慢性のためのマイクロドライブアレイ in vivoで録音：四極管アセンブリ

本プロトコルでは、覚醒状態のげっ歯類における長期的なin vivo記録のために、4本の電極からなるTetrosバンドルの作製および留置について説明します。まずTetroの作製を開始します。マイクロ電極ワイヤーのストランドを2回折り畳み、4本の平行なワイヤーのバンドルを作成します。次に、これらのワイヤーをまとめてねじり、ホットエアガンで加熱処理を行います。

完成した各テロは保存ボックスに配置されます。さらにテロを製作する間、各テロはリニアアクチュエータの開口部から入り、マイクロドライブアレイの底部から出る専用の経路に挿入されます。テロの4本のワイヤはそれぞれ、マイクロドライブアレイの上部に固定された出力コネクタボードの個別のピンに接続されます。

金電解メッキ処理を用いて、teroの各チャネルのインピーダンスを低下させます。すべてのteroの設置と電解メッキが完了した後、2本の接地線をコネクタボードの respective pins に接続し、接地処理を施した保護用コーンをマイクロドライブアレイのフレームに固定します。これで、植え込み可能な、正常に機能するTeroマイクロドライブアレイが完成しました。こんにちは、ピックアウト学習・記憶研究所のナット・ウィルソン研究室のデーブ・ニアンです。

本日MITでは、テロスの作製、テロスの装着、およびマイクロドライブ再構築の最終段階の手順について説明します。当研究室ではこの手順を用いて、覚醒し行動している動物個体において、大規模な細胞集団とニューロン間の協調的な神経活動を研究しています。それでは始めていきましょう。

標準的なマイクロドライブアレイ用のテロ（tero）を作成するために、まず50 centimeterの長さの絶縁済み12 micronマイクロメWireを用意します。ワイヤーを半分に折り、指で沿わせるようにして2本のワイヤーを密着させます。2本のワイヤーが全長にわたって良好に接触していることを確認してください。

両端を合わせて、ペアを再度折り畳みます。一方の端に形成されたループにねじれがないことを確認してください。ループのない側の4本のワイヤーを、4つの先端が揃うように切断します。

次のステップでは、改造したワニ口クリップ、電動回転装置、および回転装置上部の水平バーが必要になります。ワニ口クリップは、クリップの基部にプラスチックバーを接着して改造したものです。チップが露出している状態で、4本のワイヤーを改造したワニ口クリップで一緒に固定してください。

ワイヤのループを水平バーに掛けます。アリゲータークリップを電動ステージに設置します。約3分間かけて、ワイヤ束に時計回りに80回、続いて反時計回りに40回のねじりを加えます。

これらのパラメータは、必要に応じて変更可能です。テロツイスト（tero twisting）が完了した後、ヒートガンの風量を中から低に設定し、3つの異なる角度から加熱してワイヤ同士を融着させます。加熱は、ワイヤ束が分かれている箇所の1～2 cm下から開始してください。その後、ワイヤから2 cmの距離を保ちながら、ヒートガンを上下に約5秒間動かします。

高温になると絶縁体が完全に溶けて短絡につながるため、注意してください。電線が融合したので、ワニ口クリップをそっと持ち上げてテロへの張力を緩め、ねじり装置からテロを取り出し、ワニ口クリップの近くでテロを切断します。反対側では、ブランド表記のない4本の電線が等長になるようにループを切断します。次に、先端の柔らかいピンセットで電線をそっと曲げ、個々のストランドを分離させます。

これでteroをマイクロドライブアレイにロードする準備が整いました。さらに21〜25本のTet roadを作成し、teroのロード工程に進むまで防塵ボックスに保管してください。まだマイクロドライブアレイを構築していない場合は、完全なアレイを用意する必要があります。

設計計画における慢性in vivo記録用マイクロ電極駆動アレイの作製について、ビデオのマイクロ電極駆動アレイを参照してください。テロの一端をコネクタハードウェアに取り付け、マイクロドライブ内のポリミドキャリアチューブに通すことで、電極チップがマイクロドライブアレイの底部より下に延びるようにします。それでは、1本のテロを用いたこのロード工程を実演します。

開始する前に、片端をコネクタボードに取り付け可能で、もう片端を氷を入れたパンで固定できるドライブホルダーを作成します。この例では、ドライブホルダーはMilaxコネクタをX-Actoナイフのハンドルの片端に接着したものです。ソフトチップピンセットでTetrodeを保持し、実体顕微鏡を使用して、Tetrodeの先端をマイクロドライブのポリミドキャリアチューブに挿入します。個々の電極線がドライブアレイ上部のコネクタボードに近づくまで、Tetrodeをチューブに押し込みます。この際、電線を曲げないように注意してください。電線を曲げてしまうと、Tetrodeが脳に対して垂直ではなく角度を持って進入することになり、Tetrodeの整合性が損なわれます。

次に、ソフトチップピンセットを使用して、4本のワイヤの反対端を電極インターフェースボードのそれぞれの穴にゆっくりと挿入します。ここでも、ワイヤを折り曲げたり、ねじったりしないように注意してください。4本のワイヤがすべて所定の位置に収まったら、下顎を短く加工したプライヤーを使用して、金ピンを穴に押し込みます。

ピンを穴に押し込むと、電線の絶縁被覆が剥がれ、後の参照のための電気的接続が形成されます。マイクロドライブと電極インターフェースボード上のピン位置とのマッピングを記録しておいてください。合計18本のテトロードの装着を続けてください。

アレイに残りの3つのマイクロドライブは、参照電極の設置に使用します。各参照電極は、ボンディングされていない4つのynのうち1つのみを使用したteroで構成されています。参照電極を取り付けるには、ローディング手順に従いますが、4つの電極のうち1つだけをコネクターボードの対応する参照電極ピンに取り付けてください。

複数部位での記録を計画している場合は、テトロからコネクタボードへの接続をあらかじめ計画しておくことが有益です。例えば、同一の解剖学的領域をターゲットとするテトロを電極インターフェースボード上でまとめて配置してください。これにより、実験中に誤ったテトロを調整してしまう可能性を最小限に抑えることができます。

テロのロードが完了したら、動物用と保護コーン用の2本の接地線を作成します。長さ6インチの被覆鋼線を1本切り、金属製ピンセットを使用して、ワイヤーの両端から3 mmの被覆を取り除きます。次に、長さ4インチの被覆鋼線を1本切ります。

片端から3 mm、もう片端から1 cmの絶縁材を取り除きます。6インチの接地線をマイクロドライブアレイ側面の穴に通し、インターフェースボードに向けて配線します。露出した線をゴールドピンを用いて、電極インターフェースボードの指定された接地穴に接続します。

このワイヤーを動物の頭蓋骨に接続します。4インチの接地ワイヤーを、 previously installed ground wire（以前に設置した接地ワイヤー）と平行に配線します。3mm剥離した端部を、別の指定された接地穴にあるゴールドピンを使用して電極インターフェースボードに接続します。

このワイヤーは後で保護用コーンに接続されます。このコーンは小型のファラデーケージとして機能し、ノイズの混入を低減します。これでワイヤーの接続が完了したため、テロスの調整に進むことができます。この工程の目的は、すべてのテロスを、対象となる脳構造の深さよりもわずかに長い長さにカットすることであり、本例でもそのように行います。

マイクロドライブは、最大5〜6 mmの移動距離が設計されており、成体ラットの多くの新皮質領域および背側海馬に到達するのに十分な距離です。まず、すべてのマイクロドライブを下げて、テトロードが同時に最大限に露出するようにします。次に、鋭利な精密鋏を用いて、最終的な目標長より約5 mm長い長さにすべてのテトロードをカットします。

氷を入れたパンの中に切り込み付きの鋏を準備し、片方のハンドルをわずかに下向きに、切り込み面を上に向けて固定し、もう片方のハンドルはぶら下げた状態にします。次に、マイクロドライブを回して、すべてのTet電極をガイドカニューレの中に完全に引き戻します。実体顕微鏡を使用して、1本の電極をカニューレから完全に伸長させます。

定規を使用して、ガイドからカニューレまでの所望の距離にギザギザのハサミを配置します。ゆっくりと丁寧に、一度の滑らかな動作でテロを切断します。テロを切断した後、マイクロドライブを3〜4 mm上に引き上げます。

すべてのテロをカットするまで、この工程を繰り返します。これで金メッキの準備が整いました。金メッキを行います。

長期的に安定した記録を行うには、ro terosが不可欠です。これにより腐食を防ぎ、生体適合性を向上させることができます。インピーダンスメーターを外部モードに設定し、電流発生器とオーディオ出力付きのDCチェックモードに設定してください。

電流発生器の2本のリード線を、各テロ内の6通りの可能なチャンネルペアに接触させ、オーディオフィードバックを用いてペア間にショートがあるかを確認します。チャンネルペア間のショートは次のような音がします。ショートがある場合は、ギザ刃のハサミでテロを切り直し、再度テストしてください。

問題が解決しない場合は、Tetロードを廃棄し、交換してください。すべてのマイクロドライブを下に移動し、すべてのTetロードを最大限に伸ばします。電極インピーダンスをチェックするための装置構成を変更します。

次に、すべてのteroの先端を標準金メッキ溶液のバスに浸します。金バスはインピーダンスメーターの負極リードに電気的に接続されています。インピーダンスメーターの正極リードをコネクタボードの対応するピンに接触させ、電極のインピーダンスを確認してください。

マイクロドライブアレイのすべての電極のインピーダンスを測定し、記録します。電流発生器における正常値は1～3 MΩの範囲です。電流は1～3 µAに設定してください。

次に、しっかりと固定します。インピーダンスメーターの正極リードをコネクタボードのピンに取り付けます。インピーダンスメーター側で操作します。

バイパスモード中に、通常モードからバイパスモードへ、そして再び通常モードへと迅速に切り替えます。電流がTet道路と金溶液を通過し、電極の先端に金がメッキされます。各メッキ回後のインピーダンスは、その前よりも低くなる必要があります。

現在のパルスを繰り返します。インピーダンスが1 MΩ以下に低下しなかった場合は、再度行ってください。許容されるインピーダンスの保守的な範囲は 250 kΩから350 kΩです。

インピーダンスが200 kΩを下回った場合、短絡（ショート）している可能性があります。繰り返しパルスを印加してもインピーダンスが十分に低下しない場合は、電極先端が閉塞している可能性があります。その場合は、再度カットして短絡を確認し、金メッキ工程を繰り返してください。

再切断で改善しない場合は、teroを交換して最初からやり直してください。すべてのteroのプレーティング後、ethanolに浸し、3〜5分間乾燥させます。teroの先端を空気にさらした状態で電流発生器を用い、tero内部の短絡をテストしてください。

2つ以上のテロの間でDC接続がある場合は、テロを切り直し、再度金コーティングを行ってください。すべてのテロの金コーティングが完了したら、すべてのテロをドライブに移動させます。最後のステップとして、各マイクロドライブの上部にある各テロとポリチューブの接合部に、中程度の粘度のシアノアクリレート接着剤を1滴加えます。

これにより、teroをマイクロドライブに固定します。保護コネクタの目的は、マイクロドライブと露出したteroワイヤを外部環境から保護することです。また、実験中の操作時のサポートを提供し、電気的ノイズを低減します。

ここでは3Dプリンターで作成したプラスチック製コーンを使用していますが、曲げたアルミ缶などの他の材料でコーンを作成することも可能です。また、プラスチック製コーンの内側または外側にアルミ箔テープを貼って固定することもできます。

まず、ドライブアレイを吊り下げた状態で、3 1 72サイズのネジ（長さ3/16インチ）3本をコーンの側面に挿入し、部分的に回します。コーンをドライブに被せます。両方の接地線がドライブアレイの底部から伸びていることを確認してください。

4インチの接地線の露出部分を1 72ネジの1本に数回巻き付け、ネジを締め付けます。残りの2本のコーンネジを締めて、コーンをドライブベースにしっかりと固定します。これでマイクロドライブアレイの作製は完了です。3つのリファレンスに18個のテロがロードされたマイクロドライブアレイが完成しました。

耐久性を高めるため、保護用のコーンとキャップで覆われています。完成したドライブの重量は、平均して通常 20 to 25 grams です。

完成したドライブアレイは、標準的な外科的手順を用いて植え込まれます。見ての通り、ドライブはプリアンプチップと、データ収集ハードウェアおよびソフトウェアに信号を伝送するワイヤーバンドルに接続されています。以上で、terosの作製方法とマイクロドライブアレイ構築手順の全工程を説明しました。

このビデオでは、テロスの作製方法、およびin vivo記録のためのテロスの装填とコンディショニングについて解説しました。さらに、マイクロドライバーアレイにコーンを追加し、長期的な堅牢性を高める方法についても示しました。マイクロドライバーアレイの構築には多くの工程があるため、忍耐強く、電極を丁寧に扱い、すべての中間ステップが適切に完了していることを確認してください。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。