慢性のためのマイクロドライブアレイ in vivoで録音：四極管アセンブリ

このプロトコルでは、覚醒状態のげっ歯類における慢性的なin vivo記録のために、4本の電極からなるTetrosバンドルの作製と留置について説明します。まず、テトロの作製を開始します。マイクロ電極線のストランドを2回折り畳み、4本の平行なワイヤの束にします。その後、これらのワイヤをまとめてねじり、ホットエアガンで加熱処理します。

完成した各teroを保管ボックスに入れます。さらにteroを作製しながら、各teroをリニアアクチュエータの開口部から導入し、マイクロドライブアレイの底面から出る専用のパスに挿入します。teroの4本のワイヤをそれぞれ、マイクロドライブアレイの上部に固定された出力コネクタボードの個別のピンに接続します。

金電解メッキプロセスを用いて、Teroの各チャネルのインピーダンスを低下させます。すべてのTeroの設置および電解メッキが完了したら、2本の接地線をコネクタボードの respective pins に接続し、接地した保護コーンをマイクロドライブアレイのフレームに固定して保護します。これで、植え込み準備が整った機能的なTeroマイクロドライブアレイが完成しました。こんにちは、Pickout Institute for Learning and MemoryのNat Wilson研究室のDave Nianです。

本日はMITにて、テロス（teros）の作製、テロスへの充填、およびマイクロドライブ再構築の最終段階の手順について解説します。当研究室ではこの手法を用いて、覚醒し行動している動物の個体において、大規模な神経細胞集団と個々のニューロン間の協調的な神経活動を研究しています。それでは始めましょう。

標準的なマイクロドライブアレイ用のテロを構築するために、まず絶縁された12 micronのマイクロメWireを50 centimeter分用意します。Wireを半分に折り、指で2本のWireに沿ってなぞり、密着させます。2本のWireが全長のいたる所で十分に接触していることを確認してください。

両端を合わせて、ペアを再度折り曲げます。このとき、片端にできたループにねじれがないように注意してください。ループのない側の4本のワイヤーを、4つの先端が揃うように切断します。

次のステップでは、改造したワニ口クリップ、電動回転装置、および回転装置の上の水平バーが必要になります。ワニ口クリップは、クリップのベースにプラスチックバーを接着して改造します。先端が露出している状態で、4本のワイヤーを改造したワニ口クリップで一緒に固定してください。

ワイヤーのループを水平バーに掛けます。アリゲータークリップを電動ステージに設置します。約3分かけて、ワイヤー束に時計回りに80回、続いて反時計回りに40回のねじりを加えます。

これらのパラメータは必要に応じて変更可能です。テロツイスト（tero twisting）が完了した後、ヒートガンを用いて3つの異なる角度から加熱し、ワイヤー同士を融合させます。各角度で中から低流量の風量を設定し、ワイヤー束が分かれる箇所の1〜2 cm下から加熱を開始してください。その後、ワイヤーから2 cmの距離を保ちながら、ヒートガンを上下に約5秒間動かします。

高温になると絶縁体が完全に溶けて短絡の原因となるため、注意してください。電線が融合したところで、アリゲータークリップをそっと持ち上げてteroへの張力を緩め、ねじり装置からteroを取り外し、アリゲータークリップ付近でteroを切断します。もう一方の端では、ブランド表示のない4本の電線が等長になるようにループを切断します。次に、先端の柔らかいピンセットで電線をそっと曲げ、個々のストランドを分離させます。

これでteroをマイクロドライブアレイにロードする準備が整いました。Tet roadをさらに21〜25個作成し、teroのロード工程に進むまで防塵ボックスに保管してください。まだ作成していない場合は、完全なマイクロドライブアレイが必要になります。

設計プランにおける慢性in vivo記録用マイクロ電極駆動アレイの作製について、ビデオを参照してください。テロの一端をコネクタハードウェアに取り付け、マイクロドライブのポリミドキャリアチューブの中に通すことで、電極チップがマイクロドライブアレイの底部より下に突き出るようにします。それでは、1本のテロに対するこのロード工程を実演します。

開始する前に、一方の端をコネクタボードに取り付け可能で、もう一方の端を氷盤で固定できるドライブホルダーを製作します。この例では、ドライブホルダーとして、X-Actoナイフのハンドルの一端にMilaxコネクタを接着したものが使用されています。テトロード（tetrode）をソフトチップピンセットで保持し、実体顕微鏡を用いて、テトロードの先端をマイクロドライブのポリミッド（polyimide）キャリアチューブに挿入します。テトロードをチューブに押し込み、個々の電極線がドライブアレイ上部のコネクタボードに近づくまで挿入してください。この際、電極線を曲げないように注意してください。曲がると、テトロードが脳に対して垂直ではなく角度を持って進入することになり、テトロードの完全性が損なわれます。

次に、ソフトチップピンセットを使用して、4本のワイヤーのもう一方の端を電極インターフェースボードのそれぞれの穴にゆっくりと差し込みます。ここでも、ワイヤーを折ったり曲げたりしないように注意してください。4本のワイヤーがすべて所定の位置に収まったら、下顎を短く加工したプライヤーを使用して、ゴールドピンを穴に押し込みます。

ピンを穴に押し込むと、電線の絶縁被覆が剥がれ、後の参照のための電気的接続が形成されます。マイクロドライブと電極インターフェースボード上のピン位置とのマッピングを記録しておいてください。合計18本のテトロードの装着を続けてください。

アレイ上の残りの3つのマイクロドライブは、参照電極の保持に使用します。各参照電極は、未接合のynsのうち1つのみを使用するteroで構成されています。参照電極を取り付ける際は、ロード手順に従いますが、4つの電極のうち1つのみをコネクタボード上の対応する参照電極ピンに取り付けてください。

多点記録を計画している場合は、テトロ（tetro）からコネクタボードへの接続をあらかじめ計画しておく価値があります。例えば、同一の解剖学的領域を標的とするテトロを電極インターフェースボード上でまとめて配置してください。これにより、実験中に誤ったテトロを調整してしまう可能性を最小限に抑えることができます。

テロのロードが完了したら、動物用と保護コーン用の2本の接地線を作成します。6インチの長さの絶縁鋼線を1本切り、金属製ピンセットを使用して、電線の両端から3 mmの絶縁被覆を取り除きます。次に、4インチの長さの絶縁鋼線を1本切ります。

片端から3 mm、もう一方の端から1 cmの絶縁材を取り除きます。6インチの接地線をマイクロドライブアレイ側面の穴に通し、インターフェースボード方向へ配線します。露出した線を、指定された接地穴にあるゴールドピンを用いて電極インターフェースボードに接続します。

このワイヤーを動物の頭蓋骨に接続します。4インチの接地用ワイヤーを、先に設置した接地用ワイヤーと平行に配線します。3mm剥離した端端を、別の指定された接地穴にあるゴールドピンを用いて電極インターフェース基板に接続します。

このワイヤーは後で保護コーンに接続されます。このコーンは小さなファラデーケージとして機能し、ノイズの混入を低減します。これでワイヤーの接続が完了しましたので、テロスの調整に進みます。この工程の目的は、すべてのテロスを、標的となる脳構造の深さ（および本例）よりもわずかに長い長さにカットすることです。

マイクロドライブは、成体ラットの多くの新皮質領域および背側海馬に到達するのに十分な、最大5〜6 mmの移動距離に対応するように設計されています。まず、すべてのテトロードが同時に最大限に露出するように、すべてのマイクロドライブを下げます。次に、最終的な目標長よりも約5 mm長くなるようにすべてのテトロードを切断し、最後のカットには鋭い精密鋏を使用してください。

ギザ刃のハサミを氷水を入れたパンの中に用意し、片方のハンドルをわずかに下向きに、ギザ刃を上向きにして固定し、もう片方のハンドルは吊り下げたままにします。マイクロドライブを回して、すべてのTET電極をガイドカニューレの中に完全に引き戻します。実体顕微鏡を使用して、1本のTET電極をカニューレから完全に伸長させます。

定規を使用して、ガイドからカニューレまで、目的の距離にギザ刃のハサミを配置します。ゆっくりと慎重に、一度のスムーズな動作でteroを切断します。teroの切断後、マイクロドライブを3〜4mm上に引き上げます。

すべてのteroをカットし終えるまで、この工程を繰り返します。これで金メッキの準備が整いました。金メッキ工程に移ります。

長期的な安定記録には、ro terosが不可欠です。これにより腐食が防止され、生体適合性が向上します。インピーダンスメーターを、カレントジェネレーターの外部モード、およびオーディオ出力付きのDCチェックモードに設定してください。

電流ジェネレーターの2本のリード線を、各tero内の6通りのチャンネルの組み合わせに接触させ、オーディオフィードバックを用いてペア間にショートがあるかを確認します。チャンネルペア間のショートは次のような音がします。ショートがある場合は、ギザ歯のハサミでteroを切り直し、再度テストしてください。

問題が解決しない場合は、Tet roadを廃棄し、新しいものと交換してください。すべてのマイクロドライブを下方へ移動させ、すべてのTet roadを可能な限り外側まで伸ばします。電極インピーダンスを確認するための装置構成を変更してください。

次に、すべてのテロの先端を標準金メッキ溶液のバスに浸します。金メッキバスはインピーダンスメーターの負極リードに電気的に接続されています。インピーダンスメーターの正極リードをコネクターボードの対応するピンに接触させ、電極のインピーダンスを確認してください。

マイクロドライブアレイのすべての電極線のインピーダンスを測定し、記録します。電流発生器における標準値は1から3MΩの範囲です。電流は1から3µAに設定してください。

次に、確実に接続します。インピーダンスメーターの正極リードをコネクタボードのピンに取り付けます。インピーダンスメーター側で操作します。

バイパスモード中に、通常モードからバイパスモードへ、そして再び通常モードへと迅速に切り替えます。これにより、電流がTet路および金溶液を通過し、電極チップに金がメッキされます。メッキを1回行うごとに、インピーダンスが前回よりも低下しているはずです。

現在のパルスを繰り返します。インピーダンスが1 MΩまで低下しなかった場合、許容されるインピーダンスの保守的な範囲は250 kΩから350 kΩです。

インピーダンスが200 kilo ohmsを下回った場合、短絡（ショート）している可能性があります。繰り返しパルスを印加してもインピーダンスが十分に低下しない場合は、電極先端が閉塞している可能性があります。その場合は再度カットを行い、短絡を確認した上で、金メッキ工程を繰り返してください。

再研磨で改善しない場合は、teroを交換して最初からやり直してください。すべてのteroをプレートに配置した後、エタノールに浸し、3〜5分間乾燥させます。teroの先端を空気にさらした状態で、電流発生器を用いてtero内部のショートを確認してください。

2本以上のtero電極間にDC接続がある場合は、teroを切り直し、再度金メッキを施してください。すべてのteroの金メッキが完了したら、すべてのteroをドライブに移動させます。最後の工程として、各マイクロドライブの上部にある、各teroとポリチューブの接合部に中粘度のシアノアクリレート接着剤を1滴塗布してください。

これにより、teroをマイクロドライブに固定します。保護コネクタの目的は、マイクロドライブと露出したteroワイヤを外部環境から保護することです。また、実験中のハンドリングのサポートとなり、電気的ノイズを低減させます。

ここでは3Dプリントされたプラスチック製のコーンを使用しています。ただし、曲げたアルミ缶などの他の材料でコーンを作製することも可能です。また、プラスチック製のコーンの内面または外面にアルミ箔テープを貼付して使用することもできます。

まず、ドライブアレイを吊り下げた状態で、3 1 72サイズの長さ3/16インチのネジを3本、コーンの側面に挿入して部分的に回します。コーンをドライブに被せます。両方の接地線がドライブアレイの底部から伸びていることを確認してください。

4インチの接地線の露出部分を1 72スクリューのいずれかに数回巻き付け、スクリューを固定します。残りの2本のコーンスクリューを締め付けて、コーンをドライブベースにしっかりと固定します。これでマイクロドライブアレイの製作は完了です。作成したマイクロドライブアレイには、3つのリファレンスに計18個のテロスがロードされています。

耐久性を高めるため、保護用のコーンとキャップで覆われています。完成したドライブの重量は、平均して通常 20 to 25 grams です。

完成したドライブアレイは、標準的な外科的手順を用いて植え込まれます。見ての通り、ドライブはプリアンプチップと、データ収集ハードウェアおよびソフトウェアに信号を伝達するワイヤー束に接続されています。以上で、terosの作製およびマイクロドライブアレイの構築手順の完了方法について説明しました。

このビデオでは、terosの作製方法、および生体内で記録を行うためのterosへの充填とコンディショニング方法について解説しました。さらに、時間の経過に伴う堅牢性を高めるために、マイクロドライバーアレイにコーンを追加する方法についても示しました。マイクロドライバーアレイの構築には多くの工程があるため、根気強く、電極を丁寧に扱い、すべての途中工程が適切に完了していることを確認してください。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験が成功することを願っております。