ショウジョウバエの眼成虫ディスクに付属してグリア細胞の移行のイメージングを生きる

幼虫の後端と前端を掴み、ピンセットを反対方向に引くことで、幼虫を解剖します。超極細剪刀を用いて余分な組織を取り除きます。これにより、幼虫の脳と眼の成虫盤の2つの半球が露出します。

腹側神経索と口鉤。幼虫の眼脳複合体を培養チャンバーに移します。野生型の眼の成虫盤内におけるグリア細胞の遊走を可視化するため、脳葉を視神経柄から分離します。

変異体の視神経柄において停止したグリア細胞を観察するため、脳葉を視神経柄に付着させたままにします。ブリティッシュコロンビア大学動物学部のVanessa Als研究室のPatrick Caffertyです。こんにちは、Rinです。

本日は、発達中のショウジョウバエの眼において、遊走するグリア細胞を可視化する手順をご紹介します。当研究室では、グリア細胞の発達を研究するためにこの手法を用いています。それでは、始めていきましょう。

実験開始の1週間前に、グリア細胞特異的プロモーターの制御下でGFPを発現する幼虫を得るために、ショウジョウバエを交配させます。本実験では、グリア細胞で発現し、核局在化シグナルを付加したGFPの可視化を行います。逆極性プロモーターを用いて、少なくとも1日前に直径18 mmのラウンドカバーガラスを準備します。準備方法は、1% poly L lysine溶液に10分間浸した後、実験前日の夜間に室温で自然乾燥させます。

実験当日、連鎖型磁気培養チャンバーの構成部品を70% ethanolに一晩浸漬して洗浄します。無菌操作を用いて培養液を調製してください。10 millilitersのSchneider's insect mediumに、ウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシン溶液、およびインスリンを添加します。

クリーンなチェーンライド磁気培養チャンバーを細胞培養フード内で風乾させ、その後、調製した培養液でリンスして残留エタノールを洗い流します。これらの準備が整ったら、ショウジョウバエの眼・脳複合体の解剖を開始します。この手順を始めるには、フライバイアルの側面にいる3齢遊走幼虫を選択し、氷上のペトリ皿に滴下した冷却培養液の中に置き、数分間冷却します。

解剖を容易にするため、幼虫の蠕動運動を抑制することが推奨されます。次に、冷却した幼虫を、解剖顕微鏡下でパラフィンコート皿上の培養液一滴の中に置きます。デュモン微細ピンセットを用いて幼虫をしっかりと固定します。後端から約3分の1の位置を固定し、幼虫が前端から口鉤を突き出すまで待ちます。口鉤が完全に伸展したところで、2組目のピンセットでそれらを掴みます。

幼虫を解剖するには、2組のピンセットをゆっくりと反対方向に引きます。すると、眼脳複合体（eye brain complex）が、唾液腺、脂肪体、および成虫原基組織とともに、幼虫の体から引き離されます。口鉤（mouth hooks）を急いで引くと、眼脳複合体からちぎれてしまうため注意してください。

唾液腺、脂肪体、および 成虫原基を切り取り除きます。超極細クリッパーシザーを用いて、脳の2つの半球と眼原基を腹側神経索および口鉤に固定します。次に、18 mmのカバーガラスをガラススライドの上に置き、カバーガラスの一方の端がスライドの端から外れるようにします。後でカバーガラスを拾いやすくするため、カバーガラスの上に培養液を1滴滴下します。

ピンセットで口鉤を掴み、眼脳複合体をカバーガラス上の培地へと移します。眼脳複合体をカバーガラスに移した後、微小解剖用鋏を用いて、眼脳複合体から口鉤を切り離します。

マウスフックの除去は、ライブイメージングにおいて重要です。なぜなら、マウスフックは培養液の中でも収縮し続け、顕微鏡観察中に組織を動かしてしまうためです。視神経柄内のGLを可視化する場合は、脳、視神経柄、および眼の原基円盤をそのままにしておきます。眼の原基円盤内でのグリア細胞の遊走を可視化する場合は、脳と眼の円盤を繋いでいる薄い組織である視神経柄を慎重に切断し、脳を押し出すか除去してください。

最後に、ピンセットでカバーガラスを持ち上げ、目的の組織の周囲に油性マジックで円を描きます。この円は、後の顕微鏡観察において組織を特定する際に役立ちます。これで、眼成像盤を磁気培養チャンバーにマウントする準備が整いました。

眼原基盤を磁気培養チャンバーに固定するには、ピンセットでカバーガラスの吊り下げ端を掴み、培養中の組織を乱さないように注意しながら、カバーガラスをチェーンライン磁気チャンバーのボトムプレートへ移動させます。次に、シリコンOリングをチェーンラインチャンバーの本体に装着します。ボトムプレートの上に本体をゆっくりと設置してください。

チャンバーに培地を加えます。カバー下でのガス交換を妨げないよう、また組織が乱れないように、培地を急激に加えないでください。チャンバーを満杯にせず、透明なカバーをチェーンラインチャンバーの上にそっと置きます。

遊走するグリア細胞を可視化するため、培養チャンバーを共焦点顕微鏡または蛍光顕微鏡のステージ上に配置します。低倍率で、カバースリップ上の円を基準にしてサンプルを特定します。40倍の対物レンズを用いてサンプルに焦点を合わせます。

組織を静置し、正しく行われていれば、3〜4時間にわたって10〜15分ごとに眼原基または視神経柄の画像を撮影します。このプロトコルにより、視神経柄から眼原基へと移動するGFP標識されたグリア細胞の一連の画像が得られます。野生型の眼原基では60分間のライブイメージングでグリア核の位置の変化を観察するのに十分でしたが、グリア細胞の移動に必要な遺伝子の変異体では、グリア核が視神経柄から完全に脱出できませんでした。

培養組織の劣化が観察されるまで、最長240分間、眼脳複合体を培養しました。240分が経過すると、培養された眼脳複合体の周囲の培養液中にGFP陽性細胞が観察され始めます。加えて、組織全体に拡散したスポット状にGFPが蓄積し、組織の完全性が崩壊していることが示唆されます。

グリア細胞の遊走を研究するための、想像盤（imaginal discs）の培養方法について解説しました。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。