Name: の14日齢の苗の組織からのプロトプラストの単離シロイヌナズナ /em (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-17T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: 学ぶシロイヌナズナの14日齢苗からのプロトプラスト単離法。酵素処理と密度勾配遠心により、96時間以上生存する完全な原形質球を効率的に調製する植物細胞生物学の実験手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

この作品は、スタートアップ助成金は、OKVに授与コーネル大学農業試験場（CUAES）NYC - 125433ハッチグラントとコーネルによってサポートされていました

パート1。植物栽培用固形培地の調製。 集中Murasigeと1％ショ糖および0.7％寒天を添加したスクーグ（MS）培地上で我々は通常、カルチャの植物。それは植物が健康を保つために必要なすべての成分が含まれています。 MSの1L、メディアのpH 5.7調製するための <ol><li> 1.5 - 2.0Lオートクレーブ可能なボトルに水800mlにMSの粉末2.15gを追加します。 </li><li>ボトルに攪拌棒を配置し、攪拌プレート上で培地を攪拌することにより、MSパウダーを溶かす。 </li><li>撹拌しながら、5.7にMS培地のpHを調整するために、滴、1N KOHを加える。 </li><li>ショ糖10 gを追加し、攪拌してください。 </li><li>寒天7gを追加* </li><li> 1000 mlに調製した培地の最終的な音量を調整し、オートクレーブで滅菌.* </li><li>場所は、攪拌プレート上で培地をオートクレーブ処理し、攪拌しながら、それを冷ます、その寒天が瓶の底に沈殿しないように。 〜60℃*に培地を冷やす</li><li> 100ミリメートルペトリ皿に注ぐ。 4でプレートを保つ℃に</li></ol> *ヒント1：寒天を溶解しようとしないでください。それは、オートクレーブ中に可溶化されます。 *ヒント2：オートクレーブ中に瓶の中に攪拌棒を保つには、後で必要になります。 *ヒント3：あなたが10秒間高圧蒸気滅菌瓶にあなたの手を保つことができるなら、それは媒体が十分冷えてからして、プレートを注いで開始できることを意味します。 パート2。植物材料と成長条件。 <ol><li> シロイヌナズナの種子を滅菌<ol><li>エッペンドルフ微量遠心チューブに種子100 mgを置き、70％エタノール1 mlを加える。よく混和して、2分間インキュベートする。 、種をスピンダウンし、上清を吸引除去する。 </li><li> 1.8％漂白剤溶液1mlを追加* 0.1％Tween - 20を含む。 10分間混ぜる。種子や吸引漂白剤溶液をスピンダウン。 </li><li>このステップでは、層流フードで行う必要があります。種に滅菌水1 mlを追加、よく混ぜる。水を吸引、種子をスピンダウン。このステップを5回繰り返します。 </li></ol></li><li>ステップ1プレート（100粒/プレート）で調製に種を広げる。 </li><li> 4℃で24〜48時間のためにシードのプレートを保持°層別化のための暗所で。 </li><li> 19分の23 ° Cの明/暗、温度体制で8時間light/16時間暗光周期（250マイクロモル、M -2 s -1の光合成光量子束密度時）で生育チャンバー内で14日間の植物を育て、75％の相対湿度。 </li></ol> *ヒント1：ブリーチ溶液を6％の次亜塩素酸ナトリウムを含む、0.1％の最終濃度にTween - 20を追加して、希釈家庭クロロックスがアップされています。 第3部。 シロイヌナズナ実生からのプロトプラストの単離。 <ol><li>濾過滅菌TVL溶液15mlで新鮮なカミソリの刃と14日齢の実生のスライス2グラム。我々は、無菌使い捨てペトリ皿に植物材料を切る。 </li><li> 200mlのビーカーに刻んだ組織を転送する、フィルター滅菌した酵素液、スワール酵素溶液で組織のミックスは、パラフィルムとアルミ箔でカバーできるようにビーカーの20mlを加える。 </li><li> 16〜18時間室温で暗所で35 rpmで植物組織を振る</li><li>チーズクロスの8層、W5ソリューションのプリウェットを通してふるいに50 mlのFalconチューブ中に放出されたプロトプラストを集める。 </li><li> W5溶液15mlで布を洗浄することによりチーズクロスつのより多くの時間からふるいプロトプラスト。 </li><li>糖勾配を乱さないように、W5溶液の10mlでプロトプラストを慎重にオーバーレイ、100 gで7分間遠</li><li>酵素液とW5ソリューション（図1B）の界面でのプロトプラストの10mlを収集し、新しい50 mlのFalconチューブに移す。 </li><li> 15ミリリットルW5溶液、60 gで5分間遠心分離を追加します。上清を取り除く。 </li><li> 60グラムで5分間遠、W5溶液の15ミリリットルでプロトプラストを懸濁することにより、酵素液から遊離プロトプラストを洗う</li><li> 1〜3ミリリットルW5溶液の上清、再懸濁しますペレットプロトプラストを削除します。 </li><li>血球計でカウント細胞によるプロトプラストの収量を評価する。 </li></ol>パート4。試薬： TVL：0.3 Mソルビトール、50mMのCaCl 2をフィルター滅菌し、-20℃で保存します。 酵素溶液：0.5 Mのショ糖、10mMのMES - ​​KOH [pHを5.7]、20mMのCaCl 2を 、40mMのKClを、1％セルラーゼ（小野塚R - 10）、1％Macerozyme（R10）。フィルター滅菌し、新鮮な使用。 W5解決策：0.1％（w / v）のグルコース、0.08％（w / v）の塩化カリウム、0.9％（w / v）の塩化ナトリウム、1.84％（w / v）のCaCl 2を 、2mMのMES - ​​KOH pHは5.7。ろ過滅菌し、室温で保管してください。 パート5：代表的な結果： パート1および2で説明したシロイヌナズナ培養条件を使用すると、プロトプラスト（図1A）を単離するのに適した健康な苗を、レンダリングします。プロトプラストは、ショ糖密度グラジエントによって精製されていますENTの遠心分離とW5と酵素のソリューション（図1B）のインターフェースで収集。第3部で説明したプロトプラストの単離法を用いて、我々は一般的に新鮮な苗1グラムから無傷のプロトプラストの5-10 10 6（図1C）を収穫。 <img src="/files/ftp_upload/1149/Fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。シロイヌナズナ実生からのプロトプラストの単離。 、シロイヌナズナの14日齢の実生からの組織が ​​あるのは、変更手続き（チェンとHalkier、2000）によって収集し、プロトプラストに変換された。B、プロトプラストは、ショ糖密度勾配遠心法により精製し、酵素液の界面で収集していたW5 uffer（ 白矢印 ）。C、プロトプラストの明視野顕微鏡。顕微鏡はツァイスのAxioscope 2に加え、顕微鏡とインタフェース冷却CCDカメラを用いて収集した。

<ol><li>Cocking, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+the+Isolation+of+Plant+Protoplasts+and+Vacuoles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles.</a> Nature. 187, 962-963 (1960).</li>
<li>Chen, S., Halkier, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+glucosinolate+uptake+by+leaf+protoplasts+of+Brassica+napus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus.</a> J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).</li>
<li>Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+intact+vacuoles+from+Arabidopsis+rosette+leaf-derived+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts.</a> Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).</li>
<li>Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+a+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).</li>
<li>Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+RNAi+as+a+reverse+genetic+approach+for+gene+functional+analysis+in+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Phys%22%5BJournal%5D)">Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts.</a> Plant Phys. 149, 642-652 (2009).</li>
</ol>

植物遺伝子の機能解析で、その使用のためにこの手順を記述した仮特許は、技術企業と商業化コーネルセンター（CCTEC）、2008年6月に提出されています。レシートは50341/015001ない：Vatamaniuk、[OK]を、そして斎、植物遺伝子の迅速な機能解析のためのZ.方法。

無傷のプロトプラストを高収率を確保するためには、健康な植物で、起動に非常に重要です。プロトプラストを単離するための溶液をろ過滅菌して使用してください。プロトプラストが壊れやすいことに注意してください。したがって、プロトプラストを処理する際に、ピペットまたはそれはそれらを制動される精力的に以来、渦、それらを混在させないでください。代わりに、徐々に遠心分離管を回転させたり、テープでプロトプラストを混ぜ合わせる。説明する手順は、少なくとも96時間のための実行可能な無傷プロトプラストを得るしたがって、プロトプラストを二本鎖RNA干渉（RNAi）など3月5日で細胞のような蛋白質の細胞内局在などのプロセス、分離および無傷の細胞小器官と遺伝子不活性化ターゲットの様々な分析を研究するために使用することができます。

<table><tbody><tr><td>ムラシゲ・スクーグ基本塩類混合物 (MS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ(100x15mm)</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>82-4001</td><td></td></tr><tr><td>セルラーゼ（OnozukaR）&amp;#8208;10)</td><td>Research Products International Corp.</td><td>C32200</td><td></td></tr><tr><td>マセロザイム(R10)</td><td>Research Products International Corp.</td><td>M22010</td><td></td></tr><tr><td>チーズクロスによる拭き取り</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-665-29</td><td></td></tr><tr><td>ラボローテーター</td><td>Fisher Scientific</td><td>1167152Q</td><td></td></tr><tr><td>AllegraX&amp;#8208;15RC遠心機</td><td>VWR international</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>Axioskop 2 Plus顕微鏡</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

の14日齢の苗の組織からのプロトプラストの単離シロイヌナズナ</em

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

プロトプラストは細胞壁が酵素的に除去あった植物細胞で​​ある。異なる植物組織からのプロトプラストの単離は、最初の40年以上前に報告された<sup&gt; 1</sup&gt;それ以来このような細胞内タンパク質の局在、無傷の細胞小器官の分離と二本鎖RNA干渉（RNAi）による遺伝子不活性化標的としての細胞プロセスの様々な、研究するために適応されています<sup&gt; 2月5日</sup&gt;。プロトプラストの分離プロトコルのほとんどは、成熟したシロイヌナズナの葉組織（例えば、35日齢の植物）を使用してください<sup&gt; 2月4日</sup&gt;。我々は、14日齢のシロイヌナズナの苗を用いることにより、既存のプロトコルを変更。この手順では、14日齢の実生の1グラムは、5 10が得られた<sup&gt; 6</sup&gt; -10<sup&gt; 7</sup&gt;少なくとも96時間そのまま残りますプロトプラスト。苗からのプロトプラストの収量は、成熟したシロイヌナズナの葉から調製品と同等ですが、代わりに35〜36日から、プロトプラストの単離は、15日間で完了します。これは成熟した植物を使用するときにプロトプラストを単離するために必要な時間と成長室のスペースを減少させることができ、そのままプロトプラストを必要と下流の研究を促進します。

このビデオでは、シロイヌナズナの14日齢の実生の組織から無傷のプロトプラストを単離するための手順を示しています。分離されたプロトプラストは、少なくとも96時間のためにそのまま残るし、代わりに一ヶ月の成熟植物の苗から分離されていることを考えると、この手順は、無傷プロトプラストを必要とするアッセイを迅速に処理されます。

プロトプラストとは、酵素的に細胞壁を除去した植物細胞のことである。さまざまな植物組織からのプロトプラストの分離は、最初に...

この手順は、14日目にArabidopsisの種子をMS培地（Agar）に播種することから始まります。種子が発芽した後、苗を回収して切断します。その後、植物組織を酵素溶液中で消化し、細胞壁を分解します。得られた混合物をチーズクロスで濾過し、プロトプラストを他の植物組織から分離します。回収したプロトプラストをW five溶液で重ね合わせ、ショ糖密度勾配によりさらに精製します。プロトプラストは、酵素溶液とW five溶液の界面に濃縮されます。実験前に回収し、洗浄します。こんにちは、コーネル大学作物・土壌科学科のリナ・ウォーク研究室のジャン・ジャです。本日は、14日目の aro Ana の TH から完全な光合成体を単離する手順をご紹介します。当研究室では、目的タンパク質の細胞内局在の解析、完全なオルガネラの単離、および二本鎖RNA干渉を用いた遺伝子の機能解析のために、この手順を用いています。それでは、始めていきましょう。まず、1% sucroseと0.7% agarを添加した0.5倍MS培地を1リットル分調製することから手順を開始します。MS粉末を2.15 g量り取ります。スターバーを入れた1.5 Lオートクレーブ対応ボトル内の水800 mLに加え、攪拌機で攪拌しながら粉末を溶解させます。1 N水酸化カリウム溶液を滴下し、pHを5.7に調整します。撹拌を続けながら、10 gramsのスクロースを加えます。次に、7 gramsのアガーを加えます。アガーはここでは溶解しませんが、後のオートクレーブ滅菌時に溶解します。最後に、全量を1000 millilitersに調整します。MS培地を121°Cで20分間オートクレーブして滅菌します。オートクレーブ後も、ボトル内にスターバーを入れたままにします。攪拌機を用いて培地を攪拌し、約60°Cまで冷却します。冷却しながら撹拌することで、アガロースがボトルの底に沈殿するのを防ぎます。ボトルを10秒間持っていられる状態になれば、培地は十分に冷却されており、プレートに分注することが可能です。クリーンベンチへ移動し、培地を150 × 15 mmのペトリ皿に分注します。1プレートあたり90 milliliters。プレートを4 °Cで保存します。プレート内で生育が進み、植物が準備できました。Arabidopsisの種子を準備します。1枚のペトリ皿に播種するため、Arabidopsisの種子を滅菌して植物の育成を開始します。50 µL相当量の種子をエッペンドルフマイクロ遠心チューブに入れます。まず、70%エタノールを1 mL加え、混合してエタノールで滅菌します。エタノール中で2分間十分に静置し、その間に種子を沈降させます。ピペッターを用いてエタノールを可能な限り取り除いた後、漂白剤Tween溶液を1 mL加え、2〜3分おきにボルテックスで

isolation-protoplasts-from-tissues-14-day-old-seedlings-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

植物材料から、特定の種​​類の細胞を単離する方法が示されている。この手法は、特定の細胞型、細胞の解離と蛍光活性化細胞選別に蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマーカーラインを採用しています。さらに、成長のセットアップがの治療を容易にするここで確立されている...

植物プロトプラストの蛍光活性化細胞選別

空間固有のフィトクロム応答の分子基盤は、組織および器官特異的フィトクロムの欠陥を示すトランスジェニック植物を用いて検討されている。マイクロアレイ解析に続いてソート蛍光活性化細胞により誘導されるフィトクロム発色団の枯渇を示す特定の細胞の単離は、空間的な固有のフィトクロム反応に関与する遺伝子を同定するために活用されています。...

でFACSアシスト細胞型特異的発現プロファイリングを使用して組織と器官特異フィトクロム応答を調査シロイヌナズナ</em

我々は、より開発の初期段階で胚を単離するための効率的で簡単な方法を報告する...

から初期段階の胚の効率的かつ迅速な単離<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;種子

概日時計は、シロイヌナズナのトランスクリプトームの約3分の規制が、計時にフィードバックされる遺伝子の割合は不明のまま。ここでは、急速に一過プロトプラスト内で発現の概日レポーターの発光イメージングを使用して、シロイヌナズナのいずれかの変異体のラインに概日表現型を評価するための方法を視覚化します。...

発光時計レポーターとシロイヌナズナプロトプラストトランスフェにおける概日表現型の迅速分析

ここでは、 シロイヌナズナの葉の葉の葉のプロトプラストに適用されるインタラクトームキャプチャプロトコールを紹介する 。この方法は生体内での UV架橋に批判的に依存し、生理学的環境からの植物mRNA結合タンパク質の単離および同定を可能にする。...

植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

ミトコンドリアは、植物細胞のわずかな割合は、彼ら研究の範囲を精製する必要があります。ミトコンドリアは、均質化、続いて高純度ミトコンドリア分画を取得する微分と密度勾配遠心法によってさまざまな植物器官から分離できます。...

分離とシロイヌナズナ由来のミトコンドリアの呼吸測定

我々 は生きているセルで複雑な規制とシグナル伝達メカニズムを研究するダイズプロトプ...

簡便な分離大豆プロトプ ラストと一過的遺伝子発現解析への応用

ハイスループットscRNA-seqメソッドの実現可能性と有効性は、植物研究におけるシングルセル時代の到来を告げるものです。ここでは、シ ロイヌナズ ナの根の特定の細胞タイプを単離し、その後のトランスクリプトームライブラリの構築と解析を行うための堅牢で完全な手順を紹介します。...

植物細胞タイプの単離とトランスクリプトーム解析

このプロトコルは、 シロイヌナズ...

発育中および成熟 シロイヌナズ ナ種子中の胚乳細胞層の顕微鏡分析のための無傷組織の調製

この記事はのフローラルディップ法を示しています。...

フローラルディップ変換のシロイヌナズナ調べに pTSO2：：β-グルクロニダーゼレポーター遺伝子発現

学ぶシロイヌナズナの14日齢苗からのプロトプラスト単離法。酵素処理と密度勾配遠心により、96時間以上生存する完全な原形質球を効率的に調製する植物細胞生物学の実験手法です。

の14日齢の苗の組織からのプロトプラストの単離シロイヌナズナ

さらに動画を探す