Name: 全反射顕微鏡による網膜双極細胞におけるイメージングのエキソサイトーシス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: 学ぶ全反射蛍光顕微鏡を用いた金魚網膜双極細胞におけるシナプス小胞エキソサイトーシスの可視化法。パッチクランプとTIRFイメージングで神経伝達機構を解析します。

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<ol><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Traffic. 2, 764-774 (2001).</li>
<li>Zenisek, D., Steyer, J. A., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport%2C+capture+and+exocytosis+of+single+synaptic+vesicles+at+active+zones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones.</a> Nature. 406, 849-854 (2000).</li>
<li>Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+association+and+exocytosis+at+ribbon+and+extraribbon+sites+in+retinal+bipolar+cell+presynaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Vesicle association and exocytosis at ribbon and extraribbon sites in retinal bipolar cell presynaptic terminals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 4922-4927 (2008).</li>
<li>Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+synaptic+ribbons+in+the+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualizing synaptic ribbons in the living cell.</a> J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li>
<li>Rouze, N. C., Schwartz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continous+and+transient+vesicle+cycling+at+a+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Continous and transient vesicle cycling at a ribbon synapse.</a> J. Neurosci. 18, 8614-8624 (1998).</li>
</ol>

客観型全反射顕微鏡の利点は、1）それはそれによって焦点のずれた光を最小限に抑え、目的の焦点面内に狭い領域に励起光を制限することにより、優れた光学セクショニングを提供することであり、2）光が距離と共に指数関数的に低下するので、 、垂直方向の移動は、蛍光強度の変化としてモニターすることができる、高開口数の対物1,5〜3）効率的な集光。 技法の主な欠点は、それが電子顕微鏡の超薄のセクションとほぼ同じである細胞表面、100＆nmの内部で何が起こっイメージングイベントに制限されていることです。したがって、これらのイベントの可視化は、しっかりとガラスに接着されている細胞で、ガラスに付着した膜のパッチに近いシナプスリボンの存在にし、小胞のロードが成功に決定的に依存する。我々のプロトコルは、双極細胞シナプス終末2,6内の小胞の総数のわずか1〜2％のローディングを可能にします。とは言うものの、それは我々がイメージすることができるものよりも細胞表面で起こって多くのイベントがあることは明らかである。

全反射顕微鏡による網膜双極細胞におけるイメージングのエキソサイトーシス

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

全内部反射蛍光（全反射）顕微鏡は、ガラスなどの高屈折率物質に最も近い蛍光分子の選択的なイメージングによって、細胞膜で発生するイベントの調査を可能にする技術です。<sup&gt; 1</sup&gt;。この記事では、金魚の網膜から単離された網膜双極細胞におけるシナプス小胞の画像のエキソサイトーシスにこの手法を適用する。これらのニューロンは、彼らの大きな軸索末端に起因するこの種の研究に非常に適している。双極細胞のクランプを同時にパッチすることで、それはシナプス前電圧とシナプス放出との関係を調査することが可能です。<sup&gt; 2,3</sup&gt;。双極細胞の端末内のシナプス小胞は、共同パフ色素と高Kを含むリンゲル液によって蛍光染料（FM 1から43 ®）を使用してロードされます<sup&gt; +</supシナプス端子へ&gt;濃度。これは、細胞を脱分極し、グルタミン酸作動性小胞へのエンドサイトーシスとそれに伴う色素の取り込みを刺激する。約30分間離れて余分な色素を洗浄後、細胞はパッチがクランプと488 nmのレーザーで同時に撮像されるための準備が整いました。パッチピペット溶液は、シナプスリボンのタンパク質のリブアイに選択的に結合するローダミンベースのペプチドが含まれています<sup&gt; 4</sup&gt;、端末が561 nmのレーザーで撮像する場合、それによって具体的にリボンにラベルを付ける。これは、アクティブなゾーンの正確な局在と余分なシナプスのイベントからシナプスを分離することができます。

このビデオでは、我々は内部全反射蛍光（全反射）顕微鏡を使用して金魚網膜双極細胞における単一シナプス小胞のエキソサイトーシスと人身売買にラベルを付けたり、視覚化する方法を示しています。

全内部反射蛍光（TIRF）顕微鏡法は、選択的な...によって、細胞膜で起こる現象を研究することを可能にする技術である。

この手順は、成魚の金魚の神経網膜（眼の背面にある神経組織）の摘出から始まります。網膜を酵素溶液に35分間浸し、洗浄した後、火炎滅菌したガラスピペットで処理して細胞を分散させます。その後、細胞を高屈折ガラスカバースリップ上に播種し、プラスチック製組織培養ディッシュに取り付けます。単離された双極細胞は、終末への特徴的な形態によって識別されます。FM 1-43を含む溶液を10秒間パフ適用し、30秒間待機した後、色素を洗浄します。30分間の洗浄後、細胞をパッチクランプし、TIRF顕微鏡でイメージングします。こんにちは。私はイェール大学医学部細胞・分子生理学部門ZECラボのChristina Joviです。本日は、TURF顕微鏡を用いて生きた網膜双極細胞におけるエキソサイトーシスを研究するための手順をご紹介します。当研究室では、シナプス放出のメカニズムを研究するためにこの手法を用いています。それでは始めていきましょう。まず、解剖前に金魚を少なくとも30分間暗順応させます。斬首して眼球を取り出した後、1つの眼球をフィルターペーパーの上に置き、11番メスの先端を用いて強膜縁を穿刺します。穿刺した穴の中にボナ剪刀を用いて、前眼部全体を切り出します。次に、残った視杯の上に小さなフィルターペーパーを置き、軽く圧力をかけます。硝子体を吸収させるため、網膜が付着したフィルターペーパーを持ち上げ、VNA剪刀を用いて視神経を切断します。網膜を載せたフィルターペーパーを、高アルロン溶液を入れた35mmプラスチック培養皿に入れ、Dumont 7番ピンセットを用いてフィルターペーパーから網膜を剥がします。次に、工業用炭素鋼シングルエッジブレードを半分に折ったものを用いて、網膜を4〜6片に切り分け、ヒアルロニダーゼ溶液の中で20分間静置します。ヒアルロニダーゼが作用するまでの間に、パパインにL-システイン溶液を5mL加え、液体が透明になるまで約5〜10分間静置します。切り分けた網膜の断片を低カルシウムリンガー液で3回洗浄し、パパイン溶液の中で30〜35分間静置します。パパイン溶液中で35分間インキュベートした後、網膜片を3回洗浄します。洗浄した網膜片を、低カルシウムリンガー液を入れた35mmプラスチック培養皿に移し、細胞解離を開始するまで12～14℃で保存します。まず、ブンゼンバーナーを用いてガラス製ペーストラルピペットまたはピペットの先端を加熱し、解剖用ピンセットでわずかに曲げて解離用ピペットを作製します。低カルシウムリンガー液が入ったマイクロ遠心チューブに網膜の一部を入れ、作製した解離用ピペットで慎重にピペッティングを繰り返し、網膜をゆっくりと解離させます。気泡が入らないように注意しながら、網膜懸濁液を1滴、低カルシウムリンガー液を満たした自家製記録チャンバーに加えて、単離した細胞を配置します。チャンバーは、中央に円形の穴が開いた35 mmプラスチック培養皿の下半分と、底面に接着された屈折率1.78のガラス製円形カバーガラスで構成されています。解剖と双極細胞の単離が完了したので、双極細胞のロードと洗浄を開始します。この実験では、非常に高い開口数を持つ対物レンズと高感度カメラを備えた、対物レンズ型全内部反射蛍光顕微鏡を使用するのが最適です。このビデオでは、開口数1.65の対物レンズと電子増倍電荷結合素子（EMCCD）を使用します。まず、高屈折率液体を顕微鏡の対物レンズに1滴加えます。次に、記録チャンバーを顕微鏡の対物レンズの上に配置します。接地電極と超灌流出口パイプをチャンバーに慎重に取り付けます。チャンバーを顕微鏡上に10～20分間静置し、細胞を底面に沈降・接着させます。次に、超灌流ラインをパージし、洗浄液を加えます。低カルシウムリンガー液および対照リンガー液をスーパーフュージョンシステムに注入します。顕微鏡の明視野照明を点灯し、無傷の双極細胞を探します。顕微鏡を軽く叩き、ニューロンがチャンバーの底にしっかりと付着しているかを確認します。スーパーフュージョンペンを無傷の細胞の近くに配置し、低カルシウムリンガー液で試料を連続的に灌流します。次に、室内の照明を消し、蛍光色素の励起を最小限に抑えるために光学路に赤色ロングパスフィルターを挿入します。ローディングピペットに蛍光色素溶液を10 µL充填します。マイクロマニピュレーターに取り付け、オーバープレッシャーオプションを使用せずに、選択したbilar細胞と同じ焦点面に到達するまで準備試料の上に降ろします。パフ開口部を軸索末端から約10 µmの距離に配置します。灌流システムをオフにし、ピペットのオーバープレッシャーをオンにして、染料溶液を10秒間パフします。次に、ピペットを動かさないまま、オーバープレッシャー（過剰圧）をオフにします。30秒間待ち、スーパーフュージョンシステムをオンにして、チャンバー内を洗浄液で5分間洗浄します。その間に、バスからバッファーピペットを取り出します。5分後、SUPERFUSIONシステムを低カルシウムリンゲル液に切り替え、25〜30分間灌流して、過剰な色素を除去します。双極細胞へのローディングと洗浄が完了し、パッチクランプおよびT-I-R-F-Mイメージングを開始できる状態になりました。洗浄完了後、パッチピペットへの色素混入を避けるため、電極ホルダーを交換してください。軸索末端を視野の中心に配置します。パッチピペットに7 µLの内部溶液を満たします。軽く叩いて気泡を取り除いてください。溶融した歯科用ワックスでコーティングし、マイクロマニピレーターに取り付けます。ピペットのオーバープレッシャーをオンにし、ピペットを標本に向けてゆっくりと降ろします。ピペットの抵抗を確認し、必要に応じて調整を行ってください。次に、スーパーフュージョンシステムをコントロールリンガー液に設定し、電極の先端を細胞体に軽く接触させることで、ピペットと細胞の間にギガシールを形成します。ピペットのオーバープレッシャーをオフにした状態で、シールが形成された電極に緩やかに陰圧をかけます。アンプリファイアでホールセルモードを選択し、細胞保持電位を-60 mVに設定します。次に、イメージングソフトウェアを使用して、軸索末端全体を含む関心領域（ROI）を選択します。明視野照明を消し、488 nanometerのレーザーを短時間照射します。TIRFイメージングに適した焦点面を探してください。次に、アンプリファイアのzapコマンドを使用して細胞膜を破ります。この際、ピペットにわずかな陰圧をかけ、細胞容量と系列抵抗の補正を行ってください。その後、シナプス小胞の移動をイメージングしながら、電圧プロトコルを適用します。回復を待つため、試行間には少なくとも40秒間のインターバルを設けてください。まず、明視野顕微鏡を用いて双極細胞を選択します。次に、ズームアップして軸索末端に蛍光染料を充填します。30分間の洗浄後、充填された末端を顕微鏡下で観察し、蛍光標識されたグルタミン酸作動性小胞の移動をイメージングできます。ここでは、パッチピペットを通じてリボンアイ結合ペプチドを導入する方法を紹介します。これにより、561ナノメートルのレーザーでイメージングした際に、シナプスリボンの位置を確認することができます。次に、細胞を脱分極させ、488ナノメートルのレーザーを用いて小胞の移動をイメージングします。以上の手順で、網膜双極細胞の解離、プレートへの播種、蛍光染料による負荷、ならびにこれらのニューロンのパッチクランプおよび2光子顕微鏡による同時イメージングの方法について解説しました。この手順を行う際は、細胞をレーザーに長時間さらさないようにすることが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功を願っております。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

パッチクランプキャパシタンス測定とCa 2 +</sup網膜スライスにおける単一神経終末で>イメージング

それゆえ、それが関与するタンパク質の空間的および時間的挙動を調べることが重要であるシグナリングを理解するために、細胞膜内や細胞内の場所にどちらかのタンパク質の棲み分けが大幅にシグナル伝達の結果に影響を与えることができる1調節機構である。ここではT細胞のシグナル伝達を研究するための全反射顕微鏡ベースのシステムを説明しますが、広く適用可能である。...

TCRとそれに関連するシグナル伝達タンパク質のリアルタイムの同時イメージングのための全反射顕微鏡法

出典:Daniele, F., et.al SH-SY5Y 神経芽腫細胞における神経伝達物質小胞ダイナミクスを評価するための TIRFM および pH 感受性 GFP プローブ: 細胞イメージングとデータ解析.J. Vis.

全反射蛍光顕微鏡を用いた細胞イメージング

出典: Winkle, C. C., et al.軸索分岐と神経細胞形態形成中の原形質膜送達の役割を定義するための複合方法論の利用。J. Vis. 経験。...

エキソサイトーシスイベントの可視化のための全反射蛍光顕微鏡

偏光ベース全内部反射蛍光顕微鏡（pTIRFM）は、細胞膜動態のリアルタイム検出を可能にする。この記事では、調節性エキソサイトーシスの間に膜のリモデリングの研究のためpTIRFMの実装について説明します。技術は、直接的または間接的に、膜形状の変化を伴う細胞生物学における他のプロセスに一般化である。...

pTIRFMによる画像形成細胞膜変形は

クラスリン媒介性エンドサイトーシスは、シグナル伝達受容体を含む多くのタンパク質を内部化する急速で非常に動的なプロセスです。ここで説明するプロトコルは、個々のエンドサイトーシスイベントの動態を直接視覚化します。これは、エンドサイトーシス機構のコアメンバーがどのように互いに協調し、タンパク質カーゴがこのプロセスにどのように影響するかを理解するために不可欠です。...

TIRF顕微鏡を経由してシングルイベント解像度のGタンパク質共役型受容体のクラスリン依存性エンドサイトーシスの可視化

この論文は、シナプトブレビン2-pHluorinコンストラクトと全反射蛍光顕微鏡を使用して、神経芽細胞腫細胞における神経伝達物質小胞動態を調査する方法を提供します。また、画像処理とデータ分析のために開発された戦略についても報告されています。...

細胞イメージングおよびデータ分析：SH-SY5Y神経芽腫細胞における神経伝達物質小胞のダイナミクスを評価するためにTIRFMとpH感受性GFP-プローブ

ここで規制エキソサイトーシスの生きているセルイメージ投射のための方法を詳しく説明します。このメソッドは、記者として FITC...

規制エキソサイトーシスの記者として FITC デキストランをイメージング

in vivoイメージングは、健康と疾患における生物学の研究のための強力なツールです。このプロトコルは、標準的な2光子顕微鏡によるマウス網膜の経瞳孔イメージングについて説明しています。また、網膜の複数の細胞コホートを蛍光標識するためのさまざまなin...

経瞳孔二光子マウス網膜のin vivoイメージング

この研究は、光受容体細胞体を除去することで、抗体の拡散が速くなり、免疫組織化学、 in situ ハイブリダイゼーション、および電気生理学実験のための網膜内ニューロンへのパッチピペットアクセスが改善される、代替のフラットマウント網膜製剤を提示します。...

脊椎動物の網膜の内核層ニューロンを研究するための改良されたフラットマウント調製としてのスプリット網膜

本論文は、スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いて網膜におけるミクリアの運動性とシナプス後点との接触を可視化・定量化する方法を示します。...

病変マウス網膜におけるミクログリアの動態およびシナプスとの相互作用のライブイメージングおよび特徴付け

学ぶ全反射蛍光顕微鏡を用いた金魚網膜双極細胞におけるシナプス小胞エキソサイトーシスの可視化法。パッチクランプとTIRFイメージングで神経伝達機構を解析します。

全反射顕微鏡による網膜双極細胞におけるイメージングのエキソサイトーシス

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