Name: ショウジョウバエの眼成虫ディスクに付属してグリア細胞の移行のイメージングを生きる (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 学ぶショウジョウバエ眼成虫ディスクにおけるグリア細胞の移行のライブイメージング手法。GFP標識を用いて神経系発生における細胞動態を可視化し、神経発生研究の基礎を築きます。

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パート1：プレ実験のセットアップ。 <ol><li>事前に一週間は、メイトはグリア特異的プロモーターの制御下にGFPを発現するその幼虫を生成するために飛ぶ。私たちの実験のために我々は、 逆極性（レポ）プロモーター（3,4）を用いてグリア細胞に発現し核局在配列でタグ付けされたGFPを可視化。 </li><li>百分の一晩乾燥したポリ- L -リジン溶液と空気中で10分間18 mmの円形のカバースリップを浸漬することによって、事前に少なくとも一日のスリップをカバーする準備。 </li><li>実験の前日に、70％エタノールで一晩成分を浸漬することによってChamlide磁気培養チャンバーをクリーニング。 </li><li>実験日に、無菌テクニックを使用してシュナイダー昆虫培地10mlにウシ胎児血清、ペニシリン - ストレプトマイシン溶液、およびインスリンを追加することにより、培養液を準備する。使用濃度は以下のとおりです。1Xウシ胎児血清、100U/mlペニシリン、0.1mg/mlストレプトマイシン、およびシュナイ​​ダー昆虫培地に0.2 mg / mlのインスリン（（5）から変更）。 </li><li>培養チャンバーは細胞培養のフードで風乾します。準備培養液で洗浄することにより培養チャンバーから残留エタノールを洗い落とす。 </li></ol>パート2： ショウジョウバエの眼と脳の複合体の解剖。 <ol><li>数分間氷上でペトリ皿の上に冷やした培地のドロップにハエのバイアルと場所の側から3齢放浪幼虫]を選択します。幼虫をなごむこと解剖を容易にするために蠕動体の収縮を減速することをお勧めします。 </li><li>解剖顕微鏡下Sylgardコートしたディッシュ上で培養液のドロップチルド幼虫を置きます。 </li><li>解剖顕微鏡下で、しっかりと後端からの方法の約3分の1を幼虫を把握するデュモン細かいピンセットを使用してください。幼虫は前端から口のフックを押し出すまで待ち​​ます。フル拡張時に鉗子の2番目のペアと口のフックをつかみます。幼虫を解剖するために、ゆっくりと反対方向に鉗子の2つのペアを引き出します。眼と脳の複合体は、唾液腺、脂肪体、そして成虫組織と一緒に、幼虫の体から離れて引っ張ってくる。口は、彼ら​​が目の脳の複雑な構成ティアオフなるそうでなければ早すぎるとフックを引っ張らないでください。 </li><li>唾液腺、脂肪体、及び超微細クリッパーのはさみを使用して成虫ディスクを切り落とす。脳と目のディスクの二つの半球は、腹側神経索と口のフックに接続されます。 </li><li>スライドグラス上に18 mmのカバースリップを配置。後カバーガラスをピックアップするために、スライドの端からぶら下がってカバースリップの片方のエッジを残す。 18 mmのカバースリップ上に培養液のドロップを追加。鉗子で口のフックを把握し、培養培地中に目と脳の複雑なを転送します。鉗子や組織が損傷されると直接眼と脳の複雑なを把握しないでください。 </li><li>細かい解剖鋏を使用して、目と脳の複雑なと廃棄から口のフックを切り落とす。口のフックの除去は、口のフックは、組織の顕微鏡検査中に移動させる培養液中の契約を継続するとして、ライブイメージングのために重要です。 </li><li>目成虫原基内にグリアの移行を可視化するために、注意深く眼茎、脳と目のディスクを接続する細い組織をカットし（図1Aを参照）脳を離れて押したり、廃棄してください。眼茎内グリア細胞を可視化するために、（図1Eを参照）、脳、眼茎、そして目成虫原基はそのままにしておく。 </li><li>鉗子を用いてカバースリップをピックアップし、永久的なマーカーとの利益の組織の周りの下に円を描く。このサークルでは、パート4で顕微鏡のための組織を見つけるのに役立ちます。 </li></ol>第3部：磁気培養チャンバーに目成虫原基をマウント。 <ol><li>鉗子を使用して、カバースリップの上盤の端をつかんで。文化の中で組織を乱すことなくChamlide磁気チェンバーの底板にカバースリップを転送します。 </li><li> Chamlideチャンバーの本体の上にシリコンO -リングを置きます。底板の上に本体を取り付けます。 </li><li>徐々にチャンバーに培養液を追加します。速すぎるまたは利益の組織が妨害される培養液を追加しないでください。完全にカバーの下にガス交換を可能にするためにチャンバーを埋めるしないでください。 </li><li>ゆっくりとChamlideチャンバーの上に目に見えないカバーを置きます。 </li></ol>パート4：目のディスクにグリア細胞の移行の可視化。 <ol><li>共焦点または蛍光顕微鏡のステージ上に培養チャンバーを配置。低倍率での参考資料としてカバースリップ上に円を使用してサンプルを探します。 </li><li> 40倍レンズを使用してサンプルに焦点を当てる。組織はカバースリップの上に定着することができます。 3-4時間以上、10〜15分目のディスクまたは光茎の画像をキャプチャ。組織は、ピクッと動くとピントが合って移動することがあります。手動で画像をキャプチャする前に組織を中心とする目を軽減します問題があります。 </li></ol>パート5：代表的な結果： 正しく実行される、我々のプロトコルは、私たちが目の成虫原基（図1 BD）に眼茎から移行したGFP -タグ付きグリア細胞の一連の画像を収集することができました。 60分間のライブイメージングは、 野生型の目成虫原基内のグリア細胞核の位置の変化を観察するのに十分でしたが、グリア細胞の遊走に必要な遺伝子の変異体におけるグリアの核は完全に光ファイバー茎（矢印を終了に失敗しました図1 FH）。 我々は、培養組織の劣化を観察する前に240分限り長期間培養眼と脳の複合体を持っている。 240分の時間ポイントに続いて、培養眼脳複合体（図の矢印Aを2 C）を囲む培養培地中でGFP陽性細胞を観察し始める。加えてのGFPで組織の完全性の崩壊を示唆して組織全体にびまん性斑に蓄積されることになります。 <img src="/files/ftp_upload/1155/figure1.png" alt="" width="589" height="241" /> 図1：開発野生型と変異型視覚システムにおけるGFP -タグ付きグリア細胞核のライブイメージング。 、E）画像を培養し、野生型と変異体目成虫ディスク（ED）の微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡を用いて撮影。 野生型では、グリア細胞はで生まれていると目のディスクに眼茎（OS）から移行する。脳は、平坦化し、目成虫原基のイメージングを容易にするために削除されています。 BD）（A）0、30、および60分の時点ではGFP -タグ付きグリア細胞核が目のディスク内での移行が明らかに野生型培養目成虫原基の蛍光顕微鏡。 の変異体目の脳の複雑なのFH）蛍光顕微鏡（E）0、30℃、および60分の時点では、眼茎内でGFP -タグ付きグリア細胞核（矢印）の失速を示しています。脳（BR）は、茎内グリア細胞のイメージングを容易にするために眼茎に接続されて残されている。 <img src="/files/ftp_upload/1155/Figure_2.png" alt="" width="600" height="156" /> 図2： 野生型の目成虫原基におけるGFP -タグ付きグリア膜のライブイメージング。我々は成功し、240分の期間のための目と脳の複合体を培養している。組織培養よりも長い240分では分解し始めます。 300分の時間点（C）に比べて目成虫原基の周囲の培地（ED）、眼茎（OS）、および0（A）と150分（B）で脳の前頭葉には、（BR）、、無料です。矢印で示されているGFP陽性の細胞は、。

<ol><li>Aigouy, B., Lepelletier, L., Giangrande, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+chain+migration+requires+pioneer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial chain migration requires pioneer cells.</a> J. Neurosci. 28, 11635-11641 (2008).</li>
<li>Silies, M., Yuva, Y., Engelen, D., Aho, A., Stork, T., Klambt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cell+migration+in+the+eye+disc%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial cell migration in the eye disc.</a> J. Neurosci. 27, 13130-13139 (2007).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Sepp, K. J., Auld, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+lacZ+enhancer+trap+lines+to+GAL4+lines+using+targeted+transposition+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Conversion of lacZ enhancer trap lines to GAL4 lines using targeted transposition in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 151, 1093-1101 (1999).</li>
<li>Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+geometric+order+in+proliferating+metazoan+epitheia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The emergence of geometric order in proliferating metazoan epitheia.</a> Nature. 442, 1038-1041 (2006).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).</li>
</ol>

著者は開示すべき事項を何も持っていません。

このプロトコルでは、ライブ顕微鏡を使用して目成虫原基にグリア細胞の遊走の観察を説明します。私たちの野生型の例（図1 AD）においては、我々は1時間かけ目のディスクにグリア細胞の動きを観察するために核GFPマーカーを使用。現在我々の研究室で研究されてグリア細胞の移行に必要な候補遺伝子の変異では、我々は、1時間の期間（図1 EH）の間に眼茎内のグリア細胞核の失速を観察した。当社の戦略は、興味のある私たちの遺伝子によって制御される細胞挙動のさらなる詳細を可視化するために適応させることができます。例えば、膜は、そのようなmCD8 - GFPとして、GFPの分子を標的と細胞プロセスを可視化するグリア細胞で発現させることができる。私たちの変異体におけるグリア細胞が目のディスクにこのような糸状仮足のような細胞プロセスを拡張することができるかどうか私たちが判断できるようになる膜結合型GFPマーカーを使用してください。同様にGFPでタグ付けされたGFPまたはチューブリンでタグ付けされたアクチンは、グリア細胞の移行時に細胞骨格の変化を視覚化するために開発するグリア細胞で発現させることができる。さらに、単一のGFP標識された変異体グリア細胞...

<table><tbody><tr><td>ポリ-L-リシン</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s 昆虫培地</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>ウシ膵臓由来インスリン溶液</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516</td><td></td></tr><tr><td>Chamlide マグネティックチャンバー</td><td>器具</td><td>Live cell Instrument</td><td>CM-R-10</td><td>18 mm カバーガラス用 35 mm ディッシュ型チャンバー</td></tr><tr><td>超極細クリッパー剪刀</td><td>器具</td><td>Fine Science Tools</td><td>15200-00</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 ピンセット</td><td>器具</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>顕微鏡</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>GFPに必要なフィルターおよび励起光源を備えた任意の蛍光イメージングシステムが使用可能です。</td></tr></tbody></table>

ショウジョウバエの眼成虫ディスクに付属してグリア細胞の移行のイメージングを生きる

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

脊椎動物と無脊椎動物の生物の両方のグリア細胞はensheathするために、最終的な標的領域へ​​の移行と関連する神経細胞をサポートする必要があります。最近の進展は、開発途上蛹の翼（1）、の研究ではグリア細胞のライブマイグレーションを記述するためになされている一方で<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;グリア細胞の遊走は、通常、固定した組織の検査を含んでいた。運動性細胞のライブ顕微鏡分析は、速度と成長の方向の変化を決定するを含む渡り鳥プロセス、全体の細胞挙動を検査する能力を提供しています。遺伝学的ツールの使用と対に、ライブイメージングは​​、開発の過程で特定の遺伝子のためのより正確な役割を決定するために使用することができます。 Siliesで前の仕事<em&gt;ら。</em&gt;（2）固定組織における眼成虫原基に、眼茎、開発の目と脳を結ぶ構造に由来するグリア細胞の移行を説明しています。ここでは、中にグリア細胞のライブマイグレーションを検討するためのプロトコルの概要を説明<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;目の成虫原基。我々は、野生型および変異動物におけるグリア細胞の進行に従うことを開発するグリア細胞でGFPを発現し、ショウジョウバエのラインを活用する。

ここでは、GFPタグ付きのグリア細胞とペアライブ顕微鏡分析を使用して開発をショウジョウバエの眼にグリア細胞の遊走を調べるためのプロトコルについて説明します。

脊椎動物および無脊椎動物の両方において、グリア細胞は、関連するニューロンを鞘で包みサポートするために、最終的な標的領域まで移動しなければなりません。一方で...

幼虫の後端と前端を掴み、ピンセットを反対方向に引くことで、幼虫を解剖します。超極細剪刀を用いて余分な組織を取り除きます。これにより、幼虫の脳と眼の成虫盤の2つの半球が露出します。腹側神経索と口鉤。幼虫の眼脳複合体を培養チャンバーに移します。野生型の眼の成虫盤内におけるグリア細胞の遊走を可視化するため、脳葉を視神経柄から分離します。変異体の視神経柄において停止したグリア細胞を観察するため、脳葉を視神経柄に付着させたままにします。ブリティッシュコロンビア大学動物学部のVanessa Als研究室のPatrick Caffertyです。こんにちは、Rinです。本日は、発達中のショウジョウバエの眼において、遊走するグリア細胞を可視化する手順をご紹介します。当研究室では、グリア細胞の発達を研究するためにこの手法を用いています。それでは、始めていきましょう。実験開始の1週間前に、グリア細胞特異的プロモーターの制御下でGFPを発現する幼虫を得るために、ショウジョウバエを交配させます。本実験では、グリア細胞で発現し、核局在化シグナルを付加したGFPの可視化を行います。逆極性プロモーターを用いて、少なくとも1日前に直径18 mmのラウンドカバーガラスを準備します。準備方法は、1% poly L lysine溶液に10分間浸した後、実験前日の夜間に室温で自然乾燥させます。実験当日、連鎖型磁気培養チャンバーの構成部品を70% ethanolに一晩浸漬して洗浄します。無菌操作を用いて培養液を調製してください。10 millilitersのSchneider's insect mediumに、ウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシン溶液、およびインスリンを添加します。クリーンなチェーンライド磁気培養チャンバーを細胞培養フード内で風乾させ、その後、調製した培養液でリンスして残留エタノールを洗い流します。これらの準備が整ったら、ショウジョウバエの眼・脳複合体の解剖を開始します。この手順を始めるには、フライバイアルの側面にいる3齢遊走幼虫を選択し、氷上のペトリ皿に滴下した冷却培養液の中に置き、数分間冷却します。解剖を容易にするため、幼虫の蠕動運動を抑制することが推奨されます。次に、冷却した幼虫を、解剖顕微鏡下でパラフィンコート皿上の培養液一滴の中に置きます。デュモン微細ピンセットを用いて幼虫をしっかりと固定します。後端から約3分の1の位置を固定し、幼虫が前端から口鉤を突き出すまで待ちます。口鉤が完全に伸展したところで、2組目のピンセットでそれらを掴みます。幼虫を解剖するには、2組のピンセットをゆっくりと反対方向に引きます。すると、眼脳複合体（eye brain complex）が、唾液腺、脂肪体、および成虫原基組織とともに、幼虫の体から引き離されます。口鉤（mouth hooks）を急いで引くと、眼脳複合体からちぎれてしまうため注意してください。唾液腺、脂肪体、および 成虫原基を切り取り除きます。超極細クリッパーシザーを用いて、脳の2つの半球と眼原基を腹側神経索および口鉤に固定します。次に、18 mmのカバーガラスをガラススライドの上に置き、カバーガラスの一方の端がスライドの端から外れるようにします。後でカバーガラスを拾いやすくするため、カバーガラスの上に培養液を1滴滴下します。ピンセットで口鉤を掴み、眼脳複合体をカバーガラス上の培地へと移します。眼脳複合体をカバーガラスに移した後、微小解剖用鋏を用いて、眼脳複合体から口鉤を切り離します。マウスフックの除去は、ライブイメージングにおいて重要です。なぜなら、マウスフックは培養液の中でも収縮し続け、顕微鏡観察中に組織を動かしてしまうためです。視神経柄内のGLを可視化する場合は、脳、視神経柄、および眼の原基円盤をそのままにしておきます。眼の原基円盤内でのグリア細胞の遊走を可視化する場合は、脳と眼の円盤を繋いでいる薄い組織である視神経柄を慎重に切断し、脳を押し出すか除去してください。最後に、ピンセットでカバーガラスを持ち上げ、目的の組織の周囲に油性マジックで円を描きます。この円は、後の顕微鏡観察において組織を特定する際に役立ちます。これで、眼成像盤を磁気培養チャンバーにマウントする準備が整いました。眼原基盤を磁気培養チャンバーに固定するには、ピンセットでカバーガラスの吊り下げ端を掴み、培養中の組織を乱さないように注意しながら、カバーガラスをチェーンライン磁気チャンバーのボトムプレートへ移動させます。次に、シリコンOリングをチェーンラインチャンバーの本体に装着します。ボトムプレートの上に本体をゆっくりと設置してください。チャンバーに培地を加えます。カバー下でのガス交換を妨げないよう、また組織が乱れないように、培地を急激に加えないでください。チャンバーを満杯にせず、透明なカバーをチェーンラインチャンバーの上にそっと置きます。遊走するグリア細胞を可視化するため、培養チャンバーを共焦点顕微鏡または蛍光顕微鏡のステージ上に配置します。低倍率で、カバースリップ上の円を基準にしてサンプルを特定します。40倍の対物レンズを用いてサンプルに焦点を合わせます。組織を静置し、正しく行われていれば、3〜4時間にわたって10〜15分ごとに眼原基または視神経柄の画像を撮影します。このプロトコルにより、視神経柄から眼原基へと移動するGFP標識されたグリア細胞の一連の画像が得られます。野生型の眼原基では60分間のライブイメージングでグリア核の位置の変化を観察するのに十分でしたが、グリア細胞の移動に必要な遺伝子の変異体では、グリア核が視神経柄から完全に脱出できませんでした。培養組織の劣化が観察されるまで、最長240分間、眼脳複合体を培養しました。240分が経過すると、培養された眼脳複合体の周囲の培養液中にGFP陽性細胞が観察され始めます。加えて、組織全体に拡散したスポット状にGFPが蓄積し、組織の完全性が崩壊していることが示唆されます。グリア細胞の遊走を研究するための、想像盤（imaginal discs）の培養方法について解説しました。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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