Name: 高齢者の細胞の伸長によって酵母年表寿命の定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-06T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: 学ぼう、酵母の年表寿命を定量化するハイスループット法。Bio Screen CMBRマシンを用いて光密度を測定し、細胞生存率を評価する手法を解説。老化研究や細胞生物学の基礎理解に役立つ。

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この作品は、NIHのグラント1R21AG031965 - 01A1によってサポートされていました。 MKは、高齢化のエリソン医学財団新奨学生です。

パート1：高齢化の文化の調製<ol><li> YEPD寒天プレート上に凍結ストック（1％酵母エキス、2％バクトペプトン、2％寒天、2％グルコース）から興味のストリーク株。 </li><li> 30˚Cで48時間、または、単一のコロニーが現れるまで、細胞をインキュベートする。 </li><li>試験管のYEPD液体培地（1％酵母エキス、2％バクトペプトン、2％グルコース）5mlに、単一のコロニーと接種を選んでください。 </li><li>シェーカーやローラードラムのどちらかを使用して一定の撹拌を維持しながら30˚Cでの培養は一晩成長する。 </li><li>一晩培養液50μLと合成完全（SC）培地（表1）5 mLを接種する。一般的に3つのSCの培養物は検査対象の各菌株については寿命の解析の三乗の生物学的な複製を提供するために、各菌株準備されている。 </li><li> 30℃の培養実験全体（一般的に2週間以上）のためのローラードラム上˚Cで一定の攪拌を維持する。 </li></ol>パート2：実行可能性、年齢の点を取る SCメディアの文化の2日後、細胞は静止期にある必要がありますし、最初の年齢の点は取られる準備ができています。それ以降の年齢の点は、最低2週間は、2〜3日ごとに注意が必要です。各年齢の点のための： <ol><li> YEPD 145μLを各ウェルに充填して接種するためのBioscreen 100 -よくハニカムプレートを準備します。のみYEPDとデータ解析のための無細胞以降でうまく満たさ少なくとも一つを残しておくことを忘れないでください。 </li><li>インキュベーターから老化の文化を取り外します。 </li><li>簡潔に渦文化のいずれかをこぼさないように注意しながら、ハニカムプレートに接種される最初の文化。 </li><li>混合培養の5μLを削除し、ハニカムプレートの最初のウェルに、それをピペット。前と5μLアリコートを除去した後、各試験管の口炎。 </li><li>それぞれの文化に対応するウェルの位置をメモしておいているそれぞれの老化の文化について、この手順を繰り返します。同一のよく位置は、実験全体を通して、年齢ポイントごとに、後続のために使用する必要があります。 </li><li>接種が終了するときに30˚Cのインキュベーターに文化を交換してください。 </li></ol>パート3：Bioscreen C MBRのマシンをロード<ol><li>蓋を持ち上げて、インキュベーターのコンパートメントを公開し、サンプルトレイにカバーを取り外します。 </li><li>サンプルトレイ（一つだけプレートを読んでいる場合、左側のスロットを使用）に新たに接種したハニカムプレートを挿入します。 </li><li>サンプルトレイにカバーを元に戻して、インキュベーターのコンパートメントに蓋を下げます。 </li><li>熱伝達流体が最小充填レベルを超えていることを確認してください。低い場合は、付属の熱伝達流体で1000μLピペットを使用して、よりを追加します。 </li><li> Bioscreenソフトウェア&quot;EZExperiment&quot;を使用して、 サッカロマイセスセレビシエに適した成長曲線を得るために次のパラメータを設定します。 <ul><li>サンプル数：メディアまたは200と井戸の数を入力してください</li><li>フィルター：420 - 580nm、広帯域</li><li>温度：30˚C </li><li>実験の長さ：1日、0時間、0秒</li><li>測定間隔：30分</li><li>シェイキング：、連続揺れで、ハイ</li></ul></li><li>朗読を開始する&quot;スタート&quot;をクリックします。 </li></ol>パート4：データ解析一般的に六歳のポイントは、2週間のコースで行われます。年齢の点は日2、4、6、9、11、13で撮影されています。実験的な設計とテストされている菌株に応じて、それは年齢の点、多かれ少なかれ、頻繁にまたは2週間よりも長くかかることが望ましい場合があります。これはデータ分析がより簡単になりますように、各高齢化の文化は、あらゆる年齢の点で同じウェルの位置に対応することをすべての年齢の点などで同じ順序でハニカムプレートをロードすることが重要です。 <ol><li> Bioscreen C MBRのマシンからの出力ファイルを取得します。ソフトウェア&quot;EZExperimentは&quot;Microsoft Excelなどのほか、他のソフトウェアと互換性のあるタブ区切りファイルとしてBioscreenデータを出力します。最初の列のショーは何時にODの測定は、Bioscreenハニカムプレート（図1）で各ウェルを表す以降の列で、実験中に撮影された。 </li><li>すべての列の最初のODの測定値を削除します。この読み方は&quot;ノイズ&quot;です。 </li><li>各列のすべてのOD値から一人でYEPDと同様のOD値を減算することにより、データを正規化する。これは、メディアによるバックグラウンドの吸光度を削除します。 </li><li>伸長曲線をプロットします。曲線は、年齢の関数（図2）としてシフトします。例えば、6つの時間ポイントを介してカラム1（ハニカムプレートの1ウェル）から伸長曲線をプロットすることによって、時間の経過曲線の明確な右シフトがあります。 </li><li>各ウェルに2日目、年齢ポイントの増殖速度に基づいてのために倍の時間を（δ）を計算します。倍加時間iを計算するために使用される式S： <img src="/files/ftp_upload/1156/equat.png" alt="式" /> 外径1とOD 2は連続するOD測定とT 1とT 2の測定値間の時間であることを表す場所。わずか0.2〜0.5のOD値の間の時間を倍に計算する。これらの値の平均は、そのウェルの倍加時間です。わずか0.2〜0.5のOD値の間の時間を倍に計算する。これらの値の平均は、そのウェルの倍加時間です。ほとんどの野生型酵母株は、85〜90分との間の倍加時間の値を与える必要があります。 </li><li>各年齢の点について、最初の年齢ポイント（2日目）からの相対伸長曲線の時間シフト（Δtを）計算する。これを行う簡単な方法は、年齢ポイントの初期と年齢ポイントごとに、その後の間に0.3のODを達成するために各ウェルにかかった時間の長さの違いを決定することです。特定のは、よく0.3のODに達する時間は、OD = 0.3二つの時のポイントブラケットとの間の時間の関数としてLN（OD）に対応する線形回帰式から算出することができる。 </li><li>生存曲線（図3）を生成するために、各年齢の時点で生存率を計算する。 100％の生存率であることが最初の年齢ポイント（2日目）を定義します。年齢ポイントごとに連続するための式を用いて生存率を計算します。 <img src="/files/ftp_upload/1156/equat2.png" alt="第二式" width="245" height="115" /> S Nが生存率である、Δtのnはタイムシフト、およびδ は n倍の時間です。 </li><li>年齢の関数として、生細胞の割合を（またはパーセント）をプロットすることにより生存曲線（図3B）などの各ウェル（またはレプリケート井戸）の所​​望の生成。 </li><li>各ウェルの生存に不可欠（SI）を計算する。 SIは、生存曲線下の面積として定義されており、式で見積もることができます。 <img src="/files/ftp_upload/1156/equat3.png" alt="式（3）" width="400" height="79" /> ここで、年齢nは、年齢の点（例えば2、4、6、9、11、13）であり、S nは、その年齢時点での生存率の値です。 </li><li> SIと生存データから複製井戸の統計的パラメータを決定する。興味のある一般的な統計的なパ​​ラメータは、平均値、中央値、および複製する生物学の各セットのための分散が含まれています。 t検定または類似の分析は、異なる実験群と対照群のSIの一対比較のために使用することができます。それはまた、生物学的に複製平均から​​4.8に記載されて生存曲線を生成することが望ましい場合があります。 </li></ol>パート5：代表的な結果実験終了時には、いくつかの異なる系統や条件の経時的老化の可能性を判断するために十分な生存曲線と実行データの分析をプロットしているでしょう。適切に実行する場合、Bioscreen C MBRのマシンから得られた成長曲線は、図2に示すもののようになっているはずですし、結果の生存曲線は、図3に示すもののようになります。一般的に、ここに記載の条件下で培養した野生型細胞は7日のオーダーの中央値系列の寿命を持つことになります。生存率の大幅な変動が異なる株で、そのような0.05％グルコース培地での成長などのいくつかの条件の下で観察され、生存期間の中央値は30日を超えることができます。 <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig1.png" alt="" /> 図1。Bioscreenプログラム&quot;EZExperiment&quot;からのデータ出力。カラム吸光度の読み取りが行われた時刻が表示されます。連続した列には、老化の培養から採取した細胞を接種したハニカムプレートのウェルを表しています。 <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig2.png" alt="" /> 図2実験の過程で、単一の生物学的複製から伸長曲線。老化培養中の細胞が生存能力を失うように時間をかけての曲線に明瞭な変化があります。最初の時点（2日）と連続する時点間の時間の長さは、その特定の年齢で生存性を決定します。 <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig3a.png" alt="" /><img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig3b.png" alt="" /> 図3。 A）生存曲線は、図1から伸長データを使用して生成。 2日目時点を100％の生存率のポイントとして設定されています。B）2つの株の最終的な生存曲線は、同じ実験でテストした。これらの生存曲線は、3つの生物の平均生存率は、それぞれの菌株に対して複製表しています。エラーバーは、生物が複製内の標準偏差を表しています。生存曲線の下の斜線の領域は、歪1の生存に不可欠（SI）を表します。 <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2">表1。経時的老化研究のために使用される合成定義ミディアム（株backgrouND BY4743） </td></tr><tr><td>コンポーネント</td><td>濃度（g / L） </td></tr><tr><td> D -グルコース</td><td> 20 </td></tr><tr><td>酵母窒素塩基（-AA/AS） </td><td> 1.7 </td></tr><tr><td> （NH 4）2 SO 4 </td><td> 5.0 </td></tr><tr><td>アデニン</td><td> 0.04 </td></tr><tr><td> L -アルギニン</td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L -アスパラギン酸</td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> L -グルタミン酸</td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> L -ヒスチジン</td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> L -ロイシン</td><td> 0.3 </td></tr><tr><td> L -リジン</td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> L -メチオニン</td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L -フェニルアラニン</td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> L -セリン</td><td> 0.375 </td></tr><tr><td> L -スレオニン</td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L -トリプトファン</td><td> 0.04 </td></tr><tr><td> L -チロシン</td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> L -バリン</td><td> 0.15 </td></tr><tr><td>ウラシル</td><td> 0.1 </td></tr></tbody></table> 注：このレシピは、二倍体BY4743株にauxotrophiesを占める。アミノ酸auxotrophiesは、合成完全培地に5倍の最終濃度を追加することにより補償されるべきである。

<ol><li>Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+aging+in+yeast%3A+the+means+to+the+end%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Replicative aging in yeast: the means to the end.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29(2008).</li>
<li>Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaeberlein%2C+M+%22Handbook+of+models+for+human+aging%22">Handbook of models for human aging</a>. Conn, P. M. , Elsevier Press. Boston. 109(2006).</li>
<li>Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae.</a> Aging Cell. 2 (2), 73(2003).</li>
<li>Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+yeast+chronological+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (2), 113(2008).</li>
<li>Piper, P. W., Harris, N. L., MacLean, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preadaptation+to+efficient+respiratory+maintenance+is+essential+both+for+maximal+longevity+and+the+retention+of+replicative+potential+in+chronologically+ageing+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Preadaptation to efficient respiratory maintenance is essential both for maximal longevity and the retention of replicative potential in chronologically ageing yeast.</a> Mech Ageing Dev. 127 (9), 733(2006).</li>
<li>Fabrizio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+is+a+mediator+of+an+altruistic+aging+program+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Biol. 166 (7), 1055(2004).</li>
</ol>

ここで説明する高スループットの時系列の寿命測定法は高精度と精度を有する株の多数の老化の可能性を定量化するための効果的な方法です。コロニー形成単位をカウントすることで生存を決定するための古典的な手法に比べてこの方法の主な進歩は、（例えば3を参照）、高解像度の成長曲線でを得るためにそのようなBioscreen C MBRのマシンのようなシェーカー/インキュベーター/プレート読取装置を使用することです。各年齢ポイント。低スループットchronologicalの寿命アッセイと直接比較では、このメソッドは、実質4を分析することができるサンプルの数を増加させながら、同等（またはそれ以上）の精度を達成することが示されている。 上記のような方法では、老化研究のために一般的に使用される培養条件の下で変更された時系列の長寿のための遺伝的変異のスクリーニングに適しています。このメソッドは、簡単に別の文化のような呼吸器系の成長への前適応（グリセロールの炭素源）5、水の保全ではなく、期限切れのメディアなどの条件、または食事制限4</...

<table><tbody><tr><td>Bactoペプトン</td><td>試薬</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Bacto酵母エキス</td><td>試薬</td><td>BD Biosciences</td><td>288620</td><td></td></tr><tr><td>Difcoアガー</td><td>試薬</td><td>BD Biosciences</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base (アミノ酸および硫酸アンモニウム不含)</td><td>試薬</td><td>MidSci</td><td>J630-500G</td><td></td></tr><tr><td>アミノ酸</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫酸アンモニウム</td><td>試薬</td><td>Spectrum</td><td>AM185</td><td></td></tr><tr><td>デキストロース</td><td>試薬</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-10</td><td></td></tr><tr><td>Bioscreen C MBR装置</td><td>器具</td><td>Growth Curves USA</td><td>5101370</td><td></td></tr><tr><td>Bioscreen 100ウェルハニカムプレート</td><td>器具</td><td>Growth Curves USA</td><td>9502550</td><td></td></tr></tbody></table>

高齢者の細胞の伸長によって酵母年表寿命の定量化

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

出芽酵母<em&gt;サッカロマイセスセレビシエ</em&gt;老化研究の分野において重要なモデル生物であることが実証されています<sup&gt; 1</sup&gt;。複製と時系列のライフスパンは、酵母の老化研究に使用される確立された2つのパラダイムです。経時的老化は時間の細胞の長さによって定義される非分裂、静止のような状態で生き残ることができる、複製老化は、単一の酵母の母細胞が老化する前に生成する娘細胞の数として定義されています<sup&gt; 2</sup&gt;。我々は、時系列寿命の定量的な測定のためのハイスループット法を開発した。この方法は、攪拌下で、一定の温度で定義された培地で細胞を老化伴います。各年齢時点で、細胞の亜集団は、老化培養液から除去され、豊富な増殖培地に接種。高解像度の成長曲線は、Bioscreen C MBRのマシンを使って高齢者の細胞のこの亜集団について得られる。アルゴリズムは、各年齢ポイントでの成長カイネティクスに基づいて、各サブ母集団における生存細胞の相対的な比率を決定するために適用されます。このメソッドは、再現性と精度を維持しながら、他の時系列の寿命のアッセイに比べて大幅に少ない時間とリソースが必要です。このアッセイのハイスループットな性質は、より複雑な生物でさらにテストするために新たな長寿の修飾子を識別するために大規模な遺伝学的および化学的スクリーンを許可する必要があります。

酵母の老化時系列は定常期での時間に関連付けられている細胞の生存率の損失を指します。ここでは、定量的に酵母系列寿命を決定するためのハイスループット法を説明します。

出芽酵母 *Saccharomyces cerevisiae* は、老化研究の分野において重要なモデル生物であることが証明されています 1。複製寿命および...

老化培養物は、30 °Cで定常的に撹拌しながら試験管内で維持します。各老化培養物から分注した細胞を、YEPD培地を含むバイオスクリーン・ハニカムプレートのウェルに接種します。バイオスクリーンCMBR装置を用いて、ハニカムプレートを24時間培養および振盪させながら、各ウェルの吸光度を測定します。バイオスクリーンのデータ出力から30分ごとの増殖曲線を生成でき、これを用いて各老化培養物の生存率を算出することが可能です。24時間のインキュベーション後、ハニカムプレートのウェル内の細胞密度は、元の老化培養物の生存率によって異なる場合があります。こんにちは、ワシントン大学病理学部のMatt Capline博士の研究室のChris Murakamiです。本日は、老化細胞の増殖能を用いて酵母の暦年齢を定量化する手順について解説します。当研究室では、遺伝的要因と環境的要因の両方が酵母の寿命にどのように影響するかを研究するために、この手順を用いています。それでは始めましょう。老化培養液を調製するために、まず凍結保存ストックから酵母株をYEPDアガープレートにストリークし、30 °Cで48時間、または単一コロニーが出現するまで培養します。単一コロニーが出現したら、コロニーをピックアップし、5 mLのYEPD液体培地に接種します。試験管を用い、ローラードラム内で30 °Cで一晩培養して絶えず撹拌します。一晩の培養後、各培養液から50 µLを分注し、5 mLの合成完全培地（SC培地）に接種します。通常、解析対象となる各菌株について3本のSC培地培養液を準備し、寿命解析における生物学的反復を3回行います。培養液は、2日間の培養後、通常2週間以上の実験期間中、ローラードラムを用いて30 °Cで絶えず撹拌しながら維持します。SC培地において、細胞が定常期に達した時点で最初の経時的サンプリング（age point）が可能です。その後は、最低2週間、2〜3日ごとにサンプリングを行います。この手順を開始するために、バイオスクリーンを準備します。接種用に100ウェルのハニカムプレートを用意し、各ウェルに145 µLのYEPDを満たします。後のデータ解析のため、少なくとも1つのウェルには細胞を加えずにYEPDのみを満たしておいてください。その後、インキュベーターから老化培養物を取り出します。簡潔に説明すると、まず、ハニカムプレートに接種する最初の培養液をボルテックスで攪拌します。この際、培養液をこぼさないように注意してください。試験管の口を火炎滅菌し、培養液を 5 µL 分取して、ハニカムプレートの最初のウェルにピペッティングします。試験管の口を火炎滅菌することを忘れないでください。5 µLの分注液を取り出した後、各経時的な培養物に対してこの接種手順を繰り返します。各培養物に対応するウェルの位置を正

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生物学

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