インフルエンザウイルスリボ核タンパク質複合体の精製と可視化

この手順は、インフルエンザから破片を取り除くことから始まります。遠心分離によるウイルス溶液。次に、ウイルス膜を界面活性剤で破壊し、VR npsへの放出をグリセロール勾配で分離します。

グラジエントから遠心分離画分を回収し、各画分のアリコートを実行します。SDSページでは、クマシブルーで染色したゲルをクマシブルーで染色し、V NPSを含むピーク画分、V NPSを含む画分を決定し、遠心分離によって濃縮し、精製したVRPを銅TEM試料グリッドに適用し、透過型電子顕微鏡でVRPを可視化するために陰性染色を行います。こんにちは、私はブリティッシュコロンビア大学動物学部のネリーペイン博士の研究室のWinCo Wuです。

私はLindsay Weaver、以前はPane Labに所属していました。今日は、ウイルスの肋骨核タンパク質複合体であるインフルエンザの精製手順をお見せします。当研究室では、この手順を用いて、組織培養細胞におけるインフルエンザA型ウイルスの核内インポートを研究しています。

それでは始めましょう。750マイクロリットルのMNTバッファーを1本の11ミリメートル×34ミリメートルのベックマンポリカーボネート遠心分離管に注入して実験を開始する。次に、インフルエンザ、Aウイルスの2ミリグラム/ミリリットル溶液の500マイクロリットルをチューブピペットに数回上下させて、ウイルスをMNTバッファーと混合します。

混合後、チューブをA TLA one 20.2ローターに入れ、Beckman Optima max E遠心分離機で摂氏4度でGの109,000倍で10分間遠心分離します。スピンが終了したら、上清を取り除き、その後、ペレットを500マイクロリットルの破壊バッファーボルテックスに懸濁します。再懸濁したペレットを激しく撫でた後、einorサーモミキサーで摂氏31度で20分間振とうします。

振とうが完了したら、グリセロール勾配沈殿物速度遠心分離を進めます。グリセロールグラジエントを調製するには、次のグリセロールをベックマンUltraClear13ミリメートル×51ミリメートルの遠心分離チューブ、1ミリリットル70体積グリセロール0.75ミリリットル50%グリセロール0.375ミリリットル、40%グリセロール、および1.8ミリリットル、33%グリセロールに入れます。これらのグリセロール溶液は、純粋なグリセロールとNMバッファーを混合することによって作られます。

また、グリセロールとバッファーの両方を含むバランスチューブを準備します。次に、破壊されたウイルスサンプルを再度ボルテックスし、グリセロールグラジエントにロードします。チューブをベックマンMLS 50スイングバケットローターに入れ、摂氏4度でGの217,000倍で3時間45分間勾配を遠心分離します。

遠心分離が完了したら、チューブの上部からグラジエントの250マイクロリットルのアリコートを手動で収集します。フラクションを氷の上または摂氏4度に保ちます。フラクションが収集されたら、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用してそれらを分析する準備が整います。

SDSページの分析を開始するには、各フラクションから20マイクロリットルを新しいチューブに移します。次に、5マイクロリットルのSDSページサンプルバッファーを5倍追加し、サンプルを摂氏95度に加熱して5分間加熱した後、サンプルを短時間スピンダウンし、ウェルの1つに分子量マーカーを含む10%ポリアクリルアミドゲルにロードします。次に、ブロムフェノールブルーローディング色素がゲルの底部近くに達するまで、サンプルをゲルに通します。

SDSページ装置からゲルを取り出し、ゲルをクマシブルーで染色します。染色結果に基づいて、主にインフルエンザを含む画分を特定します。核タンパク質。

インフルエンザA NPのサイズは約56キロダルトンで、ウイルスのリボ核タンパク質複合体に見られる主要なタンパク質です。したがって、NPバンドは一般に、VRN psを含む分数で最も強いバンドです。次のパートでは、これらのVRNP分数を集中させます。

NPを主成分とするグリセロール画分を組み合わせ、2本のベックマン11mm×34mmポリカーボネート製遠心分離管に分配し、各チューブにエチルパイロカーボネートまたはDEPC処理した超純水を入れます。次に、数回上下にピペットで動かして混ぜます。チューブをベックマンTLA one 20.2ローターに入れ、摂氏4度でGの157,000倍で4時間半遠心分離します。

スピンが完了したら、上清を取り除き、ペレットを再懸濁します。50マイクロリットルのDEPC処理水アリコートでは、精製されたV NPSは1つのアリコートを取っておき、他のアリコートを摂氏マイナス80度で保存します。これで、VRPのネガティブ染色を進める準備が整いました。

精製されたVRNPの1マイクロリットルを、新しく作られ、2回ろ過されたPBSバッファーグロー放電の9マイクロリットルに希釈し、銅TEM試料グリッドを30秒間放電します。このグリッドは、以前はパーローディオンとカーボンフィルムでコーティングされていました。ピンセットを使用して、新たに光る放電試料グリッドを保持し、希釈したVRNPを5マイクロリットル滴で試料グリッドに塗布します。

待っている間、ドロップがグリッドに吸収されるのを8分間待ちます。トレイにパルファムの小さなストリップを置き、PBSバッファーのそれぞれ10マイクロリットルを含む2滴と、1%メリナツのアンモニウムデートで構成される作りたての染色溶液の80マイクロリットルの滴をパルファムに分配します。次に、試料グリッドをPBSの2滴に慎重に下げて、合計1分間洗浄します。

次に、濾紙を使用して、試料グリッドを乾燥させずに試料グリッドから試料溶液の一部を吸い取ります。試料グリッドから最後のバッファーを吸い取った直後に、試料グリッドを染色液滴内に完全に沈めました。そして、1分待ちます。

1分後、新しい濾紙を使用して、試料グリッドから染色液を完全に吸い取ります。観察する前に、試料グリッドを数分間風乾させます。透過型電子顕微鏡下では、陰性に染色されたV npsの代表的な透過型電子顕微鏡画像を示します。

このように、V NPSは、長さが約30ナノメートルから120ナノメートルの可変長の棒状の粒子に似ています。オリゴマーNPは、NP分子の鎖として組織化されており、さらに二重らせん状の繰り返し構造に折り畳まれています。そのため、これらの棒状の粒子の両端にループが見られることがあります。

浄化して視覚化する方法を紹介しました。A ウイルス肋骨核タンパク質複合体 この手順を行うとき。ネガティブ染色に小便器アセテートを使用している場合は、VR mpsを希釈するときにPBSを使用しないことが重要です。

というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。