Name: アンペロメトリー電極の作製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 学ぶカーボンファイバー電極の作製法。ガラス毛細管にカーボンファイバーを充填し、エポキシで封入して硬化させることで、単細胞からのカテコラミン遊離を検出可能な低ノイズ電極を作成できます。神経科学研究に有用です。

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我々は、このプロトコルが最初に設計され、その研究室で、シカゴ大学で博士アーロンP.フォックスに感謝、そしてプロトコルのさらなる発展のためのウィリアムローデン（セントルイス大学）。 私たちは、ホワイトホール財団と支援のための国立科学財団に感謝します。

パート1：炭素繊維の調製<ol><li>キャピラリーピペットの〜1.25 ×長さは長さの炭素繊維（我々は7μm径を使用する）の束をカット。 </li><li> 〜コンテナ内のアセトン100mLの沸騰によるサイジングを外し、30分以上熱い、沸騰アセトンに繊維を追加。 </li><li>暖かいアセトンから繊維を取り出し、そして新鮮なアセトンの50〜100 mLできれいなビーカーに移す。 </li><li>オープン150ミリメートルペトリ皿とairdry一晩にバンドルを配置することにより乾燥した繊維。 </li></ol>パート2：火 - 研磨ガラス毛細管<ol><li>鉗子を中心にチューブを保持し、約flame.Rotateチューブに端を公開することにより、（我々は長いマイクロヘマトクリット毛細管は1.5mm外径、1.3ミリメートル内径、7.5センチメートルを使用）各キャピラリーチューブを火 - ポーランド炎の中に3回。 </li><li>チューブを逆さにして、再度3回回転させ、炎に反対側の端を置きます。 </li><li>ガラス皿にファイアーポリッシュチューブをセットし、彼らは炭素繊維で満たされることの準備が整うまで、オーブンに移す。 </li></ol>第3部：キャピラリーチューブにカーボン繊維をスレッディング<ol><li>マチャドらの説明に似て。 （2008年）とMundroffとワイトマン（2002）は、フィルタを真空に接続されているプラ​​スチック製のチューブを使用してガラス管に繊維を吸う。 </li><li>チューブの繊維の外のscalpel.Leave ¼インチを使用して繊維をカット。 </li></ol>パート4：電極プラーでピペットファイバを引っ張る<ol><li>電極プラー（我々はナリシゲ日本モデルPP - 830を使用）にキャピラリーチューブを置き、場所にキャピラリチューブを保持するためにノブを締めて。 </li><li>最適な引き手の設定で設定され、二人プル実行するためにスイッチを操作する。 </li><li>ピペットが半分に引っ張られると、ハサミを使って中心にベアファイバを切断して二つの部分を分ける。 </li><li>各電極の半分を削除し、繊維の1 / 8インチのチューブの外に残されるように、はさみでガラスseal.Trimの繊維を壊すために突き出したファイバーを引っ張る。 </li><li>約16繊維電極が引き出されるまで繰り返し、1〜4を繰り返します。 </li></ol>第5部：エポキシグラスのシールを作る<ol><li>ドラフトで6分間55℃に設定したホットプレート上でエポキシの既製のアリコートを加熱する。 </li><li>エポキシは、ラップを加熱している間〜束に引っ張ら電極16を​​テープを使用して。 </li><li>エポン樹脂が6分間加熱された後、ホットエポン樹脂（14％、w / v）の0.7グラムXOF MPDAを追加。バイアルを渦巻くことによりミックス。 </li><li>エポキシの十分な量が毛細管現象を介してガラスのヒントを入力する、20秒程度のホットエポキシプラス硬化剤のsolution.Afterに電極の束をつけます。 </li><li>スロットで段ボールにバンドル、場所の電極を元に戻すと、オーブンでこのトレイを置く、100℃に設定F. </li><li>少なくとも48時間後、、エポキシ樹脂で埋めるこわれた先端を持って、、それぞれの電極を検査段ボールホルダーの所定の位置に戻すとバック​​、複数のファイバー、etc.Afterを持っていなかった解剖microscope.Discard電極の下に各電極を調べるoven.Electrodesに通常製造後約1ヵ月に適しています。 </li></ol>第6部：炭素繊維を切断<ol><li>テフロンテープでスライドガラスの上に慎重に炭素繊維電極を置きます。 </li><li>解剖顕微鏡の下に先端を可視化する。 </li><li>細胞に対する炭素繊維を配置するための平坦な清浄な表面を残すために炭素繊維を垂直に横切っカットするクリーンな手術用メスの刃を使用してください。 </li></ol>

<ol><li>Mundorf, M. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amperometry+and+cyclic+voltammetry+with+carbon+fiber+microelectrodes+at+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protocols+in+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amperometry and cyclic voltammetry with carbon fiber microelectrodes at single cells.</a> Curr Protocols in Neurosci. 6 (14), 1-6 (2002).</li>
<li>Machado, D. J., Montesinos, M. S., Borges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Good+practices+in+single-cell+amperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molec.+Biol%22%5BJournal%5D)">Good practices in single-cell amperometry.</a> Methods in Molec. Biol. 440, 297-313 (2008).</li>
</ol>

このプロトコルは、電流滴電極を生成し、カットする方法について説明します。電流測定の録音中に、炭素繊維の電極は、分泌細胞の表面に配置されます。エキソサイトーシス活性は、カテコールアミンの酸化後の電子の移動によって生じる電気化学的電流を示す電流測定スパイクとして観測される。練習は作るとアンペロメトリック電極を切断すると、ノイズレベルを大幅に市販の電極の多くにわたって改善することができます。

<table><tbody><tr><td>エポキシ硬化剤 1,3-フェニレンジアミンフレーク</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P23954-100G04 716AJ</td><td>分注したサンプルはデシケーター内で保存し、光にさらさないこと。</td></tr><tr><td>炭素繊維</td><td>材料</td><td>Goodfellow</td><td>C005725</td><td></td></tr><tr><td>マイクロヘマトクリット毛細管</td><td>材料</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9836768</td><td></td></tr><tr><td>エポキシ樹脂</td><td>試薬</td><td>Miller-Stephenson</td><td>Epon Resin 828</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>器具</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>エレクトロードプラー（電極引き出し装置）</td><td>器具</td><td>Narishige International</td><td>PP-830</td><td>1回目：24.8 degrees C、2回目：62.7 degrees C</td></tr><tr><td>オーブン</td><td>器具</td><td></td><td></td><td>100 degrees Fに設定。</td></tr><tr><td>ホットプレート</td><td>器具</td><td></td><td></td><td>55 degrees Cに設定</td></tr></tbody></table>

アンペロメトリー電極の作製

Fabrication of Amperometric Electrodes

炭素繊維電極は、電流測定の測定のための単一細胞内小胞からのカテコールアミンの放出を検出するために重要です。ここで、我々は、低ノイズ（&lt;0.5 Pa）の電極を生成するために必要なテクニックを説明します。技術は、以前の研究（1,2）によって発行された記述から変更されています。電極は、炭素繊維を作製し、繊維を吸引するフィルターで真空を使用して、各キャピラリーチューブに個別にスレッドによって行われます。次に、繊維と毛細管は微尖った先端で二つの部分、それぞれを作成し、電極プラーによってプルアップされています。電極はエポキシガラスのシールを作成するための硬化剤と混合して熱い、液状エポキシ樹脂に浸漬されています。最後に、電極はエポキシ樹脂を硬化するオーブン内に配置されます。電極を慎重に取り扱い、それらが一貫して損傷することなく行われることを保証することが重要です。このプロトコルは、単一細胞から記録するための電流測定電極を作製し、カットする方法を示しています。

このプロトコルは、炭素繊維電極を生成する方法について説明します。電極は、その後、炭素繊維のアンペロメトリーと小胞からのカテコールアミン放出を検出するために使用されます。

カーボンファイバー電極は、アンペロメトリー測定において、単一細胞内の小胞からのカテコールアミン放出を検出するために極めて重要です。本稿では、我々は…

このプロトコルでは、カーボンファイバー電極の作製方法について説明します。まず、サイジング除去済みのカーボンファイバーをガラスキャピラリーに充填します。次に、ファイバーとキャピラリーの組み立て体を2本の電極に引き伸ばし、ファイバーを切断します。次に、電極をエポキシ樹脂に浸すように配置します。ファイバーを電極に封止するため、ファイバー電極をラックに載せてホットオーブンで保存します。これらの電極はその後、カーボンファイバーとバロメトリーを用いて、単一細胞内の小胞からのカテコールアミン放出を検出するために使用されます。正常な記録では、記録トレース上のノイズが低く、上向きのスパイクが明確に区別されます。こんにちは、セントルイス大学医学部薬理・生理科学科のAmy Harkins博士の研究室のCarrie Pikeです。今回は、単一細胞からのカテコールアミン放出を測定するパイロメトリーに使用するための、低ノイズ炭素繊維電極を作製する手順をご紹介します。電極作製のための炭素繊維の準備から始めます。まず、ドラフトチャンバー内で、キャピラリーピペットの長さの約1.25倍の長さに炭素繊維の束をカットします。容器の中でアセトン約100 millilitersを沸騰させ、そこに繊維を加え、沸騰したアセトン中で30分以上加熱することでサイジング剤を除去します。沸騰させた後、加熱したアセトンから繊維を取り出し、50〜100 mLの新鮮なアセトンが入った清潔なビーカーに移します。さらに、繊維をアルミホイルに移します。これにより、フードの外へ持ち出すことが可能になります。繊維の束を150 mmのオープンペトリ皿に置き、カーボン繊維を一晩空気乾燥させて乾燥させます。カーボンファイバーの準備が完了したら、ガラスキャピラリーチューブの火炎研磨の準備に進みます。長さ7.5 cm、外径1.5 mm、内径1.3 mmのマイクロヘマトクリット用ガラスキャピラリーチューブを使用します。チューブの中央を持ち、片端を炎にさらしてください。チューブを炎にかざしながら、3回ほど回転させます。チューブを反転させ、反対側の端を炎に入れ、再び3回回転させます。これで、キャピラリーチューブの両端の火炎研磨が完了しました。ファイアポリッシュ管をガラス製ディッシュに入れ、カーボンファイバーを充填するまでオーブンで保管します。キャピラリー管にカーボンファイバーを通し始める前に、必ず保護用フェイスマスクを着用してください。次に、フィルターを備えた真空ポンプに接続されたプラスチックチューブを使用し、ガラス管内にファイバーを吸引します。次に、メスを用いてファイバーを切断します。チューブの両端から1/4インチのファイバーが出るようにしてください。これで、ピペットファイバー電極を牽引するためのネジ切り済みカーボンファイバーの準備が整いました。キャピラリーチューブを電極ポーラに挿入し、ノブを締めてキャピラリーチューブを固定します。次に、ポーラを最適設定にし、スイッチを操作して2つの極を実行します。ピペットが半分に引き伸ばされたら、中央の裸のファイバーを切断して2つの半分に分離させます。ハサミを使用して、各電極の半分を取り除き、突き出たファイバーを引っ張ってガラスシールを破断させます。チューブの外側にファイバーが 1/8 inch だけ残るように、ハサミでファイバーを切り揃えます。これらの手順を約16本分まで繰り返します。電極をエポキシガラスで封止する前に、ファイバー電極をプル（延伸）します。まず、あらかじめ分注したエポキシを、55 °Cに設定したホットプレート上で6分間加熱します。エポキシの加熱中に、ドラフトチャンバー内で、プルした電極約16本を束にまとめます。エポキシを6分間加熱した後、テープを用いて硬化剤0.7 gを加熱したエポキシに加えます。バイアルを回してこれを混合します。電極の束を、エポキシと硬化剤の混合溶液に浸します。束を2回、それぞれ約5秒間浸し、毛細管現象によってエポキシ樹脂がガラスチップに十分に入るようにします。束をほどき、電極をスロット付きのカードボードホルダーに配置します。このトレイを100 °Fに設定したオーブンに入れます。少なくとも48時間経過後、解剖顕微鏡で各電極を確認します。エポキシ樹脂で充填されなかった電極は廃棄してください。スマッシュチップを用意します。ファイバーが複数ある場合や、その他の理由で使用できない場合があります。各電極を点検した後、段ボール製のホルダーに戻し、オーブンに戻します。電極は通常、作製後約1か月間使用可能であり、細胞でパイロメトリーに使用する前にカーボンファイバーを切断する必要があります。カーボンファイバーを切断するには、カーボンファイバー電極をテフロンテープを貼ったガラススライド上に慎重に配置します。解剖顕微鏡下で先端を確認してください。次に、清潔なメスを用いてカーボンファイバーを垂直に切断し、細胞に接触させるための平坦で清潔な端面を作成します。記録の直前に、充填用シリンジを用いて3 Mの塩化カリウムでキャピラリーを充填し、ファイバーとは反対側の端を必ず乾燥させてください。これは過剰な塩を除去するためです。電極を電極ホルダーの塩化銀ペレットの上に配置します。これをパイロメトリーヘッドステージに電気的に接続します。電極を安定させるために、電極ホルダーを締め付けます。電極を細胞に隣接させ、RO指標イベントの記録を開始します。本プロトコルでは、tric電極の作製および切断方法について説明します。tric記録では、カーボンファイバー電極を分泌細胞の表面に配置します。エキソサイトーシス活性はtri-spikeとして観察され、これはカテコールアミンの酸化後の電子移動によって生じる電気化学電流を示しています。EmProメトリック電極の作製と切断に習熟すれば、市販されている多くの電極よりもノイズレベルを大幅に改善することが可能です。この手順において、パラメトリックカーボンファイバー電極をどのように作製するかを説明しました。一貫性がありノイズの少ない電極を作製するためには、プロトコルの詳細に細心の注意を払うことが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。

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