Name: アストロサイトの細胞膜とグローバル細胞内カルシウム動態の近くの測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-26T23:27:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: 学ぶアストロサイトの細胞膜近傍とグローバルな細胞内カルシウム動態の測定法。ラット海馬由来の共培養細胞を用いて、全反射蛍光顕微鏡とエピ蛍光顕微鏡でカルシウムイメージングを行う手法を解説します。

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この作品は、日本の財団法人上原記念生命科学財団（ESの）だけでなく、ホワイトホール財団、神経疾患や脳卒中の国立研究所とスタインハイマー基金賞（BSKまで）によってサポートされていました。

実験手順実験手順は以下のステップ賢明な方法で説明されている2つのキーの部分で構成されています。 パート1：はPREPARING海馬アストロサイトの培養簡単に言えば、混合海馬アストロサイトニューロン培養物を、十分に確立されたプロトコル1,2,3を用いて調製した。我々は、健全な培養アストロサイトを生成する手順を最適化。以下に記載されているすべての手順は、このような層流フードのような無菌環境で実施されるべきである。 準備カバースリップ <ul><li> 22 mmのカバースリップ（VWR、48380〜068） </li><li>ポリ- D -リシン（PDL、シグマP0899）、アリコート（1 mg / ml）を</li><li>ラミニンアリコート（20μg/ ml）を1 mg / mlのラミニン溶液（シグマL2020）に滅菌水49 mlを追加し、-20℃、1.2 mlのアリコートとストアを行う</li></ul><ol><li> （50μg/ ml）を滅菌​​水でPDLを溶かす</li><li>カバーグラスをオートクレーブ、PDLの滅菌水と場所（100カバースリップ用20 ml）ですすいでください。室温で一晩おきます。 </li><li>滅菌水（3広範な洗浄）とPDLを交換してください。その後、4でカバーガラスと店舗℃を乾燥させる</li><li>アストロサイトをメッキ前日、場所6ウェルプレート（バイオサイエンスBDから滅菌蓋、とウェルフラットボトムプレート）上で無菌ウェル中の個々のカバースリップ。各カバースリップ上ラミニンの400μlを入れ、蒸発を避けるために、インキュベーターで、一晩インキュベートする。 </li></ol> 解剖 解剖のメディア： <ul><li> 500ミリリットルアールの平衡塩類溶液（EBSS）（1X）、液体（Invitrogen社、14155〜063） </li><li> 5ミリリットルHEPES溶液（Sigma、H0887） </li></ul> 海馬メディア： <ul><li> 412.5ミリリットル最小必須培地（MEM）（1X）、液体はアールの塩類が含まれていますが、ないL -グルタミンまたはフェノールレッド（Invitrogen社、51200〜038） </li><li> 10 mlのグルコース（Sigma社、D -（+） - グルコース無水物SIGMA ULTRA G7528）MEMで1 M </li><li> 5ミリリットルペニシリン - ストレプトマイシン（Invitrogen社、15140〜122） </li><li> 5 mlのピ​​ルビン酸ナトリウム溶液（Sigma社、S8636） </li><li> 12.5ミリリットルHEPES溶液1 M（シグマ、H0887） </li><li> 5ミリリットルN - 2サプリメント（100X）、液体（Invitrogen社、17502〜048） </li><li> 50ミリリットルウマ血清、熱不活化（Invitrogen社、26050〜088） </li></ul> パパインのソリューション： <ul><li>ワーシントンパパイン- 022バイアル（LK003178、最終濃度が20 U / ml）に解剖メディアの5 mlを加え37℃で60分間℃でインキュベートする。 </li></ul><ol><li> P1（通常は2匹）の国内規制及び最寄りの動物実験使用の委員会で吟味し、承認されたガイドラインに従って、老化ラットの仔を刎ねる。 </li><li>コー​​ルド解剖メディアで満たされたペトリ皿で​​皮膚と頭蓋骨と場所の脳を取り外します。 </li><li>髄膜を除去、両半球を細かく分析し、海馬を解剖。 </li><li> 37パパイン溶液中で〜1X1 mmの片とダイジェスト℃で11〜13分間に海馬を切る。 </li><li>組織片が定着したら、慎重にパパイン酵素の痕跡をすべて削除するには、海馬培地5mlを追加削除します。海馬培地（2ml）中のこのステップを再懸濁しますを繰り返します。 </li><li>徐々に小さく穴（1000μmの、〜500μmおよび〜300μm以下）の三火炎研磨ピペットで残って塊が、なくなるまで細胞〜5回をひいて粉にする。 </li><li>一度粉砕し、セルストレーナー（孔径、70ミクロン、BDバイオサイエンス社）を介して細胞を通過する。懸濁液10μlに細胞を数える。 40万細胞/ mlを持つために、海馬のメディアの音量を調整します。 </li><li>カバースリップオフラミニンを吸引し、カバースリップあたりの細胞懸濁液のカバーが乾燥する前に、プレートを200μl。 </li><li>インキュベーター内で60分間添付し、ウェルあたり海馬培地2mlを追加するためにそれらを残す。 </li><li>翌日、死んだ細胞や破片を除去し、予め温めておいた新鮮な海馬培地2mlを追加するには、古い海馬の培地を吸引除去する。 </li></ol> メンテナンス Neurobasalメディア： <ul><li> 500ミリリットルneurobasal（Invitrogen社、12348〜017） </li><li> 10ミリリットルB27の無血清サプリメント（Invitrogen社、17504〜044） </li><li> 5ミリリットルペニシリン - ストレプトマイシン（Invitrogen社、15140〜122） </li><li> 1.25ミリリットル、L -グルタミン（Invitrogen社、25030〜149） </li></ul>メッキ後4日から始まる、neurobasal培地でアストロサイトニューロンの培養週に2回通します。温度とCO 2を平衡化するために換気フラスコ内のインキュベーターで30分程度のメディアをPreincubate。 パート2：カルシウムイメージング海馬レコーディングバッファ：110 mMのNaCl、5.4 mMののKCl、1.8 mMのCaCl 2を 、0.8 mMのMgCl 2、10mMのD -グルコース、10mMのHEPES（シグマからすべての化学物質）を用いてpH 7.4（NaOHで調整）。 アストロサイトへのカルシウム指示薬のロード <ol><li> （Invitrogen社、DMSOは2.5μMであるFluo - 4、AM（Invitrogen社、F - 14217）と、0.05％プルロニック® F - 127 20％溶液の入った2ミリリットル海馬記録バッファーを充填した6ウェルプレートにウェルに文化を置きますP - 3000MP）と,10 - 30分間室温でインキュベートする。 </li><li>であるFluo - 4ソリューションを削除し、30分間室温で海馬の記録バッファとインキュベートしてカバーグラスを3回洗浄。 </li><li>チャンバーにカバースリップを置き、レンズクリーニング液でカバースリップの反対側を清掃してください。 </li><li>客観的に液浸オイルの一つの小さな滴（Cargilleから液浸オイルタイプのDFを）入れて、顕微鏡のステージ（オリンパスIX71）にチャンバー（ワーナー音源から25 mmの円形のカバーのオープンチャンバー）を置く。 </li><li>細胞がどのように見えるかを確認し、フォーカスにそれらを得るために透過光を用いて細胞を調べます。その後モノクロから488 nmの（ビジョンTILLからポリクロームV）で細胞を照らすとみたFluo - 4の蛍光シグナルがアストロサイトで均​​一と検出可能であるかどうかを判断する。 </li><li>アストロサイトのカルシウムを測定するために、EPIと全反射照明を使用してください。 </li></ol> 全反射顕微鏡 簡単に言えば、我々は、アンドールIXON DV887DCS EMCCDカメラを搭載したオリンパスIX71顕微鏡を使用してください。励起と画像取得の制御は、TILLVisionのソフトウェアを使用して実現されます。 454/488/515 nmのアルゴン（100 mWの）および442 nmの固体状態（45 MW）レーザのビームを組み合わせて使用​​して制御されるまで、ポリラインレーザーコンバイナ、TIRFデュアルポートのコンデンサーとacoustopticalチューナブルフィルタとコントローラ（AOTF;すべてからフォトニクスTILL）と全反射のコンデンサーに入るためKineflex広帯域光ファイバに供給。我々は、全反射を達成するためにオリンパス60X 1.45 NAのレンズを使用。カメラのゲインは、ノイズ画像に最適な信号を提供するために、それぞれの星状膠細胞に調整されます。背景と全反射顕微鏡の原理は、最近、5日している。我々が使用する光学部品のほとんどは、今アジレントテクノロジー（http://www.till-photonics.com/）の一部であるフォトニクス、TILLから購入した。 TIRの侵入深さは次式から計算することができます。 <img style="float:left;" src="/files/ftp_upload/1142/equation.png" alt="式" /> D =侵入深さガラスのN1 =屈折率セルのN2 =屈折率発生率の=角発生率のNAI =開口数 レーザーは全反射のために最適に整列されていることを確認するために我々は100nmの蛍光ビーズ（Invitrogen社、F8803）を観察すると便利です。我々は、EPIと全反射顕微鏡でビーズの静止フレームとビデオを提示する。ときに全反射で、一つは信号対雑音の劇的な増加を観察し、ビーズはブラウン拡散が表示されます。我々は最適な全反射ではなく、臨界角に等しいではなかった場合に発生する危険にさらさ斜入射照明ではなく、発生したことを確認するために、定期的に全反射顕微鏡と100 nmのビーズ（〜週1回）の挙動を観察すると便利ですα（図1参照）。 G蛋白質共役型受容体アゴニストのアプリケーション アストロサイトは、代謝型グルタミン酸受容体とP2Y受容体（アゴニスト、ATP、ADP）を含むGQ -共役受容体6,7の様々な表現。これらの受容体の活性化は、星状膠細胞内細胞内カルシウムレベルの大幅な増加につながる。例えば、人は容易にアストロ8-10にATP（30μM）の適用時に細胞内カルシウムの上昇を観察することができます。我々はワーナー音源からのスイッチャーは、VC - 77SPファーストステップ灌流システム（http://www.warneronline.com/index.cfm）と呼ばれる高速なソリューションを使用してください。この方法では解決策は以下〜10ミリ秒未満に適用することができます。 <img src="/files/ftp_upload/1142/Fig 1a.jpg" alt="図1" /> <img src="/files/ftp_upload/1142/fig1c.jpg" alt="" /> 図1漫画やイメージングの写真は、設定する。 （B）レーザーアセンブリ、コントローラとビームボックスの写真を示すのに対し、A.は、airtableにマウントされている顕微鏡の写真を表示します。 C.は、イメージングのためにマウントされているチャンバーと顕微鏡のステージの写真を表示します。左の高速灌流装置（ステッピングモーターとシータのチューブと一緒に）見ることができます。右上Axopatch 200Aアンプのヘッドステージが見られる。漫画はセット内の光パスをschematizesとどのようにTIRFが達成されます。レーザーは、60X 1.45 NAの対物レンズの後焦点面に焦点を当てて、それが臨界角をαでイマージョンオイルに出てくるようにその位置がセンターをオフに調整されます。この時点で、ビームは、より低い屈折率の媒質中に距離λ（メインテキストの式を参照）で内部全反射と減衰に苦しんでいる。この場合、これはアストロサイトとアストロサイト自身を取り巻く録音バッファです。結果は、形質膜の〜100nmの内の分子の光学的励起（したがって画像）です。細胞内や細胞の上部表面上のものが励起されていないのに対し、細胞の漫画では、これは、緑色の&quot;興奮&quot;膜受容体として示されています。全反射顕微鏡の完全なアカウントはSteyerとAlmers 4で提供されています。 <img src="/files/ftp_upload/1142/fig2.png" alt="図2" /> 図2。EPIと全反射顕微鏡で取得した100nmの蛍光ビーズの画像。 A.は、数十100nmの蛍光ビーズと視野のEPI画像を表示します。青い矢印は水の拡散であるビーズを指すのに対し、ガラスのカバースリップの上に定住しているビーズに赤い矢印のポイント。このビューではAに示すようにB.は赤い矢印で示される接着ビーズが表示されるビューの同じフィールドの全反射画像を表示します。これらはガラスのcoverlsipに定住し、〜100nmのエバネッセント場内でこのようにしたしていたためです。青色の矢印でに示されているビーズは、この領域内にないため、全反射の画像では見えません。下のプロットは、画像の3Dレンダリングを示しています。それは、全反射顕微鏡で観察すると、信号対ノイズの大幅な増加は、エバネッセント場内のビーズのために起こることは明らかである。全反射のためにそれが20であったのに対し± 0.7実際にはこれらのイメージのためにEPIのための信号対雑音比は、7.1 ± 0.6であった。 <img src="/files/ftp_upload/1142/fig3.png" alt="図3" /> 図3。EPIと全反射顕微鏡で取得したフルオ-4カルシウム指示薬を搭載したアストロサイトの画像。 fiveアストロサイトとビューのフィールドのA. EPI画像。 AとBのイメージが大きく異なることをBに示すように、B.ビューの同じフィールドの全反射像は注意してください。 TIRF照明とガラスのカバースリップに近い同格でのみ細胞膜領域がイメージングされているためです。下のパネルでは、EPIと全反射顕微鏡で撮像ATP誘発細胞内カルシウムトランジェントを示しています。

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</ol>

それは、アストロサイトは細胞内カルシウムの上昇を表示することが十分に確立されている。これらは自発的に発生する、アストロサイト表面11上の受容体を活性化するニューロンの活動によって、またはアゴニストのアプリケーションによってトリガーすることができます。一つの重要なと論争はアストロサイト細胞内カルシウムの上昇が神経細胞11、12に受容体を活性化するシグナル伝達分子の放出を引き起こすことができるかどうかです。としてヘイドン7、13とマッカーシー11ラボによるレビューで強調表示されているこのビューのと反対の証拠が、あったので、これは物議を醸している。我々の最近の脳スライスイメージングと電気生理学的データに基づいて、我々は新たな仮説駆動型の実験はどのようにアストロサイトの影響のニューロン14を決定するように設計することができます前に、アストロサイトのカルシウム動態の向上と正確な理解が必要であると主張した。このビデオの記事では、形質膜と培養アストロサイトにおけるほぼ同時に世界的な細胞​​内カルシウムの変化に近い画像に簡単な方法を提示する。全反射顕微鏡の避けられない技術的な要件は、エ...

<table><tbody><tr><td>VWR&amp;#174; マイクロカバーガラス、円形、No. 1</td><td>器具</td><td>VWR international</td><td>48380-068</td><td></td></tr><tr><td>ポリD-リシン臭化水素酸塩</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>ラミニン (Engelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫基底膜由来)</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Earle&amp;rsquo;s 平衡塩溶液 (EBSS) (1X)、液体</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>14155-063</td><td></td></tr><tr><td>最小必須培地 (MEM) (1X)、液体（Earle&amp;rsquo;s塩を含むが、L-グルタミンおよびフェノールレッドを含まない）</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン液体</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム溶液</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>HEPES溶液 1 M</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>N-2 サプリメント (100X)、液体</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>ウマ血清、熱不活化</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>PAPAIN-022</td><td>試薬</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal&amp;#8482; 培地 (1X) 液体（フェノールレッド不含）</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>B-27 無血清サプリメント (50X)、液体</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン-200 mM (100X)、液体</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>25030-149</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー</td><td>器具</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon マルチウェル平底プレート（蓋付き、滅菌済み）</td><td>器具</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 六水和物</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21108</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 六水和物</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>HEPES フリーアシッド</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4, AM 1 mM DMSO溶液</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>F-14217</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic&amp;#174; F-127 20% DMSO溶液</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>浸漬油 TYPE DF</td><td>顕微鏡</td><td>Cargill Labs</td><td>16242</td><td></td></tr><tr><td>オープンチャンバー (25 mm円形カバーガラス用、容量 100 &amp;mu;l)</td><td>器具</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0362 (RC-21BDW)</td><td></td></tr><tr><td>P-2 プラットフォーム (Series 20 チャンバー用、ヒーターなし)</td><td>器具</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0278 (P-2)</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres カルボキシ基修飾マイクロスフィア、0.1 &amp;mu;m、黄緑色蛍光 (505/515)、固形分 2%</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>F8803</td><td></td></tr></tbody></table>

アストロサイトの細胞膜とグローバル細胞内カルシウム動態の近くの測定

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

脳は、グリア細胞が含まれています。アストロサイト、グリア細胞の種類は、神経細胞に受動的な支援する役割を提供するために長い間知られている。しかし、増加する証拠は、アストロサイトはまた、積極的に神経細胞との機能的な相互作用を介して脳機能に関与する可能性を示唆している。しかし、アストロサイト生物学の多くの基本的な側面は、議論の不明確及び/または実験的に未踏のまま。重要な問題の1つは、アストロサイトにおける細胞内カルシウムトランジェントのダイナミクスである。カルシウムが十分に重要なセカンドメッセンジャーとして確立されているため、それがアストロサイトのカルシウムの上昇は、アストロサイトからの伝達物質の遊離を引き起こすことができることが提案されているので、これは関連しています。しかし、アストロサイトのシグナル伝達の近くに、細胞膜のカルシウムの任意の詳細や満足な説明がされていません。全内部反射蛍光（全反射）顕微鏡は、生きた細胞の原形質膜の約100nm内で生理学的に関連するシグナル伝達事象を分析するための強力なツールです。ここでは、全反射顕微鏡を使用し、ほぼ同時に形質膜とグローバルな細胞内カルシウム動態の近くに監視する方法について説明します。このアプローチのさらなる改良と体系的なアプリケーションは、アストロサイトのカルシウムシグナル伝達の正確な詳細をお知らせする可能性があります。アストロサイトのカルシウム動態の詳細な理解は、次の場合に、どのように、いつ、なぜアストロサイトとニューロンはカルシウム依存性の機能的相互作用を受ける理解する基礎を提供することがあります。

我々は内部全反射し、落射蛍光顕微鏡を用いて培養アストロサイトにおける膜とグローバルな細胞内カルシウム動態の近くで測定する方法について説明します。

脳にはグリア細胞が存在します。グリア細胞の一種であるアストロサイトは、ニューロンに対して受動的な支持的役割を果たすことが古くから知られていました。しかしながら、...

このビデオの前半では、アストロサイトとニューロンの共培養の調製方法を実演します。まず、P1ラットから採取した複数の海馬をチューブに入れ、プロパネースで消化させ、トリプシンで解離させた後、カバーガラス上に播種します。後半では、アストロサイトにおける細胞内カルシウムダイナミクスの測定方法について説明します。これには、カルシウム指示薬のFluo-4をアストロサイトにロードし、エピ蛍光顕微鏡を用いて全体的なカルシウムダイナミクスを、またTIRF顕微鏡を用いて膜近傍のカルシウムダイナミクスを測定する工程が含まれます。照明を自動的かつ迅速に切り替えることで、細胞全体のカルシウム濃度と膜近傍のカルシウム濃度の両方をほぼ同時に観察することができます。こんにちは。私はカリフォルニア大学ロサンゼルス校生理学部のBudget COS研究室の博士研究員、Aji omiです。今日は、アストロサイトのカルシウムイメージングの手順をご紹介します。当研究室では、アストロサイトにおける膜近傍および細胞全体のカルシウムダイナミクスを研究するためにこの手法を用いています。除去を自動的かつ迅速に行うことで、細胞全体のカルシウムと膜近傍のカルシウムを分離して解析することが可能です。また、ほぼ同時に、アストロサイトにカルシウム上昇を誘発させるためにTPをどのように適用するかも示します。最後に、アストロサイトの研究手法を用いて、バリアについてまとめと考察を行い、締めくくります。それでは、研究を始めましょう。アストロサイトの培養を開始するために、斬首したラット幼仔の頭部から皮膚と頭蓋骨を取り除きます。脳を冷たい解剖用培地を満たしたペトリ皿に入れ、両半球を解剖し、髄膜を除去します。次に、海馬を解剖します。海馬を約1 mm × 1 mmの大きさに細切します。Pappa溶液中で37 °C、11〜13分間消化させます。インキュベーターから解剖した組織を取り出します。組織片が沈殿したら、プロパン消化液から注意深く取り出し、5 mLの海馬培地を加えて、細切した海馬の組織片を洗浄します。この工程を繰り返し、最後に海馬培地で再懸濁します。炎で研磨した、段階的に細い3本のピペットを用いて、細胞を約5回トリチュレーションします。その後、孔径 70 $\mu\text{m}$ のセルストレーナーに細胞を通過させ、ストレーナーに4 mLの培地を加えます。懸濁液10 µL中の細胞数を計測します。1 mLあたり400,000個の細胞数になるように、海馬培地の容量を調整します。次に、細胞懸濁液を播種するためのカバーガラスを準備します。一晩ラミネート溶液に浸しておいたカバーガラスから、ラミネートを吸引して除去します。カバーガラスが乾く前に、細胞懸濁液を1枚あたり200 µLずつ分注します。インキュベーター内で60分間静置し、細胞を接着させます。インキュベーション後、ウェルあたり2 mLの海馬培地を加えます。翌日、死細胞やデブリを除去するために古い海馬培地を吸引し、あらかじめ温めておいた新鮮な海馬培地を2 mL加えます。アストロサイトとニューロンの共培養の維持は、播種から4日後に開始し、新鮮なNeurobasal培地を1 mL、週2回添加してください。培地は、温度と二酸化炭素濃度を平衡化させるため、通気性のあるフラスコを用いてインキュベーター内で約30分間プレインキュベートさせてください。アストロサイトを観察する前に、ナノ蛍光ビーズを用いてTURFのレーザー角度を最適化させることが有用です。そのためには、ペトリ皿に200 µLの水を入れ、100 nmの蛍光ビーズを1 µL加え、混合した後、エピ蛍光顕微鏡でビーズを観察します。次に、TURF顕微鏡でビーズを観察します。カルシウムイメージングを行うため、2.5 µMのfluo-4 AMと0.05%のionic F127（DMSO 20%溶液）を含む海馬記録バッファー2 mLを満たした6ウェルプレートのウェルに、培養物を配置し、室温で10〜30分間インキュベートします。この際、蛍光色素の退色を防ぐため、プレートに蓋をすることを忘れないでください。fluo-4溶液を除去し、カバースリップを海馬記録バッファーで3回洗浄します。洗浄したカバースリップを室温で30分間インキュベートします。カバーガラスをチャンバー内に配置し、カバーガラスの反対側をレンズクリーニング液で清掃した後、hippocampal bufferを200 µL加えます。対物レンズに浸油を少量滴下し、チャンバーを顕微鏡のステージ上に設置します。透過光を用いて細胞を観察し、ピントを合わせて細胞の状態を確認します。次に、モノクローム光源を用いて488 nmで細胞を照射し、Fluo-4の蛍光信号が一様で検出可能かを確認します。アストロサイトでは、エピ照明およびターフ照明を用いてアストロサイト内のカルシウムを測定します。ここでは、エピ照明によって蛍光ビーズを観察しています。これらは背景蛍光を発生させるだけでなく、照明角度に応じて顕著なブラウン運動も示します。レーザーが臨界角に近づくと、レーザービームはガラスと水の界面で全反射します。この全内部反射により、エバネッセント場と呼ばれる電磁場が生成されます。これは、屈折率の低い細胞内へと約100 nanometersの深さまで達しています。試料表面のこの薄い層にある蛍光体を励起させることができます。ここでは、エピ照明と比較したときの透過照明で観察された蛍光ビーズを示します。角度を小さくすると、照明の信号対雑音比（S/N比）が大幅に向上します。レーザービームは表面で反射せず、カバースリップを透過して蛍光ビーズに直接当たります。これにより、多くの背景蛍光を確認することができます。次に、角度を大きくします。ここでも背景ノイズが大幅に減少し、カバーガラス表面付近の蛍光ビーズを確認できます。これらの画像は、Fluo-4をロードしたアストロサイトとニューロンを示しています。アストロサイトは微細な突起を持つ扁平な細胞であるのに対し、ニューロンは円形の細胞体と太くて長い樹状突起を持っています。アストロサイトとニューロンの両方が健全な状態で、適切にフルオレセインが充填されているように見えます。エピ蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡でアストロサイトを観察することは、アストロサイトが健全であるか、およびカルシウムインジケーターが適切にアストロサイトに導入されているかを確認するのに有用です。カバーガラスに最も近い「フットプリント」と呼ばれるアストロサイトの領域では、TPによって細胞膜付近でカルシウム濃度の上昇が観察されます。海馬のアストロサイトは純粋なアネルギー性受容体を発現していることが知られており、バスにTPを添加すると全般的なカルシウム放出が引き起こされることがあります。以上で、海馬アストロサイト培養の調製方法と、アストロサイトにおける細胞全体および細胞膜近傍のカルシウム濃度の測定方法について説明しました。この手順を行う際は、レーザー角度の最適化が重要です。顕微鏡でこれを確実に行う最善の方法は、100 millimeterの流速での挙動を観察することです。細胞全体のカルシウム濃度と膜近傍のカルシウム濃度を同時に記録することで、カルシウムシグナルの詳細な記述が得られるだけでなく、アストロサイトにおけるカルシウム調節機構に関する新たな知見が得られます。また、ここで説明した手法は、他の興奮性細胞などの未知の興奮性領域における、膜近傍および細胞内全体のカルシウムレベルを測定する際にも有用であると考えられます。以上になります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験がうまくいくことを願っております。

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生物学

隔離された海馬から急性脳スライスだけでなく、アストロサイトとニューロンの同時電気生理学的記録の準備...

急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

出典: Bannai, H., et al., Dissection of Local Ca2+ signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators. J. Vis. Exp.

アストロサイトにおけるコンパートメント特異的ダイナミクスのための自発的カルシウムイメージング

ここでは、アストロサイトのGタンパク質共役受容体の可塑性の研究のためのニューロンにおいて恒常的な可塑性を誘導するために使用されるプロトコルの適合を記載している。最近、幼若マウスにおけるIのmGluRアストロサイトのグループ内の変化を調べるために使用される、この方法は、 インサイチューおよびインビボで 、成体マウスからの組織において、種々の星状細胞GPCRのスケーリングを測定し、星状細胞受容体の感受性のより良い理解を得るために適用することができる神経活動の変化に。...

神経発火率を操作することによってアストロサイト受容体の可塑性を誘導すること

線条体におけるアストロサイトの細胞内Ca2+シグナルの特性と機能は、まだ完全には調査されていません。血清型2/5のアデノ随伴ウイルス(AAV2/5)を使用して、線条体アストロサイトで遺伝的にコードされたカルシウムインジケーターを発現する方法、および線条体アストロサイト内のCa2+シグナルをin...

イメージング細胞内Ca 2+シグナル

ここで記述されている AWESAM プロトコルは、高速、簡単、かつ安価な方法で他の脳細胞から分離してマウスアストロを培養に最適です。AWESAM アストロ サイトを示す自発的 Ca2 +シグナリング、形態、遺伝子発現プロファイル体内のアストロ...

生体内培養-高速、シンプルで、安価な AWESAM プロトコルを使用してマウスのアストロ サイトのように

ここで説明は、(1) たてそのまま脳血管内皮「チューブ」と内皮細胞のカルシウムと膜内皮由来過分極電位 (2) 同時計測を隔離するためのプロトコルです。さらに、これらのメソッド内皮細胞カルシウムと個々...

細胞内カルシウムと新鮮な分離とそのままマウス脳血管内皮細胞の膜電位の同時計測

ここで Ca2 +イメージング ニューロンとグリア細胞内 Ca2 +シグナル細胞レベル下の解像度での解剖を可能にするためのプロトコルを提案する.このプロセスは、遺伝子にエンコードされた Ca2...

膜をターゲットとした Ca2 +インジケーターによる培養細胞のローカル Ca2 +シグナルの解剖

ここでは、マウスアストロサイトにおけるオルガネラの細胞内輸送と血漿膜タンパク質の取引を可視化するインビトロライブイメージング法について述べる。このプロトコルはまた、貨物輸送の旅程と運動学を決定するための画像分析方法論を提示する。...

アストロサイトにおけるオルガネラおよび他の貨物の細胞内輸送の可視化と解析

このプロクトーコルは、アストロサイトおよびニューロン におけるインビトロ および インビボ ミトコンドリアCa2+...

遺伝子組み換えCa2+ 指標(GEC)を用いたアストロサイトとニューロンのイメージングミトコンドリアCa2+ 取り込み

現在の方法は、容易に入手可能な遺伝的にコードされたカルシウム指標を使用して、カエノラブディティスエレガンスのin...

in vivoでの神経細胞カルシウムハンドリングの細胞内イメージング

このプロトコルは、複数の記憶関連脳領域にまたがるニューロンおよびアストロサイトからのカルシウム信号を同時に記録する方法を包括的に説明し、学習および記憶行動のパラダイムにおける応用を示しています。...

学習および記憶行動中の複数の脳領域にわたるアストロサイト-ニューロン活動を記録するための二色ファイバーフォトメトリー法

学ぶアストロサイトの細胞膜近傍とグローバルな細胞内カルシウム動態の測定法。ラット海馬由来の共培養細胞を用いて、全反射蛍光顕微鏡とエピ蛍光顕微鏡でカルシウムイメージングを行う手法を解説します。

アストロサイトの細胞膜とグローバル細胞内カルシウム動態の近くの測定

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