Name: の14日齢の苗の組織からのプロトプラストの単離シロイヌナズナ /em (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-17T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: 学ぶシロイヌナズナの14日齢苗からのプロトプラスト単離法。酵素処理と密度勾配遠心により、96時間以上生存する完全な原形質球を効率的に調製する植物細胞生物学の実験手法です。

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この作品は、スタートアップ助成金は、OKVに授与コーネル大学農業試験場（CUAES）NYC - 125433ハッチグラントとコーネルによってサポートされていました

パート1。植物栽培用固形培地の調製。 集中Murasigeと1％ショ糖および0.7％寒天を添加したスクーグ（MS）培地上で我々は通常、カルチャの植物。それは植物が健康を保つために必要なすべての成分が含まれています。 MSの1L、メディアのpH 5.7調製するための <ol><li> 1.5 - 2.0Lオートクレーブ可能なボトルに水800mlにMSの粉末2.15gを追加します。 </li><li>ボトルに攪拌棒を配置し、攪拌プレート上で培地を攪拌することにより、MSパウダーを溶かす。 </li><li>撹拌しながら、5.7にMS培地のpHを調整するために、滴、1N KOHを加える。 </li><li>ショ糖10 gを追加し、攪拌してください。 </li><li>寒天7gを追加* </li><li> 1000 mlに調製した培地の最終的な音量を調整し、オートクレーブで滅菌.* </li><li>場所は、攪拌プレート上で培地をオートクレーブ処理し、攪拌しながら、それを冷ます、その寒天が瓶の底に沈殿しないように。 〜60℃*に培地を冷やす</li><li> 100ミリメートルペトリ皿に注ぐ。 4でプレートを保つ℃に</li></ol> *ヒント1：寒天を溶解しようとしないでください。それは、オートクレーブ中に可溶化されます。 *ヒント2：オートクレーブ中に瓶の中に攪拌棒を保つには、後で必要になります。 *ヒント3：あなたが10秒間高圧蒸気滅菌瓶にあなたの手を保つことができるなら、それは媒体が十分冷えてからして、プレートを注いで開始できることを意味します。 パート2。植物材料と成長条件。 <ol><li> シロイヌナズナの種子を滅菌<ol><li>エッペンドルフ微量遠心チューブに種子100 mgを置き、70％エタノール1 mlを加える。よく混和して、2分間インキュベートする。 、種をスピンダウンし、上清を吸引除去する。 </li><li> 1.8％漂白剤溶液1mlを追加* 0.1％Tween - 20を含む。 10分間混ぜる。種子や吸引漂白剤溶液をスピンダウン。 </li><li>このステップでは、層流フードで行う必要があります。種に滅菌水1 mlを追加、よく混ぜる。水を吸引、種子をスピンダウン。このステップを5回繰り返します。 </li></ol></li><li>ステップ1プレート（100粒/プレート）で調製に種を広げる。 </li><li> 4℃で24〜48時間のためにシードのプレートを保持°層別化のための暗所で。 </li><li> 19分の23 ° Cの明/暗、温度体制で8時間light/16時間暗光周期（250マイクロモル、M -2 s -1の光合成光量子束密度時）で生育チャンバー内で14日間の植物を育て、75％の相対湿度。 </li></ol> *ヒント1：ブリーチ溶液を6％の次亜塩素酸ナトリウムを含む、0.1％の最終濃度にTween - 20を追加して、希釈家庭クロロックスがアップされています。 第3部。 シロイヌナズナ実生からのプロトプラストの単離。 <ol><li>濾過滅菌TVL溶液15mlで新鮮なカミソリの刃と14日齢の実生のスライス2グラム。我々は、無菌使い捨てペトリ皿に植物材料を切る。 </li><li> 200mlのビーカーに刻んだ組織を転送する、フィルター滅菌した酵素液、スワール酵素溶液で組織のミックスは、パラフィルムとアルミ箔でカバーできるようにビーカーの20mlを加える。 </li><li> 16〜18時間室温で暗所で35 rpmで植物組織を振る</li><li>チーズクロスの8層、W5ソリューションのプリウェットを通してふるいに50 mlのFalconチューブ中に放出されたプロトプラストを集める。 </li><li> W5溶液15mlで布を洗浄することによりチーズクロスつのより多くの時間からふるいプロトプラスト。 </li><li>糖勾配を乱さないように、W5溶液の10mlでプロトプラストを慎重にオーバーレイ、100 gで7分間遠</li><li>酵素液とW5ソリューション（図1B）の界面でのプロトプラストの10mlを収集し、新しい50 mlのFalconチューブに移す。 </li><li> 15ミリリットルW5溶液、60 gで5分間遠心分離を追加します。上清を取り除く。 </li><li> 60グラムで5分間遠、W5溶液の15ミリリットルでプロトプラストを懸濁することにより、酵素液から遊離プロトプラストを洗う</li><li> 1〜3ミリリットルW5溶液の上清、再懸濁しますペレットプロトプラストを削除します。 </li><li>血球計でカウント細胞によるプロトプラストの収量を評価する。 </li></ol>パート4。試薬： TVL：0.3 Mソルビトール、50mMのCaCl 2をフィルター滅菌し、-20℃で保存します。 酵素溶液：0.5 Mのショ糖、10mMのMES - ​​KOH [pHを5.7]、20mMのCaCl 2を 、40mMのKClを、1％セルラーゼ（小野塚R - 10）、1％Macerozyme（R10）。フィルター滅菌し、新鮮な使用。 W5解決策：0.1％（w / v）のグルコース、0.08％（w / v）の塩化カリウム、0.9％（w / v）の塩化ナトリウム、1.84％（w / v）のCaCl 2を 、2mMのMES - ​​KOH pHは5.7。ろ過滅菌し、室温で保管してください。 パート5：代表的な結果： パート1および2で説明したシロイヌナズナ培養条件を使用すると、プロトプラスト（図1A）を単離するのに適した健康な苗を、レンダリングします。プロトプラストは、ショ糖密度グラジエントによって精製されていますENTの遠心分離とW5と酵素のソリューション（図1B）のインターフェースで収集。第3部で説明したプロトプラストの単離法を用いて、我々は一般的に新鮮な苗1グラムから無傷のプロトプラストの5-10 10 6（図1C）を収穫。 <img src="/files/ftp_upload/1149/Fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。シロイヌナズナ実生からのプロトプラストの単離。 、シロイヌナズナの14日齢の実生からの組織が ​​あるのは、変更手続き（チェンとHalkier、2000）によって収集し、プロトプラストに変換された。B、プロトプラストは、ショ糖密度勾配遠心法により精製し、酵素液の界面で収集していたW5 uffer（ 白矢印 ）。C、プロトプラストの明視野顕微鏡。顕微鏡はツァイスのAxioscope 2に加え、顕微鏡とインタフェース冷却CCDカメラを用いて収集した。

<ol><li>Cocking, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+the+Isolation+of+Plant+Protoplasts+and+Vacuoles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles.</a> Nature. 187, 962-963 (1960).</li>
<li>Chen, S., Halkier, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+glucosinolate+uptake+by+leaf+protoplasts+of+Brassica+napus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus.</a> J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).</li>
<li>Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+intact+vacuoles+from+Arabidopsis+rosette+leaf-derived+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts.</a> Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).</li>
<li>Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+a+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).</li>
<li>Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+RNAi+as+a+reverse+genetic+approach+for+gene+functional+analysis+in+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Phys%22%5BJournal%5D)">Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts.</a> Plant Phys. 149, 642-652 (2009).</li>
</ol>

植物遺伝子の機能解析で、その使用のためにこの手順を記述した仮特許は、技術企業と商業化コーネルセンター（CCTEC）、2008年6月に提出されています。レシートは50341/015001ない：Vatamaniuk、[OK]を、そして斎、植物遺伝子の迅速な機能解析のためのZ.方法。

無傷のプロトプラストを高収率を確保するためには、健康な植物で、起動に非常に重要です。プロトプラストを単離するための溶液をろ過滅菌して使用してください。プロトプラストが壊れやすいことに注意してください。したがって、プロトプラストを処理する際に、ピペットまたはそれはそれらを制動される精力的に以来、渦、それらを混在させないでください。代わりに、徐々に遠心分離管を回転させたり、テープでプロトプラストを混ぜ合わせる。説明する手順は、少なくとも96時間のための実行可能な無傷プロトプラストを得るしたがって、プロトプラストを二本鎖RNA干渉（RNAi）など3月5日で細胞のような蛋白質の細胞内局在などのプロセス、分離および無傷の細胞小器官と遺伝子不活性化ターゲットの様々な分析を研究するために使用することができます。

<table><tbody><tr><td>ムラシゲ・スクーグ基本塩類混合物 (MS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ(100x15mm)</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>82-4001</td><td></td></tr><tr><td>セルラーゼ（OnozukaR）&amp;#8208;10)</td><td>Research Products International Corp.</td><td>C32200</td><td></td></tr><tr><td>マセロザイム(R10)</td><td>Research Products International Corp.</td><td>M22010</td><td></td></tr><tr><td>チーズクロスによる拭き取り</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-665-29</td><td></td></tr><tr><td>ラボローテーター</td><td>Fisher Scientific</td><td>1167152Q</td><td></td></tr><tr><td>AllegraX&amp;#8208;15RC遠心機</td><td>VWR international</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>Axioskop 2 Plus顕微鏡</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

の14日齢の苗の組織からのプロトプラストの単離シロイヌナズナ</em

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

プロトプラストは細胞壁が酵素的に除去あった植物細胞で​​ある。異なる植物組織からのプロトプラストの単離は、最初の40年以上前に報告された<sup&gt; 1</sup&gt;それ以来このような細胞内タンパク質の局在、無傷の細胞小器官の分離と二本鎖RNA干渉（RNAi）による遺伝子不活性化標的としての細胞プロセスの様々な、研究するために適応されています<sup&gt; 2月5日</sup&gt;。プロトプラストの分離プロトコルのほとんどは、成熟したシロイヌナズナの葉組織（例えば、35日齢の植物）を使用してください<sup&gt; 2月4日</sup&gt;。我々は、14日齢のシロイヌナズナの苗を用いることにより、既存のプロトコルを変更。この手順では、14日齢の実生の1グラムは、5 10が得られた<sup&gt; 6</sup&gt; -10<sup&gt; 7</sup&gt;少なくとも96時間そのまま残りますプロトプラスト。苗からのプロトプラストの収量は、成熟したシロイヌナズナの葉から調製品と同等ですが、代わりに35〜36日から、プロトプラストの単離は、15日間で完了します。これは成熟した植物を使用するときにプロトプラストを単離するために必要な時間と成長室のスペースを減少させることができ、そのままプロトプラストを必要と下流の研究を促進します。

このビデオでは、シロイヌナズナの14日齢の実生の組織から無傷のプロトプラストを単離するための手順を示しています。分離されたプロトプラストは、少なくとも96時間のためにそのまま残るし、代わりに一ヶ月の成熟植物の苗から分離されていることを考えると、この手順は、無傷プロトプラストを必要とするアッセイを迅速に処理されます。

プロトプラストとは、酵素的に細胞壁を除去した植物細胞のことである。さまざまな植物組織からのプロトプラストの分離は、最初に...

この手順は、14日目にArabidopsisの種子をMS培地（Agar）に播種することから始まります。種子が発芽した後、苗を回収して切断します。その後、植物組織を酵素溶液中で消化し、細胞壁を分解します。得られた混合物をチーズクロスで濾過し、プロトプラストを他の植物組織から分離します。回収したプロトプラストをW five溶液で重ね合わせ、ショ糖密度勾配によりさらに精製します。プロトプラストは、酵素溶液とW five溶液の界面に濃縮されます。実験前に回収し、洗浄します。こんにちは、コーネル大学作物・土壌科学科のリナ・ウォーク研究室のジャン・ジャです。本日は、14日目の aro Ana の TH から完全な光合成体を単離する手順をご紹介します。当研究室では、目的タンパク質の細胞内局在の解析、完全なオルガネラの単離、および二本鎖RNA干渉を用いた遺伝子の機能解析のために、この手順を用いています。それでは、始めていきましょう。まず、1% sucroseと0.7% agarを添加した0.5倍MS培地を1リットル分調製することから手順を開始します。MS粉末を2.15 g量り取ります。スターバーを入れた1.5 Lオートクレーブ対応ボトル内の水800 mLに加え、攪拌機で攪拌しながら粉末を溶解させます。1 N水酸化カリウム溶液を滴下し、pHを5.7に調整します。撹拌を続けながら、10 gramsのスクロースを加えます。次に、7 gramsのアガーを加えます。アガーはここでは溶解しませんが、後のオートクレーブ滅菌時に溶解します。最後に、全量を1000 millilitersに調整します。MS培地を121°Cで20分間オートクレーブして滅菌します。オートクレーブ後も、ボトル内にスターバーを入れたままにします。攪拌機を用いて培地を攪拌し、約60°Cまで冷却します。冷却しながら撹拌することで、アガロースがボトルの底に沈殿するのを防ぎます。ボトルを10秒間持っていられる状態になれば、培地は十分に冷却されており、プレートに分注することが可能です。クリーンベンチへ移動し、培地を150 × 15 mmのペトリ皿に分注します。1プレートあたり90 milliliters。プレートを4 °Cで保存します。プレート内で生育が進み、植物が準備できました。Arabidopsisの種子を準備します。1枚のペトリ皿に播種するため、Arabidopsisの種子を滅菌して植物の育成を開始します。50 µL相当量の種子をエッペンドルフマイクロ遠心チューブに入れます。まず、70%エタノールを1 mL加え、混合してエタノールで滅菌します。エタノール中で2分間十分に静置し、その間に種子を沈降させます。ピペッターを用いてエタノールを可能な限り取り除いた後、漂白剤Tween溶液を1 mL加え、2〜3分おきにボルテックスで攪拌しながら10分間滅菌します。漂白剤溶液を取り除きやすくするため、種子を短時間遠心分離し、可能な限り溶液をピペットで吸い出します。最後の滅菌ステップはラミナーフローフード内で行います。種子に1 mLの滅菌水を加え、十分に混ぜ合わせます。種子を短時間遠心分離し、水を吸引します。この水洗いをさらに4回繰り返します。種子の滅菌が完了したら、MSプレート上に播種します。種子を播種した後、層状化させるため、播種したプレートを4 °Cの暗所で24時間保持します。24時間のインキュベーション後、植物を育成室に移し、14日間育成します。8時間の明期と16時間の暗期の条件下で、14日経過した苗が収穫可能な状態になります。苗を2週間育成させたので、クリーンベンチ内でプロトプラストを調製します。新しいカミソリの刃を使用して、シャーレ内の15 millilitersのフィルター滅菌済みTVL溶液中で、2 gramsの苗を細切にします。次に、刻んだ組織をアルミホイルで包んだ200 milliliterのビーカーに移します。植物細胞壁を分解するため、調製直後のフィルター滅菌済み酵素溶液を20 milliliters加えます。ビーカーを回して混合し、組織を遮光するため、バイオフィルムとアルミニウムホイルで蓋をします。その後、室温で16時間、酵素溶液中で植物組織を振とうします。酵素溶液によるインキュベーション終了後、W5溶液で事前に濡らした8層のチーズクロスに混合液をろ過し、放出されたプロトプラストを50 mLファルコンチューブに回収します。チーズクロスを10 mLのW5溶液でゆっくりと洗浄し、残りのプロトプラストを回収します。これでプロトプラストがファルコンチューブに回収されました。プロトプラストの上に5 mLのWW5溶液を慎重に重層します。W5溶液の添加によって形成された糖濃度勾配を乱さないように注意してください。次に、プロトプラストを100 Gで7分間遠心分離します。プロトプラストは酵素溶液とW5溶液の界面に集まります。界面にある液体を10 mL回収してください。回収したプロトプラストを新しい50 mLファルコンチューブに移し、15 mLのW5溶液を加えます。次に、60 ×gで5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を除去し、プロトプラストを15 mLのW5溶液で再懸濁します。再度、プロトプラストを60 gsで5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を除去し、再懸濁します。沈殿したプロトプラストを1〜2 mLのW5溶液に懸濁します。最後に、顕微鏡下でヘモサイトメーターを用いて細胞数をカウントし、プロトプラストの収量を評価します。ここで述べた培養手順により、消化および密度勾配による分離後のプロトプラスト単離に適した、健全なシロイヌナズナの幼苗が得られます。1 gの新鮮な幼苗を収穫すると、通常5～10 × 10⁶個の完全なプロトプラストが得られます。14日目の Ceiling of Aosis からプロトプラストを単離する方法について説明しました。この手順を行う際、成功は植物の健全性に依存することを覚えておくことが非常に重要です。したがって、本プロトコルで指定されている、ネットミルおよび MS 培地における茎とプレートの比率を維持することが重要です。プレートあたりの培地量です。最後に、ポートプラスは非常に壊れやすいことに注意してください。細胞を取り出した後、ボルテックスではなく、ピペッティングによる緩やかな混合や、上下に混ぜる操作を行い、慎重に取り扱ってください。以上です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

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