マウス腎移植の手順

マウス腎移植の手順は、まずドナーマウスから左腎を取り出し、氷上で保存するドナー臓器採取から始まります。次に、ドナー腎を移植するためのスペースを確保するため、レシピエントマウスから右腎を除去します。その後、ドナー腎を氷上から取り出し、レシピエントマウスに移植します。

マウスを4日間回復させた後、残っている自らの腎臓を摘出します。7日後、i-STATポータブル臨床分析装置を用いてクレアチニン値をモニタリングし、移植腎の機能を評価します。こんにちは、オハイオ州立大学移植外科およびGreg Hadley博士の研究室のSarah Heimerです。

本日は、マウスにおける腎移植の手順を解説します。今回ご紹介する腎移植手術は、当研究室の専門の脳神経外科医であるJing Wingが行います。移植拒絶の免疫学的機序や、拒絶反応を防止するための戦略を研究するために、当研究室でこの手順をご活用ください。

それでは始めていきましょう。ドナー臓器の採取を開始するため、まず趾（あしゆび）をつねり、動物が完全に麻酔状態にあることを確認します。滅菌領域内で滅菌済みの器具を使用し、麻酔をかけたマウスの胸骨から恥骨まで正中切開を行い、ドナー腎臓の灌流を行うために腸管を右側へ側方に移動させて左腎臓を露出させます。腎動脈および腎静脈の上方と下方の腹大動脈および下大静脈を、4-0シルク縫合糸で結紮します。

腎下大動脈を介して、冷やしたヘパリン添加リンゲル乳酸液で緩徐にin situ灌流を行います。8-0シルク縫合糸を用いて、副腎血管、精巣血管、およびいくつかの腰動脈分枝を結紮・切断し、左腎を単離します。次に、大動脈および下大静脈と左腎動・静脈の接合部を遊離させ、腎動脈および腎静脈の上方と下方で大動脈および下大静脈を4-0シルク縫合糸で結紮します。

出血を最小限に抑えるため、まず腎血管の下方で大動脈を結紮します。次に、左尿管を腎門から膀胱まで剥離します。膀胱ドームをコダ牽引することで、尿管膀胱移行部を露出させます。

右尿管を確実に避けて、左尿管膀胱接合部を含む膀胱の小さな楕円形パッチを切除します。このパッチは、膀胱間吻合による尿路再建に使用されます。その後、腎動脈および腎静脈の上方で大動脈を結紮します。

腎下大動脈を介して、冷やしたヘパリン含有リンゲル乳酸液でラフトをin situでゆっくりと灌流させます。腎動脈の約2mm下方で大動脈を斜めに切断します。最後に、腎臓とその血管供給系を、膀胱パッチに接続された尿管とともにブロックごと摘出します。

腎臓は、宿主レシピエントへの移植準備が整うまで、氷上のリンゲル乳酸液中に保存してください。また、ドナーマウスは麻酔下で頸椎脱臼により安楽死させます。既報の通り、レシピエントへの移植に際しては、動物が十分に麻酔されていることを確認するためにピンチ刺激を行います。手術を開始するために正中切開を行い、腸を濡れたガーゼで覆い、慎重に左側に避けてください。

この腎移植を完遂させるためには、ドナーの大動脈カフとレシピエントの大動脈の間で吻合を行う必要があります。また、ドナーの腎静脈をレシピエントの下大静脈に、ドナーの膀胱パッチをレシピエントの膀胱結紮部に吻合します。右尿管、腎動脈、および腎静脈を処理します。

結紮後、腎臓を取り除きます。腰動脈分枝を慎重に分離し、4 mmの微小血管クランプ2個を用いて、腎下大動脈と下大静脈を遮断します。10-0ナイロン縫合糸を大動脈の全層に通し、牽引しながら、血管径の約5分の1の単一の切開を加え、楕円形の大動脈切開を作成します。

次に、30ゲージの針で下大静脈を刺し、マイクロ鋏を用いて適切に延長して、縦方向の静脈切開を行います。大動脈と下大静脈の両方をヘパリン生理食塩水で洗浄し、管腔内の血液や血栓を除去します。ドナー腎を氷から取り出し、マウスの右側腹部に配置します。

レシピエントの大動脈切開創の近位端と遠位端に、ドナーの大動脈カフと共に2本のステイ縫合糸をかけます。大動脈の外側で、2〜3本の連続的な10-0ナイロン縫合糸を用い、ドナーの大動脈カフとレシピエントの大動脈切開創の前壁との間で端側吻合を行います。その後、ドナー腎移植片をレシピエントの左側腹部に向けて反転させます。

ドナーの大動脈カフとレシピエントの大動脈後壁の間で、前述の手順を繰り返します。切開を行います。静脈と動脈の両方の吻合を20分以内に完了させることが重要です。また、吻合中にグラフトを冷生理食塩水で数回洗浄してください。

ドナー腎静脈とレシピエントの下大静脈後壁との間で、下大静脈の内側から10-0ナイロン縫合糸を用いて4〜5本の連続縫合による端側吻合を行います。次に、下大静脈の外側から4〜5本の連続縫合を用いて、下大静脈前壁とドナー腎静脈を閉鎖します。次のステップは、レシピエント膀胱のドーム部を切開することです。

電気凝固により止血します。固定が完了したら、ドーム部分に小さな切開を加え、10-0ナイロンを用いて2箇所のステイ縫合を行い、ドナーの小膀胱パッチとレシピエントの膀胱ドームを吻合します。吻合部の両側を8〜10回の連続縫合で縫合します。最後に、4-0の滅菌合成吸収性バイクリル縫合糸を用いて、腹部を2層にわたり連続縫合で閉腹します。

術後ケアは、ペニシリンの単回筋肉内注射から開始します。移植レシピエントには、疼痛管理のため、術後0日目と1日目にブプレノルフィンを0.05 mg/kgの用量で筋肉内に投与し、さらにサルファトリム含有水を継続的に供給します。術後24時間は、温度制御されたインキュベーター内で管理します。

皮膚の縫合糸は手術の2週間後に抜糸します。残存している自前の腎臓を摘出することは、血清クレアチニンの測定によって腎移植片の機能低下をモニタリングするために不可欠です。通常、ドナー腎の初回移植から4～7日後に行われ、ドナーマウスから腎臓を摘出する際に用いた主要な手順と同様の手順で行われます。

ホスト動物を鎮静させ血液サンプルを採取するため、ISOフッ素麻酔を使用します。移植片の機能を評価するための指標として、後眼窩からの全血クレアチニン定量値を測定し、i-STATポータブル臨床分析装置を用いて決定します。従来単位は、従来単位に88.4を乗じることでSI単位に変換します。

クレアチニンの濃度は1リットルあたりのマイクロモル（µmol/L）で表記されます。動物は通常、手術後2〜3時間で回復し、残りの自らの腎臓を除去した後は通常のマウスの行動を示します。動物の生存は腎移植片の機能に依存しており、これは動物の全身状態とクレアチニンの値を毎日検査することで評価できます。

リファレンスとして、ポータブルi-STAT臨床分析装置を用いて全血を測定します。非移植の正常マウスのクレアチニン値は 20 µM付近です。マウスに疾患の兆候が見られ、クレアチニン値が 100 µM付近まで上昇した場合に、腎移植片機能不全とみなされます。

以上で、マウスにおける腎移植の手順を説明しました。この手順は技術的に困難ですが、当研究室では高い成功率で実施しています。以上です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。