ショウジョウバエの視覚と嗅覚を介したフライトコントロールを調査するために磁気テザーシステム

Joof嗅覚の研究分野の発展に伴い、嗅覚磁気テザー装置（OMT）のような、より高度な行動解析法が導入されています。この手順では、ハエの胸部背面にmnuchinピンを接着します。ピンを適切なピッチで固定し、ハエを30度の角度で吊り下げた後、2つの希土類磁石の間に配置します。

正しく行えば、可動範囲が自由になります。次に、供給ノズルからハエの頭上を通り、真空チャンバーへとスムーズに流れるプルームを生成するように、臭気ポートを調整します。その後、視覚刺激がある状態で、ハエが臭気源を特定できるかどうかをテストします。

こんにちは。カリフォルニア大学ロサンゼルス校生理学部のMark Fry博士の研究室のBrian DeMarsです。本日は、嗅覚磁気係留装置に使用するためのハエの係留方法について解説します。また、マグネットと臭気ポートの調整方法、および臭気提示システムの質量流量の設定方法についても説明します。

当研究室では、ショウジョウバエにおける視覚および嗅覚が介在する飛行制御を研究するために、この手順を用いています。それでは始めていきましょう。テザリングを開始するために、羽化後4〜6日のハエを回収し、4〜6時間飢餓状態にします。

乾燥を防ぐために湿らせたキムワイプを入れたフードリストバイアルを用意します。次に、星印のついたハエのグループを、4°Cに設定したペルチェ冷却ステージ上の真鍮ブロックに挿入した小型バイアルに移します。この温度では、ハエは約30秒以内に麻酔状態になります。

湿気を吸収させるため、冷却ステージの上にKimwipeを置きます。次に、麻酔をかけたハエをソートのためにステージの上に置き、テザリング用に最も大きな雌を選択します。細い筆を使用して、野生型の雌のショウジョウバエ1匹が収まるように設計されたカスタムメイドのサルコファガスに、ハエ1匹を押し込んで配置します。

次に、顕微鏡を使用して、ハエが背面を上にして正しく配置されているか確認します。ハエの前端がこちらを向き、後端が向こう側を向いている必要があります。続いて、マイクロマニピュレーターに取り付けられた磁気ロッド付きのミニュチンピンを配置します。

ピンの鈍端（太い端）がハエの背側胸部に面するように合わせます。ここは頭部のすぐ後ろで、2枚の翅の間に位置します。ハエは、3つの軸に沿って正しくピン上に配置される必要があります。

ピッチ、ロール、そしてヨーについて、ピンを正面（眼側）から見たとき、完全に垂直である必要があります。ハエとピンの間にわずかでもロールがあることは許容されません。ピンと体の長軸との間、またはピッチの側面から見た角度は、水平面に対して30度の機首上げ（ノーズアップ）角度にする必要があります。最適なテザー操作のためには、ピンを切り詰める必要がある場合があることに留意してください。

これはサスペンション磁石間の距離によって異なります。ムチキンピンを調整した後、細い鋼線を用いて、ムチキンピンの鈍端にUV硬化樹脂を少量塗布します。次に、ピンを操作して、樹脂の滴がハエの頭の直上の胸部に触れるようにします。

接着剤を使いすぎないように注意してください。適切な量であれば、接着剤は丸みを帯び、ピンから胸部へと流れます。次に、UVライトを2秒間ずつ2回照射して、接着剤を硬化させます。

拘束が完了したら、ショウジョウバエに本能的な着地反射があるため、ピンセットを用いて各個体に小さな正方形のキムワイプを提示します。ショウジョウバエはキムワイプを掴みます。1時間の回復時間を置いた後、拘束されたショウジョウバエは実験に使用可能な状態になります。

スムーズな360度の可動範囲を実現するためには、磁石を適切に配置することが極めて重要です。そのためには、プラスチック製スリーブを用いて下部リング磁石を水平に保持し、透明な真空チャンバーの直上に配置します。上部ロッド磁石は、下部磁石から約3/4インチ上の位置に垂直に固定されており、上部磁石の底面にはエポキシ樹脂でV型デュアルベアリングが取り付けられています。

これにより、ハエの配置を標準化し、回転摩擦を最小限に抑えることができます。これらの磁石は危険を伴う可能性があり、誤った使用は装置の破損や軽微な身体的傷害につながる恐れがあることに注意してください。次に、上部と下部の磁石を目視で概ね合わせます。

上の棒状磁石を下側のリング磁石の中心点に直接配置します。微細な調整を行うために、上の磁石をマイクロマニピュレーターに取り付けると便利です。次に、アリーナにハエを配置し、すべての実験の開始時にハエがスムーズかつ安定して360度回転できるよう、上の磁石の水平方向および垂直方向の位置を調整します。磁石が適切に整列しているか、またムチンピンに損傷がないかを確認するため、ハエごとにスムーズな回転を確認する必要があります。セットアップが正しくない場合、ハエが全く回転しない可能性があります。

可動範囲が制限されていたり、回転速度が不安定であったりする場合があります。これは接着不良が原因である可能性があり、ハエの前で縞模様のグリッドを回転させてOMO反応を誘発させることで確認できます。ハエが回転しないか、あるいは回転が不安定な場合は、別の個体と交換してください。

もしショウジョウバエが正しく回転せず、すべての個体で同様の問題が発生する場合、原因はマグネットのアライメントにある可能性が高く、安定した臭気を提供するためにはさらなる調整が必要です。臭気システムの初期セットアップを確認するには、ガスマルチプレクサからカスタム製の水臭気バイアルまで、細径のテフロンチューブを配線する必要があります。これらのバイアルの出口は、同じテフロンチューブを使用して皮下注射ポートチューブに直接接続してください。

次に、磁石を支持するために、透明なアクリル製真空チャンバーをアリーナの下に配置します。ハエの下に取り付けられ、真空チャンバーに接続された4 mmのガラス管を使用して、真空開口部をハエに近づけ、開口部の直径を小さくします。ここで、ピンセットを使用して、テザーで固定したハエをアリーナ内に配置します。

ハエを定位置に配置したら、誘引臭を発生させます。臭気ポートがオンになった際、ハエがその方向に向かうかどうかを視覚的に確認してください。もしハエに臭気への嗜好性が見られない場合は、試行錯誤を繰り返してOMTを最適化してください。

まず、ハエが臭気を追跡しているように見えるまで、臭気ポートの位置を調整します。ここでは、臭気ポートをマイクロマニピュレーターに取り付け、ハエの頭部から背側に 4 mm、前方に 3 mmの位置に配置しています。臭気ポートの位置を変更しても臭気追跡が改善されない場合は、ハエが臭気を追跡するように見えるまで、質量流量を調整してください。

設定は毎分7 mLとします。質量流量を調整しても臭気追跡が改善されない場合は、ハエが臭気を追跡するように真空の流量を調整してください。本実験では、流量レギュレーターを用いて真空流量を毎分13 Lに設定しました。

ポートの位置と流量の設定が完了したら、切替可能なガスマルチプレクサを使用して、水蒸気と臭気蒸気の供給を定期的に切り替えます。装置が正しくセットアップされていれば、2つの現象が観察されるはずです。まず、一定の回転視覚刺激の下で、OMTに固定されたハエは、垂直方向またはya軸に沿ってスムーズに360度回転します。一方、一定の視覚刺激がない状態での自発的な回転行動では、「kos」と呼ばれる急激な回転が特徴的に見られます。

ハエがスムーズに回転できない場合は、接着不備やマグネットのずれが原因である可能性があります。次に、臭気を提示した際、ハエが臭気ポートの方向に向かうことを確認してください。臭気を停止させると、ハエはアリーナ内の特定の場所に偏ることなく、自発的に探索行動をとるはずです。

ハエが臭気プルームを積極的に追跡しない場合は、臭気ポートの位置、空気流量、または真空流量を調整する必要がある可能性があります。ここまで、嗅覚磁気テザリング装置に使用するためのハエのテザリング方法を説明しました。また、磁石と臭気ポートを正しく配置する方法、および臭気供給システムの質量流量を設定する方法についても説明しました。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。