慢性のためのマイクロドライブアレイ in vivoで録音：ドラ​​イブの作製

このビデオでは、21個の独立して調整可能なネジ駆動式マイクロドライブを備えた軽量マイクロドライブアレイの組み立てについて解説します。各マイクロドライブは、単一電極の記録位置を制御します。マイクロドライブはコンピュータ設計のプラスチックベースに取り付けられており、これにより移動する動物の頭蓋骨に対して安定させるとともに、電極を密集したパターンにまとめ、小さな開頭術部位から脳内へ挿入することが可能になります。

ベース部分には、記録装置への接続用の電極インターフェースボードが搭載されており、これにより、実験の開始時と終了時に動物を簡単に接続および取り外しすることが可能です。ベースに取り付けられたプラスチック製のコーンは、ラットケージ内の環境からマイクロドライブと電極を保護します。こんにちは、マサチューセッツ工科大学のPIKA学習・記憶研究所にあるMatt Wilsonの研究室のFaia Postmanです。

本日は、マイクロダイブアレイの作製プロトコルをご紹介します。当研究室では、これらのマイクロダイブアレイを用いて、ラットの脳内（例えば皮質や海馬など）の広範囲なニューロン集団から記録を行っています。まず、マイクロダイブアレイをどのように設計したかについて説明します。

それではワークショップへ移動し、SteveとStewartから、原材料の加工方法および、それらを完全に機能するデバイスへと組み立てる方法について説明を受けます。それでは始めましょう。プラスチック製のベースはコンピュータ設計ソフトウェアを用いて設計され、低コストな3Dプリンティングプロセスによって製造されています。

また、マイクロドライブアレイのその他のすべての構成要素についてもモデリングを行います。これにより、完成したドライブのサイズと重量を精密に制御することが可能になります。プラスチック製ベースの上部には、個々のマイクロドライブを装着するための穴が2列のリング状に配置されています。

3Dモデルをサービスビューローに送り、ステレオリソグラフィーを用いて、レーザー硬化性樹脂から設計通りの造形を行います。これには数日しかかからず、完成したパーツは軽量で再利用可能です。サービスビューローからパーツが届いたら、使用に向けて準備を行う必要があります。

それでは、ワークショップへ移動しましょう。3Dプリンティングプロセスでは小さな穴を確実にプリントすることができないため、モデルではより小さい直径の穴を指定します。その後、ワークショップにて、これらの穴を必要なサイズにドリルで開け、タップを立てます。

プラスチック製のベースを準備するために、61番、65番、および外周リング用の1.55 millimeterの3種類のサイズのドリルビットを使用します。61番のビットを装着したハンドドリルを用い、極低速で、後にマイクロドライブネジを挿入するための下穴を作成します。次に、65番のビットで穴を開けることにより、ベースの入口部分にあるマイクロドライブサポートチューブ用の穴を準備します。

より太い1.55 mmのビットを使用して、ベースを電極インターフェースボードおよび保護コーンに固定するための穴をドリルで開けます。マイクロドライブがスムーズに動作するように、内側の穴の列にステンレス製スリーブを挿入します。各スリーブは、ベースの上面と面が揃うまで、プライヤーで圧入してください。

次に、ネジのパイロット穴にネジ切りを行います。ピンバイスでタップを固定し、タップを立てる前に乾燥潤滑剤を塗布してください。隣接するスリーブに一時的に挿入した23ゲージのチューブと平行であることを確認し、タップとアライメントを合わせます。

インターフェースボードと保護コーンを固定するための穴にはネジ切りが必要です。これらの穴にも同様にハンドタップをかけます。プラスチックベースの設計では、ネジ切りの工程で最初のネジ山が損傷しないよう、各ネジのパイロットホールにタップスターターが設けられています。

すべてのパイロット穴にネジ切りが完了した後、これらのタップスターターはカッターナイフで簡単に折断できます。電極は、複数の電極ガイドチューブによって、ドライブ底部の単一の部位へと導かれます。

まず、すべての電極ガイドチューブを保持するためのコレクターカニューレを作成します。コレクターカニューレは、長さ1.5 centimeterのステンレス製チューブで作成します。このコレクターカニューレは、歯科用セメントで固定します。

接着性を高めるために、Dremelグラインディングホイールを用いてチューブの表面を注意深く粗くし、このカニューレをプラスチックベースの底部に挿入します。カニューレの5～7 mmがマイクロドライブアレイの外に残るように配置してください。外科的埋め込みを容易にするため、コレクターカニューレをプラスチックベースの底部に取り付けます。

歯科用アクリル樹脂を使用する場合は、少なくとも15分間硬化させてください。次に、カミソリでポリアミドを21個に切り分け、ガイドチューブを準備します。まず、21本のガイドチューブすべてをドライブベース底部のコレクターカニューレに挿入してください。

これにより、チューブがすべて互いに平行になります。束の中のチューブが緩すぎたりきつすぎたりする場合は、チューブの本数を減らして開始するか、必要に応じてチューブを追加してください。次に、ガイドチューブを1本ずつ取り外し、ドライブ上部のスリーブのいずれかに挿入します。

チューブを、チューブ束の背後にある左側の隙間から下に通します。ガイドチューブにねじれや急な曲がりがないか確認し、必要に応じて交換してください。各ガイドチューブの位置を調整し、スリーブの上端から1〜2 mm突出するようにします。

次に、コレクターカニューレの底部に、低粘度のsano acro lake glueを少量滴下します。接着剤がガイドチューブ内に流れ込まないよう十分注意してください。続いて、新しいカミソリを使用して、コレクターカニューレ底部にある余分なチューブの束を切り取ります。

ステレオ顕微鏡下で、チューブが適切に切断され、カニューレと面が揃っていることを確認します。各電極は個別のマイクロドライブで前進させるため、21個のマイクロドライブを作成し、それらをプラスチック製ベースに挿入する必要があります。各マイクロドライブは、カスタムネジと中空の支持チューブで構成されており、これらが互いに取り付けられています。

歯科用アクリル樹脂を用いて、電極を支持チューブに通します。ネジには、歯科用アクリル樹脂に埋め込まれる小さなリップが付いたネジ山のない部分があり、これによりネジが自由に回転できるようになります。ネジをプラスチックベースに回し入れることで、電極を前進または後退させます。

ネジの頭部は半円筒形をしています。マイクロドライブを作成する前に、このカスタムネジを回すためのドライバーを作成する必要があります。簡易ドライバーは、カスタムネジを用い、半円筒形の頭部を囲むリップ部分を完全に削り取ることで作製します。

ネジの頭を、完全に包み込まれるまで長さ5 cmの15ゲージチューブに挿入します。次に、ネジのネジ山に沿ってチューブを潰し、ネジをチューブに固定して回転しないようにします。ハンドルとして機能させるためにミニピンバイスを取り付ければ、ドライバーの完成です。

マイクロドライブは、ネジと支持チューブの周囲に歯科用アクリル樹脂を成形して作製します。使用する型は、プラスチックベースと同様に3Dプリンターで出力されたプラスチック製であり、底面に穴が開いているため、型にアクリルを流し込む際にネジと支持ポストの位置合わせを維持できます。まず、型の準備として、23ゲージの針を用いて支持チューブの穴を清掃し、タップを用いてネジ穴を清掃してネジを切ります。

これは、先ほどプラスチック製ベースに対して行った操作と同じ手順です。これで、マイクロドライブを作成するための金型が準備できました。歯科用アクリル樹脂が金型に付着するのを防ぐため、テフロンベースの潤滑剤で金型にコーティングを施します。

23ゲージのステンレス製サポートポスト（長さ14 mm）の上端2〜3 mmを研磨ホイールで粗くし、アクリル深部にしっかりと固定できるようにします。サポートポストをモールドの小さい方の穴に挿入し、ポストの上端がウェルの上端より上に来るようにします。ネジにテフロン系潤滑剤を薄く塗布し、ネジ山がウェルの底の直下に来るまでネジ穴に挿入します。

次に、歯科用アクリル樹脂を混合し、型に流し込みます。隅々まで行き渡らせるようにしてください。アクリル樹脂が硬化した後、針を使用すると気泡を取り除くのに役立ちます。

ネジを緩めることで、マイクロドライブを取り外すことができます。厳格な品質チェックを行ってください。アクリルにひび割れや気泡がないことを確認します。

ポストとネジが平行であり、横方向に動かないことを確認してください。ネジはスムーズに回転し、かつ遊びがない状態でなければなりません。不適切なマイクロドライブは、再利用パーツの中で選別して取り除いてください。21個の良好なマイクロドライブが揃うまで、この工程を繰り返します。

型に複数のウェルがある場合は、マイクロドライブとバッチをまとめて作成することで時間を短縮できます。各マイクロドライブをプラスチックベースの穴のペアに慎重に合わせます。ドライバーを使用してマイクロドライブのネジを回しながら、マイクロドライブ支持チューブをポリマーガイドチューブに被せ、メタルスリーブの中に挿入します。

この操作は困難な場合があります。マイクロドライブを降ろす際、ガイドチューブがバックルに引っかからないよう、ベースの中央を注意深く確認してください。すべてのマイクロドライブが所定の位置に配置され、完全に降ろされたら、少量の acrylic をドライブの中央に滴下し、ガイドチューブの束を固定します。

アクリルを15分間硬化させます。アクリルが乾燥したら、各マイクロドライブを約3mm後退させるため、マイクロドライブの上面図の概略図を作成し、各マイクロドライブに固有の名前または番号を割り当てます。次に、実体顕微鏡で観察しながら、ドライブを上下反転させ、コレクターカニューレとガイドチューブの底面の写真を撮影します。

以降の手順で参照できるように、写真のプリントアウトを用意します。次に、ドライブを逆さまにした状態で、各ガイドチューブに細いポリアミド製キャリアチューブを、マイクロドライブの上端から出るまで挿入します。どのガイドチューブがどのマイクロドライブに対応しているかを写真に書き留めておいてください。

キャリアチューブは、後に繊細な電極線を保護および支持します。これはマイクロドライブを貫通します。各キャリアチューブを、マイクロドライブ支持チューブの上端から1 cm上の位置まで伸ばし、5分硬化型エポキシ樹脂または高粘度の瞬間接着剤でキャリアチューブを支持チューブに接着します。

この手順では細心の注意を払ってください。接着剤がサポートチューブの内側に流れ落ちると、サポートチューブが固定ガイドチューブに固着し、そのマイクロドライブが使用不能になる可能性があります。これが、キャリアチューブを挿入する前にマイクロドライブを上げる理由です。

すべてのキャリアチューブを接着して固定したら、マイクロドライブを再び完全に下げ、新しいカミソリの刃を使用して、ドライブの底部ですべてのキャリアチューブを面一に切り落とします。次に、鋭いハサミを使用して、マイクロドライブの上端から1〜2 mm上の位置でキャリアチューブを切断します。最後に、電極インターフェースボードをドライブベースの上に配置し、2本のネジで固定します。

この時点で、ドライブアレイに電極と実験装置をロードする準備が整いました。通常、テトロ（tetro）と呼ばれる4チャンネルのマイクロワイヤ電極を使用しますが、あらゆる種類の電極を使用することが可能です。テトロの作製方法、マイクロドライブへのロード方法、および外科的植込のためのドライブアレイの準備手順については、他のJoVEビデオで解説しています。

このプロトコルは、そのまま直接的に、あるいはニーズに合わせて変更して使用することができます。例えば、より深い脳構造から記録を行うために、より長いネジを必要とする研究者もいるでしょう。また、複数の脳部位を標的とするドライブを設計したいと考える場合もあるかもしれません。

わずかな変更を加えることで、この設計はマウスのようなより小型の動物に使用するために小型化することも可能です。電極位置のリモート調整を可能にする電動マイクロドライブを使用することもできます。ここでは、ラットの頭部に植え込み、動物が実際に動作している間に大量のニューロン集団から記録を行うことができるマイクロドライブアレイの設計および作製方法について説明しました。この手順を行う際は、マイクロドライブのネジが滑らないよう、プラスチックベースの穴に慎重にねじ込むことが重要です。

作製したマイクロドライブの厳格な品質チェックを行います。ネジとサポートチューブが平行であること、およびネジに遊びがなくスムーズに回転することを確認してください。接着剤や歯科用アクリル樹脂を使用する際は、誤ってチューブを詰まらせないように注意してください。

最後に、MyDriveアレイを完成させ、手術を行う前に、tetroおよび低用量（low dose）をドライブ内に作製する必要があることを忘れないでください。これについては別のJoVEビデオ記事で解説しています。以上で完了です。

ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。