Name: ショウジョウバエのフライトの間に視覚的に仲介臭気の追跡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-26T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 学ぶショウジョウバエの視覚的臭気追跡法。赤外線LED照明の最適化と磁気テザー装置を用いて、飛行中の昆虫の感覚統合と行動神経科学を研究します。

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OMTは、仮想プルームシミュレータ2を組み込むために設計された磁気テザーシステム1の適応です。次のプロトコルは、取得されたビデオ画像（その1）を最適化し、基本的なvisuo -嗅覚の実験（第2＆3）の2つのタイプを実行する方法を説明します。 パート1：ビデオの取得ビデオ画像を最適化すると、取得したデータの品質にとって重要です。の少ない画像の次の手順を実行します。 <ol><li>ピンセットを使ってアリーナで新鮮なテザーフライを置きます。 </li><li>カメラビューは、テ​​ザーハエの腹側面に、ガラス管を介して、チャンバーを介して直接上向きになるように透明なアクリルの真空チャンバーの下の位置のFireWireボードカメラ（火- I 1394store.comを）。ビデオシステムのレンズにはIRフィルターコーティングがないことを確認してください。 </li><li>フライを照らす、LEDパネルのすぐ下に置か赤外線LED（小型部品株式会社）の円形配列を使用してください。それぞれが個別に均一な照明のためのフライのボディにLEDが焦点。 </li><li>パネルのシステムからのまぶしさを軽減し、その場で観測された視覚的な手掛かりを最小限に抑えるために、それは平らな黒い塗料でカメラのビュー内のすべての反射面のコートに便利です。室内の照明は、フライアイでは検出まぶしさと明るさ調節を減らすためにオフに切り替える必要があります。 </li><li>視覚的にカメラ画像を検査する。ハエは黒い背景に明るい白色にする必要があります。画像がぼやけている場合、レンズは、焦点が必要になることがあります。ハエが暗い場合、LEDアレイは、焦点の定まらないまたは不十分に適切な照明用電源があります。背景が明るいオブジェクトが含まれている場合、背景の反射率を最小限に抑えるためにだけその場の上に黒のフロックの紙のディスクをマウントします。 </li><li>我々は、Image Acquisition Toolboxを使用して、MATLABで記述されたカスタムサブルーチンでビデオを取得する。 </li></ol>パート2：臭羽毛を見つけるフライ OMTの1つの簡単な実験では、位置空腹（飢餓）フライを観察し、積極的に魅力的な食べ物の匂いのプルームを追跡しています。視覚的な環境を操作すると、確実に食欲の食品の匂いを追跡するハエの能力に影響を与えます。実験は、一般的に、実験の順序で任意のバイアスを最小限に抑えるために、ランダム、ブロック形式で実行されることに注意してください。すべての外部ハードウェアは、（ガスのマルチプレクサ、LEDの舞台、映像の取得）のMatlab（Mathworks社）で記述されたカスタムソフトウェアルーチンによって制御されます。 <ol><li>ピンセットを使ってアリーナで新鮮なテザーフライを置きます。 </li><li>すべての実験の前に、視覚的な表示を使用して、全体360のヨー軸周りの滑らかな動きを確保するためにいくつかの革命のためのフライ3を回転させます。フライが回転しない場合はスムーズにそれを捨てる。問題が解決しない場合、考えられる原因は、位置がずれて磁石です。注：スピンの試験中にいくつかの軌道に向かって競技場の分布が著しいピーク（すなわち、360度以上のフラットではない）表示された場合、位置がずれて磁石に起因する方向のバイアスがある可能性がある。 </li><li>ランダムな順序で、次のサンプルの実験条件でフライを紹介：私水蒸気、臭気のポートから放射されると）、高コントラストの縞模様、ⅱ）魅力的な臭気蒸気で高コントラストな縞模様、ⅲ）単一の垂直のストライプが90度をオフセット水蒸気のノズルから、およびiv）臭気の蒸気を持つ単一の90度オフセットストライプ。我々の経験では、30秒間隔では、ハエが独自に臭気源を見つけるために挑戦されている実験のためにうまく働く。我々は（ほとんどの有用な組み込みMATLAB関数のいずれかを各実験条件の期間中、30Hzで映像を取得し、オフラインでのMatlabで書かれたカスタムソフトウェアルーチンを使用して画像を分析する楕円の幾何学的特性を分析regionprops.mです。 </li><li>匂いがオフされた後に高い臭気濃度を使用する場合は、残留臭気は臭気のポートから放出される可能性がある。すべての影響を最小限に抑えるために、これは、システムが任意の残臭をフラッシュできるように回転するパノラマで数秒間その場を回転させると便利ですがあります。 </li><li>それは維持（i）を視覚的に実験的な治療の間にフライを回転させることも有益です積極的に実験に及び（ii）1つの場所に残っているからハエを保つに従事して飛ぶ。 、ⅱ）5秒の中間スピン、III）は20番目の条件のペア＃1、IV）5秒の中間スピン、V）は20番目の条件のペア＃2 I）第二十二初期診断スピン：実験例では、次の順序を持​​つことができます。 </li></ol>パート3：臭羽毛内に残っているハエ OMTにおける第2の基本実験は視覚的に臭羽毛にフライをドラッグすると、瞬時に視覚的な条件を変更してから、プルームのままにその能力を測定する。もう一度、すべての実験はランダムブロックフォーマで行われていることに注意してくださいtは、実験の順序で任意のバイアスを最小限に抑えます。 <ol><li>ピンセットを使ってアリーナで新鮮なテザーフライを置きます。 </li><li>視覚的に動物が（ 第2.2を参照）すべての方向の向きに能力を持っていることを確認するための診断チェックなど、すべての実験の前に（スピン）アリーナの周りフライを数回回転させる。 </li><li>各条件の前に、実験的な臭気（水または酢）をオンにし、視覚的にプルームの位置に小さな縦のストライプを発振することによりプルームにフライを&quot;ドラッグ&quot;。これは、ハエ[4]で観測された強力なストライプの固定の動作を活用します。 </li><li>今ハエがプルームに向かって配向していること、振動のストライプを削除し、次のサンプルビジュアルな条件を提示：水蒸気（ 図1A）を持つ私は）、高コントラストパノラマのストライプ、ⅱ）水蒸気（ 図1B）を持つ一様な背景。 ⅲ）匂い蒸気（ 図1C）、高コントラストのパノラマストライプ、IV）臭気、蒸気（ 図1D）を持つ一様な背景が。 2.3のようにビデオを取得する。第二十二条件のペア＃2 V）、ⅱ）5秒のプル​​ームのストライプ発振; III）は20番目の条件のペア＃1、IV）5秒のプル​​ームのストライプの発振i）は第二十二初期診断スピン：実験例では、流れるような順番があるかもしれません。 </li></ol>代表的な結果： <img src="/files/ftp_upload/old/1110_2009_1_22_1/Fig 1.png" alt="図1" width="600" height="195" /> 図1 第1部では、OMTのビデオ画像を最適化する方法を説明します。ビデオ画像が暗い黒い背景に照らされたその場での明確な見解を持つ必要があります。過度に明るい画像は赤外LEDの輝度を減少させる、バックグラウンドの干渉を低減することにより、または室内の照明をオフにすることで改善することができます。フライが不適切に点灯している場合は、IRのLEDまたはIR LEDの変調強度のフォーカスを調整することにより問題が解決する可能性があります。 パーツ2＆3は、OMTの適切な動作を検証するために実施する簡単な実験を記述する。すべてのケースでは、ハエが視覚的に動きのスムーズかつ完全な範囲を確保するために競技場で数回転を回転させる（微細運​​動応答を経由して）&quot;強制&quot;する必要があります。 第2部ではフライが独自に臭羽毛を見つけるために挑戦されています。実験に従事しているハエを保つために、残留臭気の放出の影響を減らすために、実験を通して見出し、単一の維持からハエを保つために、それは視覚的に試験の間に数秒間その場を回転させると便利です。フライは、かなりの程度に水蒸気の噴煙をローカライズすることはないはず、と常に豊富なパノラマの視覚的手がかりの存在下で臭羽毛をローカライズする必要があります。 パート3ではフライは、視覚的に臭羽毛に直接ドラッグして、その静止視覚的背景の多様性に対するプルーム内の見出しを維持するために要求されます。フライは、水蒸気の煙にドラッグされた場合、それはすぐに離れて回してください。ハエが臭羽毛にドラッグするとロバストなトラッキングを仲介するのに十分な視覚的な手がかりがある場合は、ハエはプルームのままになります。

<ol><li>Bender, J. A., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+stimulation+of+saccades+in+magnetically+tethered+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Visual stimulation of saccades in magnetically tethered Drosophila.</a> J Exp Biol. 209, 3170-3182 (2006).</li>
<li>Duistermars, B. J., Frye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossmodal+visual+input+for+odor+tracking+during+fly+flight%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Crossmodal visual input for odor tracking during fly flight.</a> Curr Biol. 18, 270-275 (2008).</li>
<li>Reiser, M. B., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+display+system+for+insect+behavioral+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A modular display system for insect behavioral neuroscience.</a> J Neurosci Methods. 167, 127-139 (2008).</li>
<li>Götz, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Course-control%2C+metabolism+and+wing+interference+during+ultralong+tethered+flight+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Course-control, metabolism and wing interference during ultralong tethered flight in Drosophila melanogaster.</a> J. Exp. Biol. 128, 35-46 (1987).</li>
</ol>

このシステムのための画像取得には、MATLABで書かれた安価なFireWireのボードカメラとソフトウェアを利用しています。明確な画像は、正確なデータのトレースを取得するために重要です。上記の戦略は、このシステムで画像をクリーンアップするのに便利です。このシステムの他のビデオトラッキングの手順は1記載されている。さらに、このシステムは、簡単にリアルタイムのビデオトラッキングを含むように変更することができます。例の実験プロトコルは、OMTの適切な動作を保証するための出発点であることを意図ここで説明する。それも、さまざまな視覚的なディスプレイと異なる匂いを試してみることが可能です。

<table><tbody><tr><td>Firewireカメラ</td><td>1394store.com</td><td>Fire-I ボードカメラ BW</td><td>4.3mm レンズ（IRコーティングなし）</td></tr><tr><td>IR LED</td><td>Small Parts, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>黒色スプレー塗料</td><td>Rustoleum</td><td></td><td>フラットブラック</td></tr><tr><td>黒色フロッキー紙</td><td>Edmund Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パネルシステム</td><td>Caltech</td><td></td><td>&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Matlab 2006a</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Image acquisition toolbox</td></tr></tbody></table>

ショウジョウバエのフライトの間に視覚的に仲介臭気の追跡

Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

フライング昆虫は、風の流れでその見出しを安定させるために視覚的な手がかりを使用してください。多くの動物は、さらに風で運ばれた匂いを追跡。このように、風上の視覚的な安定は、臭気の追跡に直接補助追跡。しかし、嗅覚の信号は、直接風の手がかりから独立して視覚的な追跡の動作に影響を与えるのですか？さらに、嗅覚の分子遺伝学と神経生理学の最近の進歩は、（例えば）遺伝的に特定の嗅覚のアクティベーション回路を不活性化の行動の影響を評価する新たな定量的な行動解析を動機としている。我々は元々狭い層流臭プルームでアリーナを搭載することにより、ビジョンの実験のために考案された磁気テザーシステムを変更。ここでは、フライがつながれた後に実行し、磁気の分野でナビゲートすることができることができる実験に焦点を当てる。我々は、安定した臭いの追跡を判断する方法、身体の角度を測定するために最適化されたビデオ画像を取得する方法を示して、そして我々は、臭気の追跡を視覚的合図の影響を調べるために2つの実験を示しています。

ここでは、嗅覚磁気テザー（OMT）装置のために取得されたビデオ画像を最適化する方法について説明します。我々はまたvisuo -嗅覚融合を研究するための2つのサンプルの実験プロトコルを記述する。

飛翔昆虫は、気流の中での進行方向を安定させるために視覚的手がかりを利用する。また、多くの動物は風に乗って運ばれる臭気をも追跡する。したがって、視覚的な...

飛行昆虫は、気流の中での進行方向を安定させるために視覚的な手がかりを利用します。そのため、風上への追跡における視覚的な安定化は、臭気追跡を直接的に支援します。嗅覚磁気テザー装置（OMT）を用いることで、視覚的な手がかりが風の手がかりとは独立して、臭気追跡行動に直接影響を与えるかどうかを調べることができます。まず、赤外線LEDの強度を調整してショウジョウバエの照明を最適化し、鮮明な画像を得ることから手順を開始します。照明が不十分な場合は画像が暗くなり、適切に結像した状態で照明が強すぎると画像が飽和します。解析ソフトウェアを用いて身体角度をリアルタイムで測定し、視覚的にショウジョウバエを餌の臭気プルームへと誘導すると、プルームが存在する空間的な方向へ一貫して向かう様子が観察されます。しかし、これは視覚的なパノラマに強力な視覚的手がかりが含まれている場合にのみ起こります。平均輝度が等しく、かつ視覚的なエッジが存在しない視覚アリーナで同じハエをテストすると、ハエが空間的な方向感覚を失うため、プルームの追跡能は低下します。こんにちは。私はカリフォルニア大学ロサンゼルス校生理科学科のMark Fry博士の研究室のBrian DeMarsです。本日は、嗅覚磁気テザー装置を用いて、身体角度を分析するためのビデオ画像の取得および最適化方法について解説します。また、視覚的手がかりが臭気追跡に及ぼす影響を調べるための2つの実験についても説明します。当研究室では、ショウジョウバエの視覚および嗅覚による飛行制御を研究するために、この手順を用いています。それでは開始しましょう。より鮮明な画像を得るために、ビデオ映像を最適化することは、取得データの品質にとって極めて重要です。まず、ピンセットを用いて、テザリングしたばかりのハエをアリーナ内に配置します。次に、ファイアワイヤボードカメラを透明アクリル製真空チャンバーの下に配置し、カメラがチャンバーを通ってガラス製真空チューブを介し、係留されたハエの腹側を直接上向きに捉えるようにします。ビデオシステムのレンズに赤外線フィルターコーティングが施されていないことを確認してください。ハエを照らすには、LEDパネルの直下に配置された赤外線LEDの円形アレイを使用します。パネルシステムからのグレアを軽減し、ハエが感知する視覚的手がかりを最小限に抑えるため、各LEDを個別にハエの体に焦点を合わせて均一に照明します。カメラの視野内にあるすべての反射面をつや消し黒色塗料でコーティングしておくと有用です。また、ハエの眼で検出可能なグレアや輝度変動を抑えるため、室内の照明は消してください。次に、カメラを目視で確認します。黒い背景に対して、ハエが鮮やかな白色で写っている必要があります。画像がぼやけている場合は、レンズのピント調整が必要な可能性があります。ハエが暗い場合は、LEDアレイの焦点が合っていないか、適切な照明に十分な電力が供給されていない可能性があります。最後に、image acquisition toolboxを用いたMATLAB製のカスタムサブルーチンを使用して、ビデオキャプチャを行います。OMTにおける簡便な実験の一つに、飢餓状態のハエが誘引性の餌の臭気プルームを検出し、能動的に追跡する様子を観察することがあります。これらの実験は、通常、実験順序によるバイアスを最小限に抑えるために、ランダム化ブロック形式で実施されます。視覚的な周囲環境を操作することで、ショウジョウバエの臭気追跡能力に影響を与えることができます。この実験を行うには、視覚ディスプレイを使用する前のすべての実験において、ピンセットを用いて、tether（固定）したばかりのハエをアリーナに配置します。ハエを数回転させ、YA軸の360度全周にわたってスムーズに動作することを確認してください。スムーズに回転しないハエは除外してください。問題が解決しない場合は、磁石の位置がずれている可能性があります。次に、以下の実験条件をショウジョウバエに提示します。高コントラストのストライプパターンと、臭気ポートから放出される水蒸気をランダムな順序で提示してください。魅力的な臭気蒸気を伴う高コントラストのストライプパターンを用います。水蒸気が出る臭気ポートから90度ずらした単一の垂直ストライプと、32分の1間隔で90度ずらした臭気蒸気の単一ストライプの組み合わせは、ハエが自力で臭気源を特定させる課題を課す実験に適しています。各実験条件の期間中、30 Hzでビデオを撮影し、MATLABを使用してオフラインで画像を解析します。高濃度の臭気を使用する場合、影響を最小限に抑えるために、臭気を停止した後に臭気ポートから残留臭気が放出される可能性があります。システム内の残存臭を排除するため、回転パノラマを用いてショウジョウバエを数秒間回転させます。これにより、実験処理の間でショウジョウバエを視覚的に回転させることにもなります。この操作により、ショウジョウバエが実験に積極的に関与し続け、一箇所に留まるのを防ぐことができます。OMTにおける2つ目の基本実験は、ハエを視覚的に臭気プルーム内へ誘導し、視覚条件を瞬時に変化させた後、ハエがプルーム内に留まる能力を測定することです。実験順序によるバイアスを最小限に抑えるため、実験はランダム化ブロック形式で実施します。ピンセットを使用して、テザリングした直後のハエをアリーナに配置してください。次に、診断チェックとして、アリーナ内でハエを視覚的に数回回転させます。これにより、動物があらゆる方向に向かう能力を持っていることを確認します。各条件の前に、水または酢のいずれかの実験用臭気を与え、プルームの位置で小さな垂直ストライプを振動させることで、ハエを視覚的にプルーム内へ誘導します。ハエがプルームの方を向いた状態で、振動ストライプを取り除きます。次に、以下の視覚条件を提示します。水蒸気を伴う高コントラストのパノラマストライプ、水蒸気を伴う均一な背景、臭気蒸気を伴う高コントラストのパノラマストライプ、および臭気蒸気を伴う均一な背景です。各実験条件の期間中、30 Hzでビデオ撮影を行います。次に、MATLABで作成したカスタムソフトウェアルーチンを使用して、オフラインで画像を解析します。OMTビデオ画像を最適化する際は、暗黒の背景に対して照明で照らされたハエが鮮明に見えるようにしてください。画像が明るすぎる場合は、背景の干渉を減らす、赤外線LEDの強度を下げる、または室内の照明を消すことで改善できます。ハエが適切に照らされている場合は、赤外線LEDのフォーカスを調整するか、強度を調節することで問題が解決する可能性があります。ハエに自力で臭気プルームを探させる試験において、水蒸気プルームをかなりの程度まで定位することは決してないはずですが、豊かなパノラマ視覚的手がかりがある状況では、常に臭気プルームを定位させるはずです。2つ目の試験では、ハエを視覚的に誘導して臭気プルームへ直接導き、さまざまな静止視覚背景の中で、プルーム内での進行方向を維持できるかを確認します。もしハエが水蒸気プルームに誘導された場合は、すぐに方向転換して離れるはずです。ハエが臭気プルームに引き込まれ、堅牢な追跡を媒介するのに十分な視覚的手がかりがある場合、ハエはプルーム内に留まります。ここでは、嗅覚磁気テザー装置で得られたビデオ画像を最適化する方法について説明しました。また、臭気追跡に対する視覚的手がかりの影響を調べるための2つの実験プロトコルについても記述しました。これらの実験を行う際は、ビデオ画像の最適化が取得データの品質にとって極めて重要であることを忘れないでください。また、どのような実験プロトコルの場合でも、ショウジョウバエが良好な状態で活動的に関与している状態を維持することが重要です。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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