Name: インフルエンザウイルスリボ核タンパク質複合体の精製と可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 学ぶインフルエンザAウイルスリボ核タンパク質複合体（vRNP）の精製と可視化法。遠心分離とグリセロール勾配を用いてvRNPを精製し、透過型電子顕微鏡で観察する手法を解説。ウイルス構造研究に有用です。

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この作品は、イノベーションのためのカナダ基金（CFI）、健康研究（CIHR）のカナダの研究所、およびカナダ自然科学工学研究評議会（NSERC）からの補助金によって支えられている。

パート1：インフルエンザの破壊ビリオン<ol><li>ベックマンオプティマで使用するためのTLA - 120.2ローターに収まるように設計されたものベックマンポリカーボネート遠心管（11ミリメートル× 34ミリメートル）にMNTバッファー750μlの（20mMのMES、150mMのNaCl、30mMトリス、pH 7.5）を追加するマックス- Eの超遠心機。 </li><li>そのチューブに、インフルエンザウイルス（2 mg / mlのH3N2 X - 31 A/AICHI/68株）500μlを添加します。数回上下にピペッティングしてMNTバッファを使ってウイルスを混ぜる。 </li><li> TLA - 120.2ローターを使用してベックマンオプティママックス- Eの遠心機で、109000 × gで、4℃で10分間遠心します。 </li><li>上清を除去し、500μlの混乱のバッファーでペレットを再懸濁さは（100mMのKCl、5 mMのMgCl 2、5％（w / v）のグリセロール、50 mMのオクチルグルコシド、10 mg / mlのリゾレシチン、1.5mMのジチオトレイトール、100mMのMES、 pHは5.5）。 </li><li>渦は精力的にし、エッペンドルフのサーモミキサーで20分間31℃で振とうする。 </li></ol>パート2：グリセロール勾配土砂速度遠心<ol><li> 1 mlの70％（v / v）グリセロール、0.75ミリリットル、50％グリセロール、0.375ミリリットル40％グリセロール、および1.8：ベックマンultraclearの遠心管（13ミリメートル× 51ミリメートル）にグリセロールの以下の量を配置することによって、グリセロール勾配を準備ミリリットル33％グリセロール。グリセロールのソリューションは、NMのバッファー（150mMのNaCl、50mMのMES、pH5.5）で純粋なグリセリンを混合して作られています。また、グリセロールとバッファの両方を含むバランスのチューブを準備する。 </li><li>渦再びウイルスのサンプルを破壊し、グリセロール勾配の上にそれを読み込みます。 </li><li>ベックマンMLS - 50スイングバケットローターで、217000 × gで、4℃で3.75時間のために勾配を遠心分離します。 </li><li>遠心分離が完了したら、手動でチューブの上からグラデーションの250μlのアリコートを収集する。 ℃の氷の上または4で分画してください</li></ol>パート3：SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法によりグリセロール勾配分画の分析<ol><li>各フラクションから新しいチューブに20μlのを削除します。 </li><li> 5x SDS - PAGEサンプルバッファー5μlを添加します。 </li><li> 95〜ヒート℃で5分間。 </li><li>簡単にサンプルをスピンダウンし、10％ポリアクリルアミドゲル上にロードし、井戸の一つで、分子量マーカーが含まれています。 </li><li>ブロモフェノールブルーローディング色素がゲルの底部近くに達するまでゲルにサンプルを実行します。 </li><li>クーマシーブルーでゲルを染色する。 </li></ol>パート4：vRNP画分の濃縮<ol><li>主にNPを含むグリセロール画分を選択し、それらを組み合わせて、二ベックマンポリカーボネート遠心管（11ミリメートル× 34ミリメートル）にそれらを配布する。 </li><li>上下ジエチルピロカーボネート（DEPC）処理した超純水、及びピペットで混合するために数回、各チューブを埋める。 </li><li>ベックマンTLA - 120.2ローターで、157000 × gで、4℃で4.5時間遠心する。 </li><li>上清を除き、DEPC処理水50μlにペレットを再懸濁します。 </li><li>必要に応じて、濃縮されたvRNPsの280は、測定することができます。 NPは、プールされた画分の主要コンポーネントの存在として、NPのモル濃度の推定値は55350 M -1 cm -1のその吸光係数を（ProtParam 3を介して決定される）を使用して計算することができます。 </li><li>一定分量精製vRNPsを、そしてそれらを° C、後で使用するために-80℃で凍結保存する。 </li></ol>パート5：vRNPsのネガティブ染色<ol><li>たてのとフィルタリングの2倍MNT緩衝液（20mM MES、150mMのNaCl、30mMトリス、pH 7.5）を9μLに精製されたvRNPの1μlを希釈します。他のバッファは、vRNPsを希釈すると試料のグリッド（ステップ5.5）洗浄するためにOKですが、酢酸ウラニルが負の染色に使用されている場合PBSを使用しないでください。 </li><li>以前に30秒間parlodionと炭素膜で被覆試験片（銅TEM）グリッドをグロー放電。 </li><li>ピンセットでたてのグロー放電試験片のグリッドを保​​持し、試料のグリッド上に希釈vRNPの5μlをドロップして適用されます。 </li><li> 8分のグリッド上で試料の滴を残す。 </li><li>待っている間、ベンチにパラフィルムの小さなストリップを配置し、そして10μlのMNTバッファの各（グリッドを洗浄する）、そしてたて染色液の80μlをドロップ（1％モリブデン酸アンモニウムまたは1を含む2滴を分注するパラフィルム上に％の酢酸ウラニル）。 </li><li>吸着の8分後、ろ紙の切れ端で試料のグリッド（三角にカット）からサンプル溶液の一部を放出する。試料グリッドを乾燥させてはいけない。 </li><li> 1分の合計時間のために10μlのMNTバッファの各々を含む2滴の試料の格子を洗います。これは、慎重にドロップで試料の格子を下げるし、ろ紙の切れ端で試料の格子（試料のグリッドは、乾燥させることなく）からサンプル溶液の一部をオフにウィッキングすることによって行われます。 </li><li>直ちに試料のグリッドからバッファの最後の一滴をオフウィッキング後に、完全なLYの水没は、標本の染色液滴内のグリッド、1分間待ちます。 </li><li>完全にろ紙片を持つ試料の格子から染色液をオフに放出する。 </li><li>透過型電子顕微鏡下で観察する前に、数分間空気乾燥して試料のグリッドを許可する。 </li></ol>パート6：代表的な結果： <img src="/files/ftp_upload/old/1105_2009_1_22_1/1105_Figure2.png" alt="図2" width="600" height="215" />図1 インフルエンザNP（〜56 kDa）は、ウイルスリボ核タンパク質複合体で見つかった主なタンパク質は、NPのバンドは、一般的にvRNPs（図1）を含有する画分では最強のバンドです。 NPに加えて、それぞれのインフルエンザのvRNPは、複雑な（82、86及び86.5 kDaの分子量）三量体RNAポリメラーゼのコピーが含まれています。彼らの豊かさがNPのそれに比べて低いので、これらは、またはクーマシーブルー染色により表示されない場合があります。ゲルの銀染色が行われ、代わりにCommassie青の汚れ、場合ポリメラーゼは、しかし、検出することができます。インフルエンザマトリックスタンパク質M1（〜28 kDa）はNP蛋白質のピーク分画が存在する分画で最小限に存在する必要があります。 <img src="/files/ftp_upload/old/1105_2009_1_22_2/1105_3.png" alt="図3" width="600" height="360" />図2 透過型電子顕微鏡下で可視化などの負染色vRNPsの長さは120nmの（図2a）に約30nmである任意の長さを持つロッド状の粒子に似たvRNPsをもたらす必要があります。オリゴマーのNPがさらに二重らせんリピート構造に折り畳まれているNPの分子の鎖のように構成されているので、これらの棒状粒子のいずれかの端にループし、時には（図2b）見ることができます。

<ol><li>Kemler, I., Whittaker, G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+import+of+microinjected+influenza+virus+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Nuclear import of microinjected influenza virus ribonucleoproteins.</a> Virology. 202, 1028-1033 (1994).</li>
<li>Wu, W. W. H., Weaver, L. L., Panté, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+the+nuclear+localization+sequences+on+influenza+a+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of the nuclear localization sequences on influenza a ribonucleoprotein complexes.</a> J Mol Biol. 374, 910-916 (2007).</li>
<li>Gasteiger, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGasteiger%2C+E+%22The+Proteomics+Protocols+Handbook%22">The Proteomics Protocols Handbook</a>. Walker, J. M. , Humana Press. 571-607 (2005).</li>
<li>Wu, W. W. H., Sun, Y. H. B., Panté, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+import+of+influenza+A+viral+ribonucleoprotein+complexes+is+mediated+by+two+nuclear+localization+sequences+on+viral+nucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Nuclear import of influenza A viral ribonucleoprotein complexes is mediated by two nuclear localization sequences on viral nucleoprotein.</a> Virol J. 4, 49-49 (2007).</li>
<li>Babcock, H. P., Chen, C., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+single-particle+tracking+to+study+nuclear+trafficking+of+viral+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Using single-particle tracking to study nuclear trafficking of viral genes.</a> Biophys J. 87, 2749-2758 (2004).</li>
</ol>

vRNPsの精製がKemler ら （1994）によって記載された手順に基づいている。1私達と他の人も自分の核移入を勉強するvRNPsを分離するためにこのプロトコルを使用している。2,4,5 我々は、ウイルスゲノムはRNAで構成されているためRNaseフリーヒントやvRNPsを操作するチューブの使用をお勧めします、そのためRNAの存在下で容易に分解する。さらに、すべてのバッファはRNaseフリーの水でなされるべきである。ここで説明するプロトコルは酸性抽出（破砕バッファーのpHを、例えば、グリセロール勾配が5.5である）で実施した。同様に、基本的な抽出は、MES、トリス、pH7.8のでpH 5.5を代入することにより（としてKemler ら （1994）1で説明）を行うことができます。

<table><tbody><tr><td>H3N2 X-31 A/AICHI/68 インフルエンザA型ウイルス</td><td>Charles River Laboratories</td><td>490715</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-8250</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-1</td><td></td></tr><tr><td>オクチルグルコシド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O-8001</td><td></td></tr><tr><td>リゾレシチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-4129</td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9779</td><td></td></tr><tr><td>クマシーブリリアントブルー G-250</td><td>Kodak</td><td>1367796</td><td></td></tr><tr><td>ジエチルピロカーボネート (DEPC) 処理水</td><td>Invitrogen</td><td>750024</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ウラニル</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>19481</td><td></td></tr><tr><td>モリブデン酸アンモニウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-674</td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX-E 超遠心機</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>434491</td><td></td></tr><tr><td>MLS-50 ローターパッケージ、スイングバケット</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>367280</td><td></td></tr><tr><td>TLA-120.2 ローターアセンブリ、固定角、チタン製</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>362046</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer</td><td>Lauda Brinkmann</td><td>022670000</td><td></td></tr></tbody></table>

インフルエンザウイルスリボ核タンパク質複合体の精製と可視化

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

インフルエンザウイルスゲノムは8つの負のセンス、個々にインフルエンザの複数のコピーウイルスribonulceoprotein粒子（vRNPs）に核蛋白（NP）が充填された一本鎖RNA分子で構成されています。インフルエンザvRNPsは、ウイルスエンベロープで囲まれています。セルの入力時に、しかし、これらのvRNP複合体は、それらが宿主核輸送機構へのアクセスを細胞質に放出されています。インフルエンザvRNPsとインフルエンザのゲノムの複製の核移入を研究するために、それはウイルスの他のコンポーネントがこれらのプロセスに干渉しないように隔離されたvRNPsで作業するのに便利です。ここで、我々は、インフルエンザウイルスからこれらvRNPsを精製する手順を説明します。手順は、包まれたビリオンからvRNP複合体を解放するために、インフルエンザの混乱洗剤とビリオンから始まります。 vRNPsは、インフルエンザ速度沈降によって33から70パーセント不連続グリセロール勾配でビリオンの他のコンポーネントから分離されています。グリセロール勾配から得られた分画は、クマシーブルーで染色後を経由してSDS - PAGEで分析されています。 NPを含有するピーク画分を一緒にプールし、遠心分離により濃縮されています。濃縮後、vRNPsの整合性は、ネガティブ染色した後、透過型電子顕微鏡によるvRNPsの可視化によって検証されます。グリセロール密度勾配による精製はKemlerからその修正したものです<em&gt;ら。</em&gt;（1994）<sup&gt; 1</sup&gt;、および負の染色が呉で行われている<em&gt;ら。</em&gt;（2007）。<sup&gt; 2</sup

インフルエンザウイルスのゲノムは、RNAとタンパク質の8つの独立した複合体と呼ばれる、ウイルスのリボ核タンパク質複合体（vRNPs）で構成されています。本論文では、グリセロール勾配精製とインフルエンザvRNPsの透過型電子顕微鏡の可視化について説明します。

インフルエンザA型ウイルスのゲノムは、8本の負鎖単鎖RNA分子で構成されており、それぞれにインフルエンザA型の複数のコピーが個別に封入されています。

本手順では、まず遠心分離によってインフルエンザウイルス溶液から不純物を除去します。次に、界面活性剤を用いてウイルス膜を破壊し、放出されたvRNPsをグリセロール密度勾配で分離します。勾配からの遠心分離分画を回収し、各分画のアリコートを供試します。SDS-PAGEを行い、クマシブルーでゲルを染色してV NPを含むピーク分画を特定します。その後、V NPを含む分画を遠心分離によって濃縮し、精製されたVRPを銅製TEM試料グリッドに滴下し、透過型電子顕微鏡でVRPを可視化するためにネガティブ染色を行います。こんにちは、私はブリティッシュコロンビア大学動物学部のNellie Pane博士の研究室のWinCo Wuです。Paneラボに所属していたリンジー・ウィーバーです。本日は、ウイルスリボ核タンパク質複合体であるインフルエンザの精製手順について説明します。当研究室では、組織培養細胞におけるインフルエンザAウイルスの核移行を研究するために、この手順を用いています。それでは、始めていきましょう。まず、11 mm × 34 mmのBeckman社製ポリカーボネート製遠心チューブに、MNTバッファーを750 µL分注します。次に、2 mg/mLのインフルエンザAウイルス溶液を500 µLチューブに加え、ピペッティングを数回繰り返し、ウイルスとMNTバッファーを混合させます。混合後、チューブをTLA one 20.2ローターにセットし、Beckman Optima max E遠心機を用いて4°C、109,000 ×gで10分間遠心分離します。遠心終了後、上清を除去し、ペレットを500 µLのdisruption bufferで再懸濁します。再懸濁したペレットを激しくボルテックスし、その後、Eppendorf ThermoMixerを用いて31°Cで20分間振盪します。振盪が完了したら、グリセロール密度勾配沈降速度遠心分離に進みます。グリセロール勾配を調製するため、Beckman UltraClear 13 mm × 51 mm遠心管に、70% (v/v) GLYCEROL 1 mL、50%グリセロール 0.75 mL、40%グリセロール 0.375 mL、および33%グリセロール 1.8 mLを順に分注します。これらのグリセロール溶液は、純粋なグリセロールをNMバッファーで希釈して調製します。また、グリセロールとバッファーの両方を含むバランスチューブを準備します。次に、破砕したウイルス試料を再度ボルテックスし、グリセロール密度勾配にロードします。チューブをBeckman MLS 50スイングバケットローターにセットし、4 °Cで217,000 ×gにて3時間45分間、密度勾配を遠心分離します。遠心分離の完了後、チューブの上部から250 µLずつグラジエントを分注して回収します。回収した分画は氷上または4 °Cで保存してください。分画の回収後、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて解析を行います。SDS-PAGE解析を開始するには、各フラクションから20 µLを新しいチューブに分取します。次に、5倍濃度のSDS-PAGEサンプルバッファーを5 µL加え、サンプルを95 °Cで5分間加熱します。加熱後、サンプルを短時間遠心し、10%ポリアクリルアミドゲルにロードします。その際、ウェルの1つに分子量マーカーを含めてください。次に、ブロモフェノールブルーのローディングダイがゲルの底部付近に達するまで、サンプルを電気泳動させます。SDS-PAGE装置からゲルを取り出し、クマシーブルーで染色します。染色結果に基づき、主にインフルエンザのヌクレオプロテインを含む画分を特定します。インフルエンザA型ウイルスのNPは約56 kilodaltonsのサイズであり、ウイルスリボ核タンパク質複合体中に存在する主要なタンパク質です。そのため、vRNPを含む分画において、NPのバンドは一般的に最も強いバンドとして現れます。次のステップでは、これらのvRNP分画を濃縮します。主にNPを含むグリセロール分画を合わせ、Beckman社の11 mm × 34 mmポリカーボネート製遠心チューブ2本に分注し、各チューブにエチルピロカーボネートまたはDEPC処理済みの超純水を満たします。次に、ピペッティングを数回行い混合します。チューブをBeckman TLA 120.2ローターにセットし、4°C、157,000 ×gで4時間半、遠心分離を行います。遠心分離が完了したら、上清を除去し、ペレットを再懸濁します。精製したV NPsを50 µLのDEPC処理水で分注し、1アリコートを取り分けて、残りは-80 °Cで保存します。これで、VRPsのネガティブ染色を行う準備が整いました。精製したVRNP 1 µLを、調製直後に2回ろ過したPBSバッファー 9 µLで希釈し、銅製TEM試料グリッドを30秒間グロー放電処理します。このグリッドには、あらかじめParlow Dionおよびカーボン膜がコーティングされています。グロー放電処理直後の試料グリッドをピンセットで保持し、希釈したVRNP 5 µLをグリッド上に滴下します。待機している間に、ドロップを8分間グリッドに吸収させます。トレイにパルファン（吸収紙）の小さなストリップを置き、そこにPBSバッファーを10 µLずつ2滴と、1%アンモニウムメリデートで構成される調製直後の染色液を80 µL滴下します。次に、試料グリッドを2滴のPBSに注意深く浸し、計1分間洗浄します。次に、ろ紙を用いて、試料グリッドを乾燥させないように注意しながら、試料溶液の一部を吸い取ります。試料グリッドからバッファーの最後の一滴を吸い取った直後に、試料グリッドを染色液の液滴の中に完全に浸します。そのまま1分間待ちます。1分後、新しいフィルターペーパーを用いて、 specimen gridから染色液を完全に吸い取ります。観察前に、specimen gridを数分間自然乾燥させます。透過電子顕微鏡下での、陰性染色されたV npsの代表的な透過電子顕微鏡画像を以下に示します。こちらでご覧いただけるように、V NPSは長さが不均一な棒状の粒子であり、その長さは約30 nanometersから120 nanometersです。オリゴマーNPはNP分子の鎖として構成されており、それがさらに折り畳まれて二重らせんの繰り返し構造を形成しています。そのため、これらの棒状粒子の両端にループが見られることがあります。インフルエンザウイルスのリボ核タンパク質複合体（vRNP）の精製および可視化方法について解説しました。この手順を行う際、陰性染色に酢酸ウラニルを使用する場合は、vRNPの希釈にPBSを使用しないことが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。

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