ショウジョウバエの幼虫のNMJからシナプス電位を記録するための電気生理学的方法

Joof幼虫の神経筋接合部から安定した電気生理学的記録を生成すること。記録する前に、まず幼虫を解剖して体壁、筋肉、神経系を露出させます。CNSの基部にある軸索は、腹側神経節の後方に切断されています。

次に、記録電極を目的の筋肉に配置し、刺激電極を神経支配運動ニューロンの近くに配置します。運動ニューロンの切断された軸索は、刺激的なピペットに吸い込まれます。その後、興奮性接合電位を記録することができます。

こんにちは、コロンビア大学の生理学および細胞生物物理学部のマッケイブ研究室のウェンディMLAです。今日は、GE溶岩の神経筋接合部でのチック伝達を測定する手順を紹介します。私たちの研究室では、この手順を使用してシナプス生理学と神経伝達を研究しています。

それでは始めましょう。実験を開始するには、ワンタリングサードとスターの幼虫を解剖して体壁を露出させます。このプロトコルは、短い解剖ピンを使用して電気生理学的実験用に変更されます。

これらは長さが約2〜4ミリメートルで、実験中に電極内の顕微鏡対物レンズに当たる可能性が低くなります。体壁を露出させた後、鉗子を使用してCNSを保持し、わずかに持ち上げます。次に、末梢神経運動軸索を切断し、脳を切除します。

洗脳を除去した後、解剖した調製物を1ミリモルカルシウムを含むHL 3.1バッファーで2回洗浄します。解剖が完了したので、幼虫の筋肉細胞から細胞内記録を行うことができます。解剖プレートを電気生理学顕微鏡に置き、調製物をHL 3.1バッファーとカルシウムに浸します。

次に、バス電極を溶液と接触するように固定します。吸引電極は、筋肉を神経支配する末梢神経を刺激するために使用されます。細胞内電極が筋肉に配置されたときの振動を避けるために、最初に吸引電極を皿に配置します。

電極が皿に入ったら、筋肉6を神経支配する運動ニューロンの近くに配置します。3番目の腹部セグメントでは、切断された神経がガラスピペットの内側に入るまで穏やかに吸引します。吸引力がかかるときは、神経を伸ばさないように注意してください。

ピペットが筋肉に触れないように少し上げます。そして、切断された神経線維を引っ張らないように配置します。吸引電極が所定の位置に配置されたら、細胞内記録用の記録電極を配置します。

3モルの塩化カリウムを充填した鋭利な微小電極を使用します。記録電極をマッスル6の中心の上に配置します。入力オフセットを調整して、浴液のゼロを読み取るようにします。

電極をゆっくりと下げ、高光学倍率で筋肉に近づいて、筋肉表面に触れるまで待ちます。筋肉が貫通したことを確認するには、オシロスコープを見てください。静止膜電位は、少なくともマイナス60ミリボルトである必要があります。

散発的なミニチュアnplate電位が見えるはずです。記録電極が所定の位置に配置されたら、細胞を1分間安定させます。録音を開始する前に、軸索HS 2、アクスルクランプ2Bアンプのヘッドステージを使用して、膜電位の変化を検出します。

車軸クランプ2 Bは、数字データを介してPクランプソフトウェアを実行するコンピュータへのインターフェースです。 1322 A、信号をデジタル化します。メンブレン電位をPCに記録します。Clamp Xソフトウェアを使用して、運動軸索に刺激を加え、興奮性膜電位またはEJSを生成します。

EJSが生成されたら、刺激シナプスなしで3分間にわたってミニチュアEJSを記録します。ソフトミニ解析ソフトウェアを使用して、トレースを分析し、ミニEJPの振幅と周波数を決定できます。ejsを生成します。

マスター8パルスジェネレーターを使用して、運動ニューロンプログラムの切断された端まで刺激します。0.3ミリ秒の二乗電圧パルスプログラムを提供する発電機。シナプスの回復を可能にするための刺激間の5秒の間隔時間。

NMJでは、各筋肉から少なくとも10の誘発電位を記録し、振幅を平均化します。この図は、誘発されたEJP応答と自発的なミニ EJ.PS を持つ野生型のサル幼虫のマッスル6から記録された典型的なトレースを示しています。この手順を実行するときは、3〜10分以内に解剖を完了し、細胞がまだ健康で反応性が高いうちにすぐに電気生理学的記録を開始することを忘れないでください。

解剖に時間がかかりすぎると、筋細胞の静止膜電位はマイナス60ミリボルト未満になり、記録するには低すぎます。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。