚ましになるまで継続的に監視する。 </li><li>動物は1時間回復した後は、虚血の誘導を確認するためにレーザードップラー血流のステップに進みます。 </li></ol> 2。レーザードップラー血灌流<ol><li>レーザードップラー血流のステップを開始するには、1L/minの流量で100％酸素でイソフルラン1〜3％を含む麻酔導入チャンバーにマウスを置きます。 </li><li>それは外的刺激に反応しなくなるまで誘導チャンバ内でマウスを残す。その後、誘導室から動物を削除します。それはイソフルランの演算子の曝露を減らすために、蓋を開ける前ボックスから麻酔薬をフラッシュすることをお勧めします。 </li><li>イソフルランの連続的な流れに接続してプレオペレーティングテーブルの上に動物を配置。その後、必要に応じて脱毛クリームに続いて、電気シェーバーを使用して、後肢から毛を取り除く。 </li><li>毛を除去した後、イソフルランの連続的な流れの下で5分間、37℃で加熱された表面に動物を置く。温度変化が著しく血流に影響を与えるとして、euthermiaを確保するためのコア温度を監視します。 </li><li> 5分後、イソフルランの連続的な流れに接続されているような緑色の布のような非反射光吸収面、上に仰臥位に動物を配置。後肢を延長する。 </li><li>次に、レーザードップラーイメージャと買収のソフトウェアをオンにし、ソフトウェアを初期化する。ビューと分解能のフィールドのサイズを指定します。それは、将来の分析を容易にするために動物の間のビューと画素密度のフィールドの一貫性を保つのが最善の方法です。 </li><li>新しいファイルを開きます。画像データの取得を開始するSTART（スタート）を押します。一般的に、イメージャは自動的にマウスの距離を検出しますが、要求された場合は、イメージャへの動物の距離を指定します。レーザーは、ビューのフィールドの境界線を表示し、データの取得が開始されます。 </li><li>買収が完了すると、画像は、足への血液灌流のレベルの指標である色の範囲を示すために開始されます。色はよりよい動物の間でデータを比較するために特定の灌流の範囲に設定することができます。 </li><li>データ収集が完了したら、ファイルを保存します。 </li><li>その後回復のケージに動物を返し、目を覚ましになるまで継続的に動物を監視する。 </li><li>データを分析するために、あらゆるバックグラウンドノイズを減算する解析ソフトウェアのしきい値の調整を使用してください。 0.2のしきい値は、通常、妥当な値です。各後肢領域をカバー2関心領域、またはROIを、選択してください。ランドマークの様々な手足と動物の間でROIを標準化するために使用することができます。その後、ROI内の平均流と変動性を決定する。虚血肢と対照肢との間の血流の差と血流比は、容易に決定することができます。 </li><li>この手順は、時間をかけて後肢灌流の変化を追跡するために繰り返すことができます。希望する時点で、動物は、組織の機能と血流の画像データとの比較の評価のために安楽死することができます。 </li></ol> 3。代表的な結果： 後肢血管系の解剖学的構造を図1 2に示されています。大腿動脈の植後の後肢の代表的な図を図2に示します。図3に示すように、後肢の虚血の誘導を確認するには、レーザードップラー血流の画像解析は、対照肢と比較して、虚血肢への血流の劇的な減少を示しています。 <img src="/files/ftp_upload/old/1035_2009_1_26_9/figure1_1035.png" alt="図1" width="600" height="406" /> 図1。後肢の血管系の解剖学。アスタリスクは、後肢虚血の誘発のためのライゲーションの位置を示している。 <img src="/files/ftp_upload/old/1035_2009_1_20_7/Niiyama_HLI_Fig2.png" alt="イメージ2" width="600" height="450" /> 図2。大腿動脈を除去した後の近位および遠位部位における大腿動脈の結紮後の後肢の解剖学的構造を示す代表図。 <img src="/files/ftp_upload/old/1035_2009_1_20_8/Niiyama_HLI_Fig3.png" alt="図3" width="600" height="256" /> （3）レーザードップラー画像が左後肢（矢印で示される）に虚血の誘導前後での血流を示す図 。

<ol><li>Huang, N. F., Niiyama, H., De, A., Cooke, J. P., , <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+and+non-invasive+tracking+of+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+cells+for+treatment+of+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation and non-invasive tracking of embryonic stem cell-derived endothelial cells for treatment of hindlimb ischemia.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Cook, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCook%2C+MJ+%22The+anatomy+of+the+laboratory+mouse%22">The anatomy of the laboratory mouse</a>. , Academic Press. New York. (1976).</li>
<li>Niiyama, H., Kai, H., Yamamoto, T., Shimada, T., Sasaki, K., Murohara, T., Egashira, K., Imaizumi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+endogenous+monocyte+chemoattractant+protein-1+in+ischemia-induced+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Roles of endogenous monocyte chemoattractant protein-1 in ischemia-induced neovascularization.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 44, 661-666 (2004).</li>
<li>Dokun, A. O., Keum, S., Hazarika, S., Li, Y., Lamonte, G. M., Wheeler, F., Marchuk, D. A., Annex, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+trait+locus+%28LSq-1%29+on+mouse+chromosome+7+is+linked+to+the+absence+of+tissue+loss+after+surgical+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia.</a> Circulation. 117, 1207-1215 (2008).</li>
</ol>

後肢虚血モデルを計画し、実行中に考慮すべき変動性のあるソースがあります。最初に、虚血のレベルでは、側枝のことに関してライゲーションの場所に応じて異なる場合があります。したがって、モデルの一貫性を保つために、動物は動脈結紮の同じレベルを受けなければならない。虚血性回復にばらつきの別のソースが古い動物（8-10ヶ月齢）より速く、より完全な回復率を有する若い動物（6-8週齢）で、動物の年齢に関連している、などの血行動態（つまりによって評価レーザードップラー血流）や機能的な（すなわち、トレッドミル試験）対策。群間差が大きく、治療介入で観察されることがありますので、一つは血管新生阻害剤を評価されている研究については、それは、古い動物を使用することが好ましいかもしれない。逆に、一つの抗血管新生因子を評価されている研究のために、それは効果の大きさ3を最大化するために、若い動物を使用することが好ましいかもしれない。 正しく実行した場合、出血、感染、または死亡のような最小限の合併症があるはずです。出血が大腿静脈または他の船舶、滅菌綿で適度な圧力の偶発的な破壊によって発生する場合は出血が止まるまでアプリケーターまたはガーゼが出血の部位に適用する必要があるチップを渡した。感染の徴候を示す動物は、抗感染剤で処理されるべきである。重要な壊疽を示す動物はbeeuthanizedする必要がある場合があります。この合併症は、高齢の動物で、そのようなBALB cマウス4など一部の菌株で、より一般的です。さらに、後肢虚血モデルでは、軽度から中程度の痛みが発生することがあります。痛みの治療のために、必要に応じてそのため、このようなブプレノルフィンまたはカルプロフェンのような鎮痛薬がIACUCの勧告によると、投与されるべきである。 結論として、我々は、後肢虚血のマウスモデルにおいてPADを研究するためのシンプルで再現性のある方法を示している。レーザードップラーイメージング解析による後肢虚血モデルでは、血管病理を研究するための、治療の候補を評価するための優れたシステムです。

<table><tbody><tr><td>手術器具</td><td>器具</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Constix 綿棒</td><td>器具</td><td>Contec</td><td>SC-4</td><td></td></tr><tr><td>ベタジン（ポビドンヨード）</td><td>試薬</td><td>PDI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% アルコール</td><td>試薬</td><td>Kendall</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7-0 シルク縫合糸</td><td>器具</td><td>Genzyme</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-0 バイクリル縫合糸</td><td>器具</td><td>Ethicon Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>電気シェーバー</td><td>器具</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>電気凝固器</td><td>器具</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>レーザードップラーおよびPeriScan PIM 3 システム</td><td>装置</td><td>Perimed</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

後脚虚血症のマウスモデル

Murine Model of Hindlimb Ischemia 

米国では、末梢動脈疾患（PAD）は約1,000万人に影響を及ぼし、また普及している世界的です。症状緩和のための薬物療法は限られている。外科手術または血管内介入は、一部の個人のために有用であるが、長期的な結果はしばしば失望させるもの。その結果、PADを治療する新しい治療法を開発するための必要性がある。マウス後肢虚血の準備は、PADのモデルであり、新しい治療法をテストするのに便利です。このような冠動脈や脳動脈の結紮などの組織の虚血の他のモデルと比較すると、大腿動脈の結紮は、虚血組織の単純なモデルのために用意されています。このモデルの他の利点は、大腿動脈と低死亡率へのアクセスが容易です。 このビデオでは、我々は一方的hindimbの虚血のマウスモデルのための方法論を示しています。モデルを作成し、評価するための特定の材料および手順は、レーザードップラーイメージングによる四肢の血流の評価を含め、説明される。このプロトコルは、Huang らによって示されている細胞を、1の移植と非侵襲的な追跡のために利用することができます。

片側後肢虚血の誘発のための外科手術は、レーザードップラー血流イメージングによる虚血の確認を、示されている。

米国では、末梢動脈疾患（PAD）は約1,000万人に影響を及ぼしており、世界的に見ても普及しています。...に対する薬物療法は、

米国では、末梢動脈疾患（PAD）は約1,000万人に影響を及ぼしており、特に喫煙者、糖尿病患者、および70歳以上の高齢者に多く見られます。本手術の全般的目的は、大腿動脈の近位および遠位セグメントを結紮することで、後肢虚血を誘発することです。処置は、マウスの麻酔、除毛、および手術台への仰臥位での固定から始まります。次に、膝から大腿内側に向かって皮膚を切開し、下層の大腿動脈を露出させます。続いて、大腿動脈を大腿静脈から慎重に分離します。遠位側の結紮部位および近位側の結紮部位の両方で、二重結びを行います。次に、大腿動脈セグメントを切除します。切開部位を縫合し、動物を麻酔から回復させます。後肢虚血の誘導を確認するため、麻酔をかけたマウスを仰臥位に置きます。次に、レーザードップラーを用いて両後肢をスキャンします。その後、画像を保存し、血流灌流の状態を評価します。こんにちは、ジョン・クックです。私はスタンフォード大学心血管医学部門の医学教授です。私たちの研究室では、血管新生と血管再生に関心を持っています。このビデオでは、私のポストドクトラルフェローであるNan Wong博士とHir Niyama博士が、マウス後肢虚血モデルの作製方法について紹介します。このモデルは末梢動脈疾患の重要なモデルであり、当研究室では成長因子や細胞治療が血管新生に及ぼす影響を評価するために頻繁に使用しています。当研究室では、血管修復における幹細胞由来血管内皮細胞の効果を研究するために、これらの手順を用いています。それでは、始めていきましょう。この手術に必要な手術器具は、精密尖端ピンセット、尖端ピンセット、スプリングシザー、外科用ハサミ、持針器、およびレトラクターです。市販品よりも小型であるため、ペーパークリップを用いて自作のリトラクター（牽引器）を作成します。手術前に、ホットビード滅菌器を用いてこれらの器具を滅菌させてください。また、本手術では電気焼灼器および滅菌済みの微細先端綿棒も必要となります。器具の準備が整ったら、100%酸素に1～3%のイソフルランを混合し、流量1 L/minで供給している麻酔導入チャンバーにマウスを入れます。マウスが外部刺激に反応しなくなるまで、導入チャンバーに入れておきます。その後、マウスを導入チャンバーから取り出します。次いで、マウスを術前テーブルの上に仰臥位で配置し、イソフルランを連続的に投与します。電気シェーバーを使用して、後肢の毛を除去します。除毛クリームを塗布し、完全に除毛します。マウスの除毛後、後肢を伸ばしてテープで固定します。後肢を固定した後、ベタジンとアルコールを用いて皮膚を交互に3回洗浄します。細いピンセットと外科用ハサミを使用し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で湿らせた尖端綿棒で視認性を確保しながら、膝から内側大腿部に向かって約1 cmの皮膚切開を行います。大腿筋周囲の皮下脂肪組織を優しく刷い除けます。次に、電気焼灼器を横方向に適用し、皮下脂肪組織を切開して、下層にある大腿動脈を露出させます。続いて、リトラクターを用いて創傷部を広げ、下肢血管系の視認性を高めます。精細ピンセットと先の尖った綿棒を用いて、膜状の大腿鞘をそっと貫通させ、神経血管束を露出させます。次に、洗浄済みの精細ピンセットと綿棒を用いて、鼠径部付近の近位側で大腿動脈を大腿静脈および神経から剥離・分離します。剥離後、大腿動脈の近位端の下に7-0シルク縫合糸を回します。ダブルノットを用いて近位大腿動脈を結紮します。2つ目の結紮糸と、その間に切断するためのセグメントを確保するため、結紮部は創傷内の可能な限り近位に配置してください。膝に近い遠位側で、大腿動脈を大腿静脈から分離します。7-0縫合糸を、膝窩動脈の近位側にある大腿動脈遠位端の下に通します。二重結紮により血管を閉塞させます。最初の結紮点の直近位側で、さらに二重結紮を行い、大腿動脈遠位端を閉塞させます。この2組目の結紮糸は、切断処置中に動脈を把持するために使用します。同様に、把持を目的に、1組目の結紮部位のすぐ遠位側で、2組目の二重結紮により近位側の大腿動脈を閉塞させます。遠位側と近位側の結紮部位の間の大腿動脈セグメントを、先細りの綿棒とスプリングシザースを用いて切断します。大腿静脈壁を穿刺しないよう注意してください。リトラクターを取り外し、5-0絹縫合糸を用いて切開部を閉鎖します。切開部の閉鎖後、動物を回復ケージに戻し、覚醒するまで観察します。動物が1時間回復した後、レーザードップラー血流測定に進みます。虚血誘発を確認するための手順です。レーザードップラー血流測定を開始するために、100%酸素に1～3%のイソフルランを混合し、流量1 L/minで供給している麻酔導入チャンバーにマウスを入れます。マウスが外部刺激に反応しなくなるまで、導入チャンバー内に留めておきます。次に、動物を導入チャンバーから取り出し、イソフルランの持続的なフローに接続された術前処置台に置きます。その後、電気シェーバーを用いて後肢の被毛を除去し、必要に応じて除毛クリームを使用します。除毛後、イソフルランの持続的なフロー下で、動物を37 °Cに加熱された表面の上に5分間置きます。5分後、動物を、イソフルランの連続フローに接続された緑色の布などの反射のない光吸収面に仰臥位で置きます。後肢を伸展させます。次に、レーザードップラーイメージャーとデータ収集ソフトウェアを起動し、ソフトウェアを初期化します。視野のサイズと解像度を指定します。個体間で視野とピクセル密度を一定に保つことが望ましいです。後の解析を容易にするため、新しいファイルを開いてください。スタートボタンを押し、画像データの取得を開始します。指示が表示されたら、動物からイメージャまでの距離を指定してください。レーザーで視野の境界が表示された後、データの取得が始まります。キャプチャが完了すると、脚への血流充足度を示すさまざまな色が画像に表示され始めます。色は特定の充足範囲に設定することが可能です。データ収集完了後、個体間のデータをより正確に比較するため、ファイルを保存し、個体を回復用ケージに戻して、覚醒するまで継続的に観察してください。データを解析するには、解析ソフトウェアのしきい値調整機能を用いてバックグラウンドノイズを除去します。通常、しきい値は0.2が適切な値となります。各後肢領域をカバーする2つの関心領域（ROI）を選択してください。さまざまなランドマークを用いて、肢間および個体間でROIを標準化し、ROI内の平均灌流量とばらつきを決定できます。これにより、虚血肢と対照肢の間の灌流量の差および灌流比を容易に算出することが可能です。この手順を繰り返すことで、後肢灌流の変化を追跡することができます。所定の時点において、組織機能の評価のために動物を安楽死させることができます。灌流画像データと比較して、大腿動脈結紮後の後肢の代表的な模式図をここに示します。縫合糸は、近位および遠位の結紮部位の位置を示しています。慎重に手術を行うことで、出血を最小限に抑え、1時間以内に手術を完了させることができます。ここでは、レーザードップラー血流画像解析の結果を示します。左側の画像は、虚血誘発前の両肢の血流灌流を示しています。右側の画像は、左後肢に虚血誘導を行った後の両肢の血流を示しています。画像の色強度は血流量を表しています。対照肢と比較して、虚血肢は色がほとんど現れておらず、血流が劇的に減少していることが示唆されます。このデータを用いて、ソフトウェアは虚血肢と対照肢の平均灌流量を定量化し、灌流差および灌流比を決定できます。したがって、これらの結果により、後肢への虚血導入が確認されました。マウスモデルにおける片側後肢虚血の誘導方法と、レーザードップラー血流測定による虚血誘導の確認方法について説明しました。レーザードップラーイメージング解析を用いた後肢虚血モデルは、血管病理の研究や治療候補薬の評価において優れたシステムです。この手順に続いて、細胞の移植および非侵襲的な追跡を行うことが可能であり、その詳細はHuangらによる別のJoVEビデオで実演されています。本手順を行う際は、スプリング鋏で大腿動脈を切り出す際に大腿静脈壁を突き刺さないよう注意することが重要です。また、高度虚血モデルの整合性を保つため、実験に用いるすべての動物で同様の結紮部位を使用してください。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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