インフルエンザウイルスリボ核タンパク質複合体の精製と可視化

本手順では、まず遠心分離によってインフルエンザウイルス溶液から不純物を除去します。次に、界面活性剤を用いてウイルス膜を破壊し、放出されたvRNPsをグリセロール密度勾配により分離します。

勾配からの遠心分離分画を回収し、各分画のアリコートを解析します。SDS-PAGEにて、クマシーブルーでゲルを染色してV NPSを含むピーク分画を特定します。その後、V NPSを含む分画を遠心分離により濃縮し、精製したVRPを銅製TEM試料グリッドに滴下します。次いで、透過電子顕微鏡でVRPを可視化するためにネガティブ染色を行います。こんにちは、私はブリティッシュコロンビア大学動物学部のNellie Pane博士の研究室のWinCo Wuです。

私はLindsay Weaverです。以前はPane Labに所属していました。本日は、ウイルスリボ核タンパク質複合体であるインフルエンザの精製の手順について解説します。当研究室では、組織培養細胞におけるインフルエンザAウイルスの核内移行を研究するために、この手順を用いています。

それでは始めていきましょう。まず、11 mm × 34 mmのBeckman社製ポリカーボネート製遠心チューブに、MNTバッファーを750 µL加えます。次に、2 mg/mLのインフルエンザAウイルス溶液を500 µLチューブに加え、ピペッティングを数回繰り返して、ウイルスとMNTバッファーを混合させます。

混合後、チューブをTLA one 20.2ローターにセットし、Beckman Optima max E遠心機を用いて4 °Cで109,000 ×gで10分間遠心分離します。遠心終了後、上清を除去し、ペレットを500 µLのdisruption bufferで再懸濁します。再懸濁したペレットを激しくボルテックスし、その後、Eppendorf ThermoMixerを用いて31 °Cで20分間振盪します。

振盪が完了したら、グリセロール密度勾配沈降速度遠心分離に進みます。グリセロール勾配を調製するため、Beckman UltraClear 13 mm × 51 mm遠心チューブに、以下の量のグリセロールを順に分注します：70% (v/v) GLYCEROLを1 mL、50% glycerolを0.75 mL、40% glycerolを0.375 mL、そして33% glycerolを1.8 mL。これらのグリセロール溶液は、純グリセロールとNMバッファーを混合して調製します。

また、グリセロールと緩衝液の両方を含むバランスチューブを準備します。次に、破砕したウイルスサンプルを再度ボルテックスし、グリセロール勾配にロードします。チューブをBeckman MLS 50スイングバケットローターにセットし、4 °Cで217,000 ×gの条件で3時間45分間、勾配遠心分離を行います。

遠心分離の完了後、チューブの上部から250 µLずつ勾配分画を手動で回収します。回収した分画は、氷上または4 °Cで保存してください。分画の回収が完了したら、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分析を行います。

SDS-PAGE解析を開始するために、各フラクションから20 µLを新しいチューブに分注します。次に、5倍濃縮SDS-PAGEサンプルバッファーを5 µL添加し、サンプルを95 °Cで5分間加熱します。加熱後、サンプルを短時間遠心し、10%ポリアクリルアミドゲルにロードします。その際、ウェルの1つに分子量マーカーを含めてください。次に、ブロモフェノールブルーのロード用染料がゲルの底部付近に達するまで、サンプルを電気泳動させます。

SDS-PAGE装置からゲルを取り出し、クマシーブルーで染色します。染色の結果に基づき、主にインフルエンザヌクレオタンパク質を含むフラクションを特定します。

インフルエンザA型ウイルスのNPは、サイズが約56 kilodaltonsであり、ウイルスリボ核タンパク質複合体に含まれる主要なタンパク質です。そのため、vRNPを含む画分においては、一般的にNPのバンドが最も強く現れます。次のステップでは、これらのvRNP画分を濃縮します。

主にNPを含むグリセロール分画を合わせ、2本のBeckman 11 mm × 34 mmポリカーボネート製遠心チューブに分注し、それぞれのチューブにエチルピロカーボン酸またはDEPC処理済みの超純水を満たします。次に、ピペットで数回吸い上げと吐き出しを繰り返し、混合します。チューブをBeckman TLA 120.2ローターにセットし、4 °Cで157,000 ×gにて4時間30分間遠心分離します。

遠心分離が完了したら、上清を除去し、ペレットを再懸濁します。精製されたV NPSを50 µLのDEPC処理水で分注し、1つの分注量を別途取り分けておき、残りは-80 °Cで保存します。これで、VRPのネガティブ染色を行う準備が整いました。

1 µLの精製VRNPを、調製直後に2回ろ過した9 µLのPBSバッファーで希釈します。銅製TEM試料グリッドを30秒間グロー放電させます。このグリッドには、あらかじめParlow Dionおよびカーボン膜がコーティングされています。グロー放電させた直後の試料グリッドをピンセットで保持し、希釈したVRNPを5 µL滴下します。

待機している間に、滴下した液を8分間グリッドに吸収させます。パラフィンストリップを少々トレイに置き、そこに10 µLずつのPBSバッファー2滴と、1%ピクリン酸（ammonium melidate）で調製した新鮮な染色液を80 µL滴下します。次に、 specimenグリッドを2滴のPBSの中に慎重に浸し、計1分間洗浄します。

次に、試料グリッドを乾燥させないように注意しながら、ろ紙を用いて試料溶液の一部を吸い取ります。試料グリッドから最後のバッファーの滴を吸い取った直後に、試料グリッドを染色液の滴の中に完全に浸します。そのまま1分間待ちます。

1分後、新しいフィルターペーパーを用いて、 specimen gridから染色液を完全に吸い取ります。観察前に、specimen gridを数分間自然乾燥させます。透過電子顕微鏡による、負染色されたV npsの代表的な透過電子顕微鏡像を以下に示します。

ここに見られるように、V NPSは長さが約30 nanometersから120 nanometersまで変動する、棒状の粒子に似ています。オリゴマーNPは、NP分子の鎖として構成されており、さらに二重螺旋の反復構造へと折りたたまれています。そのため、これらの棒状粒子の両端にループが見られることがあります。

インフルエンザウイルスの精製および可視化の方法について解説しました。ウイルスリボ核タンパク質複合体（vRNP）を扱う際、陰性染色にウラニル酢酸を使用する場合は、vRNPの希釈にPBSを使用しないことが重要です。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。