Name: マウス腎移植の手順 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-10T00:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 48 s
Description: 学ぶマウス腎移植の手順と術後管理の重要性。ドナー腎摘出から移植、クレアチニン値による移植片機能評価までを解説。移植免疫学の研究に有用なモデルです。

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これらの研究は、GAHにNIH R01 AI36532によって資金によって部分的にサポートされていました。我々は博士ティボーナーダシディが提供する移植病理学の傑出したサポート、およびこの研究の努力を開始するには故チャールズG. Oroszが提供する非常に貴重な指針と先見の明に感謝します。

ドナー臓器の収穫（2）： <ol><li> 65mg/kgペントバルビタールIPを使用してドナーを麻酔、麻酔は、イソフルラン（2-3％）によって維持されています。 </li><li>ドナーの腹部を入力し、右側に横方向に腸を動かして、左腎臓を露出させる胸骨から恥骨まで正中切開を加えます。 </li><li> 8から0絹縫合糸で副腎及び精巣の血管を結紮し、分割して左の腎臓を分離します。 </li><li>腎動脈と静脈との接合上記の大動脈を動員する。 </li><li>上記と下記の下大静脈（IVC）腎動脈と静脈との接合を動員する。 </li><li>出血を最小限に抑えるために8から0絹縫合糸で腎動脈と静脈下大動脈をライゲーションする。 </li><li>腎門部から膀胱へ左尿管を細かく分析。 </li><li>膀胱のドームで尾の方に撤回を使用して尿管膀胱移行部を公開します。 </li><li>膀胱から膀胱吻合を介して尿再建のために使用される左尿管膀胱移行部を含む膀胱の物品小さい、楕円形のパッチ。右尿管は膀胱に含まれていません。 </li><li> 8から0絹縫合糸で腎動脈と静脈の下にIVCをライゲーションする。 </li><li>腎動脈と静脈、上記の大動脈を連結し​​、徐々に0.2〜0.4ミリリットル寒さにその場で移植片を灌流、大動脈大動脈を経由して乳酸リンゲル液ソリューションは、ヘパリン化。 </li><li> 8から0絹縫合糸で腎動脈と静脈の上にIVCをライゲーションする。 </li><li> IVCとの接合部で腎静脈を横に切断する。 </li><li>腎動脈下約2mm、斜めに大動脈を割ります。 </li><li>腎臓と一括して膀胱のパッチに添付された尿管とその血管供給を取り外します。氷の上で乳酸リンゲル液ソリューションで保管してください。 </li><li>麻酔下に頚椎脱臼によりドナーマウスを安楽死させる。 </li></ol>受信者移植（2）： <ol><li> 65 mg / kgのペントバルビタールIPで受信者の麻酔とイソフルランによる麻酔（2-3％）を維持する。 </li><li>正中切開を行う、ぬれたガーゼで腸を覆い、慎重に左側にそれを引っ込める。 </li><li>右尿管、腎動脈と静脈を結紮し、右の腎臓を削除します。 </li><li>慎重に腰枝を結紮した後、2つの4 mmのmicrovasularクランプと大動脈大動脈と下大静脈を分離し、クロスクランプ。 </li><li>大動脈の全層を介して10から0ナイロン縫合糸を配置し、シングルカット（血管の直径の約5分の1）で楕円aortaotomyを作るために引っ込める。 </li><li> 30ゲージの針でIVCを刺すことによって縦静脈切開術を行うとmicroscissorsを使用して適切に拡張する。 </li><li>腔内の血液や血栓をクリアするためにヘパリン生理食塩水で大動脈と下大静脈の両方を灌漑。 </li><li>氷からドナーの腎臓を削除し、マウスの右脇腹に内腹部に置きます。ドナーの腎臓は、冷生理食塩水に浸したガーゼのパッドと湿った保たれます。 </li><li>場所二人はドナーの大動脈カフと受信者のaortaotomyの近位および遠位頂点に縫合糸にてご利用いただけます。 </li><li>大動脈の外側に2〜3連続的な10から0ナイロン縫合糸を使用して、ドナーの大動脈のカフと受信者のaortaotomyの前壁の間に端側吻合を行う。 </li><li>受信者の左脇腹に上のドナーの腎臓の移植を回します。ドナーの大動脈のカフと受信者のaortaotomyの後壁の間に前の手順を繰り返します。 </li><li> IVCの内側に、4〜5連続10から0ナイロン縫合糸を用いて、ドナー腎静脈と受信者IVCの後壁との間のエンドツー側吻合を行います。し、IVCとドナー腎静脈の前壁はIVC外4〜5連続縫合で閉鎖されています。 </li><li>静脈と動脈の両方の吻合は20分以内に完了する必要があります。 </li><li>吻合時の冷たい生理食塩水で数回移植片を洗浄します。 </li><li>レシピエントの膀胱のドームを割る、と焼灼で止血する。 </li><li>ドーム上に小さなカットを行います。 </li><li>受信者の膀胱のドームでドナー小さな膀胱パッチをanastomizeに10から0までナイロンの二つ滞在の縫合糸を置きます。吻合部の各側は、8〜10連続針で縫合する。 </li><li>連続4から0滅菌、合成吸収性vicryl縫合糸で2層に腹部を閉じます。 </li><li>断続的な注入IVによる手術中のレシピエントマウスに0.4ミリリットル温かい生理食塩水を与える。 </li></ol>受信者の術後のケア<ol><li>腹部を閉じた後、ペニシリン（500U/10g）の単回筋肉内注射は、（2）に投与される。 </li><li>さらに、受信者は、0日目と痛みのための1日目手術後に筋肉注射で0.05 mg / kgのブプレノルフィンを受け取ります。実験がTEになるまで手術後、移植のレシピエントはsulfatrim（100mg/kg）を含む水を受けるrminated。 </li><li>第一24の場合は術後のマウスはインキュベーターを制御する温度に保持されています。 </li><li>マウスには、通常の操作の1時間以内に麻酔から回復し、通常の餌と水を自由に摂取されている。 </li><li>皮膚の縫合糸は、2週間、手術後に削除されます。 </li></ol>受信者の腎摘出<ol><li> 65 mg / kgのペントバルビタールIPを持つ受信者4〜7日後に腎臓の移植を麻酔、麻酔は、イソフルラン（2-3％）によって維持されています。 </li><li>正中切開を介して腹部を開きます。 </li><li>生理食塩水に浸したガーゼで腸を覆い、慎重に右側にそれを引っ込める。 </li><li>左尿管、腎静脈と動脈を結紮した後に左腎を削除します。 </li><li>連続4から0合成吸収性vicryl縫合糸で2層に腹部を閉じます。 </li></ol>全血中クレアチニンの測定<ol><li> 0.2未満のccの隔週採血までの週間は、イソフルラン麻酔下麻酔または眼窩なく、どちらのsubmandibularly実行されます。 </li><li>定量的な全血中クレアチニン濃度はI - Statのポータブルクリニカルアナライザー（Heska（株）、フォートコリンズ、CO）を用いて決定されます。 </li><li>従来の単位（mg / dlとは）88.4で、従来の単位を乗じてマイクロモル/ LのSI単位に変換されます。 </li></ol>

<ol><li>Russell, P. S., Chase, C. M., Colvin, R. B., Plate, J. M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+transplants+in+mice.+An+analysis+of+the+immune+status+of+mice+bearing+long-term%2C+H-2+incompatible+transplants%5BTitle%5D)+AND+%22JExpMed%22%5BJournal%5D)">Kidney transplants in mice. An analysis of the immune status of mice bearing long-term, H-2 incompatible transplants.</a> JExpMed. 147, 1449-1468 (1978).</li>
<li>Zhang, Z., Schlachta, C., Duff, J., Stiller, C., Grant, D., Zhong, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+techniques+for+kidney+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Improved techniques for kidney transplantation in mice.</a> Microsurgery. 16 (2), 103-109 (1995).</li>
</ol>

動物実験は、オハイオ州立大学IACUCによって定められたガイドラインおよび規制に準拠して行った。

我々は、&gt; 90％の技術的な成功率とマウスで腎移植の約1200ケースを実行している。心臓移​​植に比べて、腎臓の移植の成功率は通常低いです。しかし、私たちの研究室では、腎臓移植の高い成功率（&gt; 90％）を維持している。成功のキーポイントは、ドナーの腎臓と受信者の両方に再灌流傷害を軽減し、手順や手術後に全体に出血や血栓症を最小限に抑えるためです。次の要素が最も重要になることがあります：（a）の可能な限り慎重、穏やかな運転による手術中に受信者に出血を減らすこと、（b）ドナーの腎臓の準備と受信者の移植時に暖かい虚血とのクロスクランプ時間を最小限に抑えることと、（c）壊死、不十分な血液供給と膀胱漏れ後の操作を防ぐための小さなドナー膀胱のパッチを使用して、ネイティブ腎臓の（d）は遅延の腎摘出術4日まで〜7日後に移植移植された腎臓は手術後の機能を回復できるように、（E ）血栓症の発生率を減らすために大動脈の外側に吻合する（ドナーの大動脈袖口と前壁との間およびドナーの大動脈のカフと受信者の大動脈の後壁の間に）実行する、（f）少なく​​とも用のためのレシピエントマウスは、保温手術後24時間は、（g）の潜在的な感染症を防ぐために手術後にレシピ...

<table><tbody><tr><td>i-STAT</td><td>その他</td><td>HESKA</td><td>Cat 5101</td><td></td></tr><tr><td>i-STATカートリッジ</td><td>その他</td><td>HESKA</td><td>CAT 5110-CREA</td><td></td></tr><tr><td>Sulfatrim</td><td>その他</td><td>Actavis</td><td>R02109</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>その他</td><td>NOVAPLUS</td><td>CA-0474</td><td></td></tr><tr><td>10-0 縫合糸</td><td>外科</td><td>Sharpoint</td><td>AK0100</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス腎移植の手順

Murine Renal Transplantation Procedure

マウスの腎同所移植は技術的に困難な手順です。マウスの最初の腎移植は（2）30年以上前にラッセルらによって行われる（1）以降Zhangら数年で洗練されたが、世界でも少数の人々は、この手順をマスターしている。私たちのラボでは、正常に&gt; 90％の生存率は1200同所腎臓移植を実施した。成功のキーポイントは、再灌流障害の厳格な制御、出血や血栓症、手続き中および移植後の両方を含んで、および吻合のための11から0縫合糸の代わりに、10から0を使用してください。 受信者の術後のケアと治療は成功と評価を移植することが極めて重要である。すべての腎移植レシピエントは、継続的に飲料水の後の移植とsulfatrimすぐにペニシリンの注射剤の形で抗生物質を受け取る。全体的な動物の健康は、毎日、全血中クレアチニンの分析は移植片機能を評価するためのポータブルI - STATのマシンで日常的に行われて評価されます。

マウスの腎移植は、成功のための慎重な術後ケアと治療を必要とする技術的に困難な手順です。

マウスにおける腎臓の同所移植は、技術的に困難な手技である。マウスでの最初の腎移植はRussellによって行われたが…

マウス腎移植の手順は、まずドナーマウスから左腎を取り出し、氷上で保存するドナー臓器採取から始まります。次に、ドナー腎を移植するためのスペースを確保するため、レシピエントマウスから右腎を除去します。その後、ドナー腎を氷上から取り出し、レシピエントマウスに移植します。マウスを4日間回復させた後、残っている自らの腎臓を摘出します。7日後、i-STATポータブル臨床分析装置を用いてクレアチニン値をモニタリングし、移植腎の機能を評価します。こんにちは、オハイオ州立大学移植外科およびGreg Hadley博士の研究室のSarah Heimerです。本日は、マウスにおける腎移植の手順を解説します。今回ご紹介する腎移植手術は、当研究室の専門の脳神経外科医であるJing Wingが行います。移植拒絶の免疫学的機序や、拒絶反応を防止するための戦略を研究するために、当研究室でこの手順をご活用ください。それでは始めていきましょう。ドナー臓器の採取を開始するため、まず趾（あしゆび）をつねり、動物が完全に麻酔状態にあることを確認します。滅菌領域内で滅菌済みの器具を使用し、麻酔をかけたマウスの胸骨から恥骨まで正中切開を行い、ドナー腎臓の灌流を行うために腸管を右側へ側方に移動させて左腎臓を露出させます。腎動脈および腎静脈の上方と下方の腹大動脈および下大静脈を、4-0シルク縫合糸で結紮します。腎下大動脈を介して、冷やしたヘパリン添加リンゲル乳酸液で緩徐にin situ灌流を行います。8-0シルク縫合糸を用いて、副腎血管、精巣血管、およびいくつかの腰動脈分枝を結紮・切断し、左腎を単離します。次に、大動脈および下大静脈と左腎動・静脈の接合部を遊離させ、腎動脈および腎静脈の上方と下方で大動脈および下大静脈を4-0シルク縫合糸で結紮します。出血を最小限に抑えるため、まず腎血管の下方で大動脈を結紮します。次に、左尿管を腎門から膀胱まで剥離します。膀胱ドームをコダ牽引することで、尿管膀胱移行部を露出させます。右尿管を確実に避けて、左尿管膀胱接合部を含む膀胱の小さな楕円形パッチを切除します。このパッチは、膀胱間吻合による尿路再建に使用されます。その後、腎動脈および腎静脈の上方で大動脈を結紮します。腎下大動脈を介して、冷やしたヘパリン含有リンゲル乳酸液でラフトをin situでゆっくりと灌流させます。腎動脈の約2mm下方で大動脈を斜めに切断します。最後に、腎臓とその血管供給系を、膀胱パッチに接続された尿管とともにブロックごと摘出します。腎臓は、宿主レシピエントへの移植準備が整うまで、氷上のリンゲル乳酸液中に保存してください。また、ドナーマウスは麻酔下で頸椎脱臼により安楽死させます。既報の通り、レシピエントへの移植に際しては、動物が十分に麻酔されていることを確認するためにピンチ刺激を行います。手術を開始するために正中切開を行い、腸を濡れたガーゼで覆い、慎重に左側に避けてください。この腎移植を完遂させるためには、ドナーの大動脈カフとレシピエントの大動脈の間で吻合を行う必要があります。また、ドナーの腎静脈をレシピエントの下大静脈に、ドナーの膀胱パッチをレシピエントの膀胱結紮部に吻合します。右尿管、腎動脈、および腎静脈を処理します。結紮後、腎臓を取り除きます。腰動脈分枝を慎重に分離し、4 mmの微小血管クランプ2個を用いて、腎下大動脈と下大静脈を遮断します。10-0ナイロン縫合糸を大動脈の全層に通し、牽引しながら、血管径の約5分の1の単一の切開を加え、楕円形の大動脈切開を作成します。次に、30ゲージの針で下大静脈を刺し、マイクロ鋏を用いて適切に延長して、縦方向の静脈切開を行います。大動脈と下大静脈の両方をヘパリン生理食塩水で洗浄し、管腔内の血液や血栓を除去します。ドナー腎を氷から取り出し、マウスの右側腹部に配置します。レシピエントの大動脈切開創の近位端と遠位端に、ドナーの大動脈カフと共に2本のステイ縫合糸をかけます。大動脈の外側で、2〜3本の連続的な10-0ナイロン縫合糸を用い、ドナーの大動脈カフとレシピエントの大動脈切開創の前壁との間で端側吻合を行います。その後、ドナー腎移植片をレシピエントの左側腹部に向けて反転させます。ドナーの大動脈カフとレシピエントの大動脈後壁の間で、前述の手順を繰り返します。切開を行います。静脈と動脈の両方の吻合を20分以内に完了させることが重要です。また、吻合中にグラフトを冷生理食塩水で数回洗浄してください。ドナー腎静脈とレシピエントの下大静脈後壁との間で、下大静脈の内側から10-0ナイロン縫合糸を用いて4〜5本の連続縫合による端側吻合を行います。次に、下大静脈の外側から4〜5本の連続縫合を用いて、下大静脈前壁とドナー腎静脈を閉鎖します。次のステップは、レシピエント膀胱のドーム部を切開することです。電気凝固により止血します。固定が完了したら、ドーム部分に小さな切開を加え、10-0ナイロンを用いて2箇所のステイ縫合を行い、ドナーの小膀胱パッチとレシピエントの膀胱ドームを吻合します。吻合部の両側を8〜10回の連続縫合で縫合します。最後に、4-0の滅菌合成吸収性バイクリル縫合糸を用いて、腹部を2層にわたり連続縫合で閉腹します。術後ケアは、ペニシリンの単回筋肉内注射から開始します。移植レシピエントには、疼痛管理のため、術後0日目と1日目にブプレノルフィンを0.05 mg/kgの用量で筋肉内に投与し、さらにサルファトリム含有水を継続的に供給します。術後24時間は、温度制御されたインキュベーター内で管理します。皮膚の縫合糸は手術の2週間後に抜糸します。残存している自前の腎臓を摘出することは、血清クレアチニンの測定によって腎移植片の機能低下をモニタリングするために不可欠です。通常、ドナー腎の初回移植から4～7日後に行われ、ドナーマウスから腎臓を摘出する際に用いた主要な手順と同様の手順で行われます。ホスト動物を鎮静させ血液サンプルを採取するため、ISOフッ素麻酔を使用します。移植片の機能を評価するための指標として、後眼窩からの全血クレアチニン定量値を測定し、i-STATポータブル臨床分析装置を用いて決定します。従来単位は、従来単位に88.4を乗じることでSI単位に変換します。クレアチニンの濃度は1リットルあたりのマイクロモル（µmol/L）で表記されます。動物は通常、手術後2〜3時間で回復し、残りの自らの腎臓を除去した後は通常のマウスの行動を示します。動物の生存は腎移植片の機能に依存しており、これは動物の全身状態とクレアチニンの値を毎日検査することで評価できます。リファレンスとして、ポータブルi-STAT臨床分析装置を用いて全血を測定します。非移植の正常マウスのクレアチニン値は 20 µM付近です。マウスに疾患の兆候が見られ、クレアチニン値が 100 µM付近まで上昇した場合に、腎移植片機能不全とみなされます。以上で、マウスにおける腎移植の手順を説明しました。この手順は技術的に困難ですが、当研究室では高い成功率で実施しています。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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