アストロサイトの細胞膜とグローバル細胞内カルシウム動態の近くの測定

我々は内部全反射し、落射蛍光顕微鏡を用いて培養アストロサイトにおける膜とグローバルな細胞内カルシウム動態の近くで測定する方法について説明します。

このビデオの最初の部分では、アストロサイトニューロン共培養の準備方法を示します。これを行うには、P oneラットから数匹のカバカンピをプロパンで消化したチューブに集め、イオンによって解離させ、次にカバースリップにメッキします。2番目のセクションでは、アストロサイトの細胞内カルシウム動態を測定する方法を示します。これには、アストロサイトへのインフルエンザoh 4カルシウムインジケーター色素のロードと、エピ顕微鏡による全体的なカルシウム動態の測定、芝生顕微鏡による膜近傍のカルシウム動態の測定が含まれます。

照明を自動的かつ迅速に変更することで、全球カルシウムと膜近傍カルシウムの両方をほぼ同時に観察することができます。こんにちは、カリフォルニア大学ロサンゼルス校生理学部のBudget COS研究室の博士研究員であるAji omiです。今日は、asto部位のカルシウムイメージングの手順をご紹介します。

この手順は、骨細胞としての膜および全体的なカルシウム動態の近くの実験室での研究で使用します。排泄物を自動的かつ迅速に変更することにより、全球カルシウムと膜近傍カルシウムを分離することができます。ほぼ同時に、TPを適用してアストロサイトのカルシウム上昇を引き起こす方法を示します。

次に、アストロサイトの研究方法との障壁を要約し、議論することで終わります。では、勉強しましょう。アストロサイトの培養を開始するには、首を切られたラットの子犬の頭から皮膚と頭蓋骨を取り除きます。

冷たい解剖媒体で満たされたシャーレに脳を置き、両方の半球を解剖し、髄膜を取り除きます。次に、カバのカンピを解剖します。カバカンピを約1mmずつ刻みます。

摂氏37度のパッパ溶液で11〜13分間消化します。解剖した組織をインキュベーターから取り出します。次に、組織の片が落ち着いたら、プロパン消化から慎重に取り出し、5ミリリットルの海馬培地を加えて、刻んだカバカンピの断片を洗います。

この手順を繰り返し、最後に、海馬培地に懸濁液を蘇生します。3つの火炎研磨された漸進的な小さなピペットでセルを約5回繰り返します。一度、細胞を70マイクロメートルの全体サイズのセルストレーナーに通し、ストレーナーに4ミリリットルの培地を追加します。

懸濁液の10マイクロリットルの細胞を数えます。海馬培地の量を調整して、ミリリットルあたり400, 000個の細胞を持つようにします。次に、ラミネート溶液に一晩さらされたカバースリップからラミネートを吸引することにより、細胞懸濁液を播種するためのカバースリップを準備します。

カバーが乾板する前に、カバースリップごとに200マイクロリットルのセル懸濁液を乾かすことができます。インキュベーターに60分間取り付けておきます。インキュベーション後、ウェルごとに2ミリリットルの海馬培地を追加します。

翌日、古い海馬培地を吸引して死んだ細胞や破片を取り除き、事前に警告された新鮮な海馬を2ミリリットル追加します。アストロサイトニューロンCo培養の培地維持は、プレーティングの4日後に開始し、週に2回、1ミリリットルの新鮮な神経基礎培地を追加する必要があります。インキュベーター内で約30分間、換気フラスコ内で培地を事前にインキュベートし、温度と二酸化炭素を平衡化してください。

アストロサイトを研究する前に、ナノ蛍光ビーズを見て、芝のレーザー角度を最適化すると便利です。これを行うには、ペトリ皿に200マイクロリットルの水を置き、100ナノメートルの蛍光ビーズを1マイクロリットル加え、落射蛍光顕微鏡でビーズを混ぜ合わせます。次に、芝の顕微鏡でビーズを見ます。

カルシウムイメージングのためには、2.5マイクロモルのインフルエンザoh 4:00 AMおよび0.05%onic F1 27、DMSO中の20%溶液を含む2ミリリットルの海馬記録緩衝液で満たされた6ウェルプレート上のウェルに培養物を置き、室温で10〜30分間インキュベートし、フルオロの漂白を避けるためにプレートを覆うことを忘れないでください。4、インフルエンザoh four溶液を取り除き、海馬記録バッファーでカバーを3回スリップします。洗浄したカバースリップを室温で30分間インキュベートします。

カバースリップをチャンバーに入れ、カバースリップの反対側をレンズ洗浄液で洗浄し、200マイクロリットルの海馬緩衝バッファーを追加します。対物レンズに1滴の浸漬油を1滴垂らし、チャンバーを顕微鏡のステージに置きます。透過光を使用して細胞を見て焦点を合わせ、細胞がどのように見えるかを確認します。

次に、モノクロから488ナノメートルの細胞を照らし、flu oh fourの蛍光シグナルが均一で検出可能かどうかを判断します。アストロサイトでは、エピ照明とターフ照明を使用して、アストロサイト中のカルシウムを測定します。ここでは、蛍光ビーズを落射照明で観察します。

バックグラウンド蛍光を生成するだけでなく、照明角度として大きなブラウン運動も示します。レーザーが臨界角に近づくと、レーザービームはガラス水界面から完全に反射されます。この全内部反射により、エバネッセントフィールドと呼ばれる電磁場が生成されます。

これは、約100ナノメートルの低屈折率の細胞への深さを有する。標本表面のこの薄い層で花の四つん這いを興奮させることができます。これは、エピと比較した場合の芝生照明によって観察される蛍光ビーズです。

角度を小さくすると、照明の信号対雑音比が大幅に増加します。レーザーのビームは表面で反射せず、カバースリップを通過して蛍光ビーズに直接当たります。背景の蛍光を多く見ることができます。

次に、角度を大きくします。ここでも、バックグラウンドノイズが大幅に減少し、カバースリップの表面近くに蛍光ビーズが見えます。これらの画像は、インフルエンザああ、4つの負荷のかかった星状細胞とニューロンを示しています。

アストロサイトは微細な突起を持つ平らな細胞ですが、ニューロンは丸い細胞体と厚くて長い樹状突起を持っています。アストロサイトとニューロンの両方が健康で、インフルエンザに感染しているように見えます。ああ、ちゃんと4つ。

エピ顕微鏡または共焦点顕微鏡でアストロサイトを見ることは、アストロサイトが健康であるかどうか、およびカルシウム指標がアストロサイトに適切にロードされているかどうかを知るのに役立ちます。アストロサイトのフットプリントと呼ばれるカバーガラス領域に最も近い領域では、TPが原形質膜付近でカルシウムの増加を引き起こすことが観察されます。海馬の星状細胞は純粋な無痛性受容体を発現することが知られており、TPを浴に適用すると、全体的なカルシウム放出を引き起こす可能性があります。

馬骨細胞培養の準備方法と、全球的および原形質膜の近くの両方で骨細胞としてのカルシウムレベルを測定する方法を紹介しました。この手順を実行するときは、レーザー角度を最適化することを忘れないでください 顕微鏡でこれを確実にするための最良の方法は、100ミリメートルの流速の挙動を観察することです。全球カルシウムレベルと膜近傍カルシウム濃度の同時記録により、カルシウムシグナルの詳細な記述だけでなく、アストロサイトにおけるカルシウム調節のメカニズムについての新たな洞察が得られます。

また、ここで説明したアプローチは、他の興奮性未知の興奮性フィールドの膜近傍および全球的な細胞内カルシウムレベルの測定に有用であることもわかりました。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。