Name: ショウジョウバエの幼虫のNMJからシナプス電位を記録するための電気生理学的方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-06T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: 学ぼう、ショウジョウバエの幼虫の神経筋接合部におけるシナプス伝達を電気生理学的に記録する方法を。筋肉に記録電極を配置し、運動ニューロンを刺激して興奮性接合電位を測定することで、神経伝達メカニズムの理解に貢献します。

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準備を開始する前に： <ul><li>放浪yhird齢ショウジョウバエの幼虫</li><li> HL3.1（血リンパのような変更）ソリューション</li><li> Sylgard（透明なシリコーンゴム）ブレントとマッケイブ（2008）3で説明した方法を使用して、小さな（35 × 10 mm）のプラスチック製のペトリ皿で準備解剖プレート。 </li><li>短い解剖ピンをカット</li><li>刺激電極のピペット</li><li>シャープ記録ピペット</li></ul> HL3ソリューション： <ol><li> 70のNaCl、5 KClを、4のMgCl 2、10のNaHCO 3、5トレハロース、115スクロース、および5 HEPES、pH 7.2の：解剖と電気生理学的実験の中で、幼虫は（mMで）含まれているHL3.1溶液2に浸漬されています。 </li><li> CaCl 2の濃度は、細胞外Ca 2 +の必要な濃度を提供するためにHL3.1溶液に添加されています。 <ul><li>幼虫の解剖はHL3.1を使用して低Ca 2 +濃度（筋肉の収縮を避けるために）+ 0.25 mMのCaCl 2を 、氷上に置きに実行されます。 </li><li>電気生理学的実験は、通常、HL3.1に記録されます+ 1mMのCaCl 2、しかしこれは、0.4から調整することができます- 1mMのCa 2 +は 、必要に応じて。 </li></ul></li><li> HL3.1ソリューションは、フィルタ使用前に滅菌し、4℃で保存されます˚C. </li></ol>ピペットを刺激し、録音の準備： <ol><li>ヒート= 390、フィラメント= 4、速度= 35、= 200を遅延し、= 0をプル：。レコーディングと刺激ピペットは、次の設定を使用してサターP - 2000レーザーベースのマイクロピペットプラーでプルアップされています</li><li>刺激電極は切断モーターの軸索の幅よりもわずかに大きくしたワイド端で薄肉ホウケイ酸ガラス毛細管から調製される。形の両端は、神経の損傷を最小限に抑えるために、（Narashigaピペット研磨機を使用して）滑らかな仕上げを与えるためにfirepolishedされています。刺激電極は浴溶液（HL3.1 + 1mMのCa 2 +）ので埋められます。 </li><li>記録電極は、シャープピペット（mΩの30〜60）を形成するために引っ張られ、3MのKClで満ちている1.2ミリメートルホウケイ酸ガラス、から調製されています。 </li></ol>パート1：ショウジョウバエの幼虫の解剖<ol><li>三齢放浪幼虫は、以前は次の4を説明するように体壁の筋肉を公開するために解剖されています。 </li><li>解剖はHL3.1で実行されます+ 0.25 mMのCa 2 +は小さなシリコンプレート（35 × 10 mm）に。 HL3.1ソリューションは、幼虫をanaesthetizeするために、解剖用の氷冷でなければならず、解剖前と中に氷上に保持されます。 </li><li>幼虫はHL3.1解剖のソリューションに+ 0.25 mMのカルシウムを添加しても小さい短い解剖ピン（長さは約2 mm）を用いて電気生理学的実験のために変更されたブレントとマッケイブ（2008）によって記載された方法を用いて切開している実験時の顕微鏡対物と電極をヒットする可能性が高い。 </li><li>解剖の後、幼虫の運動軸索が切断されています。これは、静かにCNSを保持していると腹側神経節の後方の筋肉を支配する末梢神経が筋肉（図1）を損傷することなく切断することができますので、少しそれを上げることによって行われます。脳はその後削除されます。 </li><li>解剖幼虫の準備はHL3.1 + 1mMのCa 2 +は 2回洗浄する。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1109/fig1.png" alt="図1" /> 図1。解剖幼虫のモーターの軸索を切断するために必要な手順を示す回路図。 CNSは、鉗子で持ち上げられ、モータの軸索は脳の基底部で切断されています。 パート2：幼虫の筋肉細胞からの細胞内記録。 <ol><li> HL3.1と準備は、電気生理学的顕微鏡や水没で解剖のプレートを置き、+それが溶液に接触しているので、1.5mMののCa 2 +とバス電極を修正。 </li><li>全ての実験は、サード腹部セグメント（A3）内の筋肉6日に実行されます。筋肉を支配する末梢神経は、吸引電極5を使用して刺激される。 </li><li>細胞内電極が所定の位置にあるときに振動を回避するために、皿に刺激電極を配置します。筋肉6を支配する運動ニューロンへのすぐ近くに刺激電極を置き、カットの神経は、ガラスピペット内にあるまで、静かに吸引を適用する。吸引が適用されるときに神経を伸ばすように注意してください。それはカット神経線維（図2）を引っ張っていないので、それが筋肉との位置に触れていないので、少しピペットを上げる。 <img src="/files/ftp_upload/1109/fig2.png" alt="図2" width="600" height="296" /> 図2。ショウジョウバエの幼虫から一腹部のセグメントの筋肉や神経支配運動ニューロンの回路図。筋肉6時位置に刺激ピペットや切断神経と記録電極の位置が示されている。 </li><li>イントラ携帯電話の録音は、3 MのKClを充填した鋭い微小電極で作られています。第三腹部セグメント（A3）上筋6の中心上に記録電極を配置し、浴溶液のためのゼロを読み取るように入力オフセットを調整します。それは筋肉の表面に触れるまでゆっくりと高光学倍率の下電極とアプローチ筋肉を下げる。筋肉が侵入されていることを確認するためにオシロスコープをご覧ください。静止膜電位は少なくとも-60 mVのでなければ、または動物を使用しないでください。散発的なミニチュア終板電位が表示されるようになるはずです。記録を開始する前に、1分間安定させるためにセルを残す。 </li><li>膜電位の変化は、軸索HS - 2AのヘッドステージとAxoclamp 2Bのアンプで検出し、Clampex V 8.2.0.235（アクソンインスツルメンツ）で記録されます。 Axoclamp 2BはpCLAMPソフトウェアとDigidata 1322Aのインタフェースと連携して動作を実行するコンピュータとのインタフェースです。 </li><li>細胞はmEJP応答を測定するためにあらゆる刺激せずに3分間記録した。トレースは、ミニ解析ソフトウェア（Synaptosoft、V 6.0.3）と決定さmEJP振幅と周波数を用いて分析した。 </li></ol>神経刺激： <ol><li>運動ニューロンの切断端は、全体の筋肉で一貫性のある反応を引き起こすために、両方のモータの軸索に対して十分な強度で方形電圧パルス（0.3秒持続時間）の連続で刺激される。 </li><li>刺激が継続的に持続時間と間隔の回数に応じてパルスを提供するためにプログラムされているマスター- 8パルスジェネレータで生成されます。 </li><li> NMJでのシナプスの回復のための刺激の間に5秒を許可する。 </li><li>刺激の強さを決定する際に、最も低い水準で始まり、いくつかの臨床試験を介して徐々に強度を増加させる。誘発反応の結果、最小の刺激強度は実験で使用する必要があります。 </li><li>適切な刺激強度に達したときに、一つの化合物のEJPと刺激によって誘発one筋肉の収縮があるはずです。 </li><li>各筋肉と平均振幅から少なくとも10誘発電位を記録する。 </li></ol>パート3：代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/1109/fig3.png" alt="図3" width="600" height="358" /> 図3。誘発EJPのを示す筋肉6日から代表的な細胞内記録では、分節神経の電気刺激、および散発ミニチュア終板電位、またはmEJPのへの応答です。このようなカントンSのような健康な野生型幼虫の筋肉6のEJPの振幅は、通常は約40 mVのと1-3 mVの間mEJP振幅です。

<ol><li>Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+ultrastructure+of+synaptic+terminals+on+ventral+longitudinal+abdominal+muscles+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae.</a> J. Neurobiol. 24 (8), 1008-1024 (1993).</li>
<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
<li>Estes, P. S., Roos, J., van der Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+of+dynamin+within+individual+Drosophila+synaptic+boutons+relative+to+compartment-specific+markers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers.</a> J Neurosci. 16, 5443-5456 (1996).</li>
<li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+dissection+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Protocol for dissection of Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster.</a> J Physiol (Lond). 262, 189-214 (1976).</li>
<li>Katz, L. C., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activity+and+the+construction+of+cortical+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic activity and the construction of cortical circuits.</a> Science. 274, 1133-1138 (1996).</li>
</ol>

方法はNMJにおいてシナプス機能の変化を検出するために、比較的迅速かつ広範な手段を提供するここで説明する。 in vivoでインタクトな動物を用いて電気生理学的記録を実行し、遺伝的または薬理学的操作を実行する機能は、ショウジョウバエ神経伝達の生理的および遺伝的側面を調査するための理想的な動物モデルにします。 筋細胞は非常に大きいので、いくつかの2つの電極電圧クランプ（TEVC）記録のためにこのプロトコルに追加のステップを追加することを好むかもしれません。これは、セルの現在のパッシング電極を配置することにより、場所の細胞内電極と同一の幼虫の準備を行うことができます。セルが固定十分に電圧になると、電流応答を記録することができます。 筋肉6が最も一般的な電気生理学的記録のために使用されていますが、筋肉7と12を使用することもできます。 1976年月と月によって記述された技術を、そして以来、シナプス生理学を研究するためのモデルシステムとなっている - ここで説明する方法はDro...

<table><tbody><tr><td>小型ペトリ皿 (35 x 10 mm)</td><td>BD Biosciences</td><td>1008</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 182 シリコーンエラストマーキット</td><td>Dow Corning</td><td>3097366-1004</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>475002-9902</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡用照明</td><td>Schott AG</td><td>KLI500</td><td></td></tr><tr><td>解剖用ピン</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>pClamp 9 ソフトウェア</td><td>Molecular Devices</td><td>PCLAMP 9 STANDARD</td><td></td></tr><tr><td>解剖用鋏：3mm Vannasスプリング鋏</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-0</td><td></td></tr><tr><td>Dumont SS ピンセット</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 ピンセット</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>薄壁ホウケイ酸ガラスキャピラリー（フィラメント付き、1.0 mm, 4 in）</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスキャピラリー（フィラメント付き、1.2 mm, 4 in）</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B120F-4</td><td></td></tr><tr><td>Sutter P-2000 レーザー式マイクロピペットプラー</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Model P-2000</td><td></td></tr><tr><td>ピペットポリッシャー</td><td>Narishige International</td><td>MF-83</td><td></td></tr><tr><td>Axon HS-2A ヘッドステージ</td><td>Molecular Devices</td><td>Model HS-2A</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MP-85</td><td></td></tr><tr><td>Axoclamp 2B アンプリファイア</td><td>Molecular Devices</td><td>AXOCLAMP 2B</td><td></td></tr><tr><td>Clampex ソフトウェア</td><td>Molecular Devices</td><td>v 8.2.0.235</td><td></td></tr><tr><td>Mini analysis ソフトウェア v 6.0.3</td><td>Synaptosoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brownlee Precision アンプリファイア</td><td>Brownlee</td><td>Model 410</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Baker/VWR</td><td>4058-01</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p-9333</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s6297-1kg</td><td></td></tr><tr><td>トレハロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TO167</td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>Fisher Scientific</td><td>bp220-212</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>h-3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl-6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>m2670-1kg</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>c79-500</td><td></td></tr><tr><td>Master-8 パルスジェネレーター</td><td>A.M.P.I</td><td></td><td></td></tr><tr><td>電気生理学セットアップ用防振台</td><td>Technical Manufacturing Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ファラデーケージ</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ショウジョウバエの幼虫のnmjからシナプス電位を記録するための電気生理学的方法

Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

このビデオでは、我々は、ショウジョウバエの幼虫の神経筋接合部（NMJ）でシナプス伝達を記録するための電気生理学的方法を説明します。幼虫の神経筋システムは、シナプスの生理学と神経伝達の研究のためのモデルのシナプスであり、遺伝学を定義し、実験的操作にアクセスできる状態になっている貴重な研究ツールです。幼虫は、体壁筋肉組織、中枢神経系、および末梢神経を公開するために解剖することができます。ショウジョウバエとその神経支配のパターンの筋肉が十分に特徴付けされていると筋肉が細胞内記録のために簡単にアクセスできます。 A7 - 個々の筋肉は8腹部セグメント、セグメントA2に繰り返されるパターンに配置された30の筋肉と各内での位置や向きによって識別することができます。解剖ショウジョウバエの幼虫は薄いと個々の筋肉と運動ニューロンの軸索の束であると透視可視化することができる<sup&gt; 1</sup&gt;。トランスジェニックコンストラクトは、視覚的に識別するためのまたは特定の組織で遺伝子産物を操作するための標的細胞を標識するために使用することができます。幼虫では、興奮性接合部電位（EJPs）はシナプスでの運動ニューロンからのグルタミン酸の小胞の放出に反応して生成されます。解剖幼虫では、EJPは、細胞内電極で筋肉に記録することができます。活動電位を人為的に、腹側神経節に後方カット穏やかな吸引によってガラスのピペットに引き込まれ、電極で刺激されている運動ニューロンに誘発することができます。これらの運動ニューロンは、刺激の異なる焼成しきい値を持つものがあり、それらを同時に起動したとき、彼らは筋肉の応答を生成します。 NMJシナプスを介して伝送される信号は、運動ニューロン支配するその筋肉に記録することができます。 EJPsとミニチュア興奮性接合部電位（mEJPs）は膜電位の変化として見られている。電気生理学的応答は、修正された最小限の血リンパのような溶液中で室温で記録されます<sup&gt; 2</sup&gt;（HL3）5mMのMgを含む<sup&gt; 2 +</sup&gt;と1.5mMのCaの<sup&gt; 2 +</sup&gt;。誘発EJPsの振幅の変化は、シナプス機能と構造の違いを示すことができます。デジタル化された記録はEJPの振幅、mEJPの周波数と振幅、および量子コンテンツを分析している。

ここでは、ショウジョウバエの幼虫の神経筋接合部でシナプス伝達を測定するための電気生理学的方法を説明します。誘発放出は、運動ニューロンの軸索を刺激することによって人工的に開始され、NMJの透過は、筋肉に誘発シナプス後応答によって測定することができる。

ショウジョウバエの幼虫のNMJからシナプス電位を記録するための電気生理学的方法

このビデオでは、ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部（NMJ）におけるシナプス伝達を記録するための電気生理学的手法について説明します。

Joof幼虫の神経筋接合部から安定した電気生理学的記録を得るための手順です。まず、記録を行う前に幼虫を解剖して、体壁、筋肉、および神経系を露出させます。CNS基部の軸索は、腹側神経節の後方で切断します。次に、記録電極を目的の筋肉に、刺激電極を神経支配を行う運動ニューロンの近傍に配置します。運動ニューロンの切断された軸索を刺激ピペット内に吸い込みます。これにより、興奮性接合後電位を記録することができます。こんにちは。コロンビア大学生理学・細胞生物物理学部のMcCabe研究室のWendy MLAです。本日は、GE lavaの神経筋接合部におけるシナプス伝達を測定する手順をご紹介します。私たちは、シナプス生理学および神経伝達の研究にこの手順を研究室で利用しています。それでは始めましょう。実験を開始するために、遊走期の3期および星状幼虫を解剖し、体壁を露出させます。このプロトコルは、短い解剖ピンを使用することで電気生理学的実験用に調整されています。これらは長さが約2〜4mmであり、実験中に顕微鏡の対物レンズや電極に接触する可能性が低くなります。体壁を露出させた後、鉗子でCNSを保持してわずかに持ち上げます。次に、末梢神経の運動軸索を切断し、脳を除去します。脳を取り出した後、解剖したサンプルを1 mMカルシウムを含むHL 3.1バッファーで2回洗浄します。解剖が完了したので、幼虫の筋細胞から細胞内記録を行うことができます。解剖プレートを電気生理学顕微鏡上に設置し、カルシウム添加HL 3.1バッファーでサンプルを浸します。次に、バス電極を溶液に接触するように固定します。吸引電極は、筋肉を支配する末梢神経を刺激するために使用します。細胞内電極を筋肉に刺入する際の振動を防ぐため、先に吸引電極をディッシュ内に配置してください。電極をディッシュに入れたら、筋肉6を支配する運動ニューロンの近くに配置します。第3腹節において、切断された神経がガラスピペットの中に入るまで、緩やかに吸引してください。吸引時に神経を伸ばさないよう注意してください。ピペットをわずかに上げ、筋肉に触れないようにします。次に、切断された神経線維を引っ張らない位置に調整します。吸引電極を配置した後、細胞内記録用の記録電極を配置します。3 M の塩化カリウムを満たした鋭利な微小電極を使用します。記録電極を筋肉6の中央の上に配置します。バス溶液に対してゼロになるように入力オフセットを調整します。電極をゆっくりと下ろし、高倍率の光学顕微鏡で観察しながら、筋表面に接触するまで近づけます。筋に貫入したことを確認するため、オシロスコープを観察してください。静止膜電位が少なくとも-60 millivoltsである必要があります。散発的なミニチュアnplate電位が確認できるはずです。記録電極を配置した後、細胞を1分間安定させます。記録を開始する前に、Axon HS-2（ヘッドステージ）およびAxon Clamp 2Bアンプを使用して、膜電位の変化を検出します。axle clamp two Bは、信号をデジタル化するdigit data. 1322を介して、P clampソフトウェアを動作させるコンピュータに接続されています。膜電位をPCに記録します。clamp Xソフトウェアを用いて運動ニューロンの軸索に刺激を与え、興奮性膜電位またはEPSPを発生させます。ejを生成した後、刺激同期なしで3分間にわたりミニejを記録します。トレースの解析およびmini EJPの振幅と頻度の決定には、Soft mini解析ソフトウェアを使用できます。ejを生成するには。マスター8パルスジェネレーターを使用して、切断された運動ニューロン端を刺激します。ジェネレーターを用いて0.3 millisecondの方形電圧パルスを印加します。また、シナプス回復を促すため、刺激の間隔を5秒に設定します。NMJにおいて、各筋肉から少なくとも10回の誘発電位を記録し、振幅の平均を算出します。この図は、野生型sal幼虫の第6筋肉から記録された、誘発EJP応答と自発的なmini EJPを伴う典型的なトレースを示しています。以上で、ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部から電位を記録する方法を説明しました。この手順を行う際は、解剖を3分から10分以内に完了させ、細胞がまだ健全で反応が良い状態で直ちに電気生理学的記録を開始することが重要です。解剖に時間がかかりすぎると、筋細胞の静止膜電位が-60 millivoltsを下回り、記録には低すぎることになります。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功を願っております。

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ショウジョウバエの幼虫のNMJからシナプス電位を記録するための電気生理学的方法

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