負傷ラット脊髄を修復するために末梢神経移植とマトリックスモジュレーションを組み合わせ

末梢神経を脊髄損傷部位に移植するための準備は、移植の7〜10日前にPNGを前変性させることから始まります。ドナーラットから脛骨神経枝を切断します。吸引により、頚髄第5レベル（C5）の半切断を行います。

ドナーラットからPNGを取り出し、病変腔の吻側壁に接するように配置し、縫合糸で硬膜に固定します。3週間後、C7部位に背側四分の一病変を作成します。グリア瘢痕のプロテオグリカンを消化させるため、CHABCを浸透させたゲルフォームを病変腔内に15分間留置します。2日後、病変部位に隣接してCHABCを微量注入し、PNGの遠位端を背側四分の一病変に接するように配置します。

こんにちは、ジョン・ヒューラです。私はドレクセル大学医学部脊髄損傷研究センターのディレクターを務めています。私はヒューラ研究室のヴェロニカ・トム博士です。そして私はマーサ・ミーンです。

hula labより。本日は、成体ラットの損傷した脊髄へ末梢神経片を移植する手順を実演します。当研究室では、脊髄損傷後の軸索再生および機能回復を研究するために、この手法を用いています。

それでは、始めましょう。顕微鏡下手術の準備として、手術ステーションを消毒し、すべての手術器具をオートクレーブで滅菌します。また、サーマルバリアおよび、微小止血用の2 mm³未満の小さなゲルフォームを用意してください。

綿棒、ガーゼパッド、および手術器具を準備します。足指をピンチして、動物が完全に麻酔状態にあることを確認した後、麻酔をかけたラットを処置台に置きます。予定されている術野の広範囲にわたって除毛し、付属のテキストプロトコルに記載されている無菌洗浄法に従って手術部位を洗浄します。

次に、ラットをサーマルバリアの上に置き、吸入コーンで鼻と口を覆い、イソフルランを3％に、流量を0.2 liters per minuteに下げます。適切な用量の抗生物質アンピシリンを皮下注射し、鎮痛剤ブプレノルフィンを筋肉内注射で投与します。末梢神経（PN）は、除去の7～10日前に切断して変性を促進させます。これにより、新鮮な神経標本よりも軸索伸展に適した環境が提供されます。

pnの切断を開始するために、動物を側臥位にします。滅菌手袋に交換し、手術部位の周囲に滅菌ドレープを掛けます。大腿骨頭から膝に向かって直線的に切開し、大腿骨から約3 mmの間隔を保ちながら平行に切開します。皮膚切開と同じラインに沿って浅層のbiceps fems筋肉を切断し、下層にあるvastus lateralis筋肉を露出させます。

外側広筋を露出させた後、膝に近い位置でハサミを用いて小さく切開し、そのまま大腿骨頭に向かって切開線を伸ばします。リトラクターで外側広筋を慎重に分離し、大腿骨に並行に走行する坐骨神経の脛骨神経枝と比腓骨神経枝が視認できるまで広げます。次に、これらの神経枝を大腿骨頭に向かって辿り、坐骨神経の本幹を特定します。

坐骨神経の分岐直下で、微細鑷子を用いて脛骨神経枝を囲む結合組織または神経外膜を慎重に分離します。こちらが太い方の枝です。脛骨神経枝を単離したら、6-0シルク結紮糸をその周囲に滑り込ませ、締め付けます。

マイクロ剪刀を用いて、結紮部位まで神経の切り端を切断します。縫合糸を外側広筋に通して結紮します。これにより、切断された脛骨神経の末端を容易に特定するための目印となります。

神経を採取します。その後、外側広筋を6-0シルク縫合糸で縫合します。続いて、上腕二頭筋を6-0シルク縫合糸で縫合します。

最後に、Michelle皮膚縫合クリップで皮膚を閉じます。イソフルランの供給を停止し、吸入用ノーズコーンを取り外します。動物をサーマルバリア（保温材）を敷いた保持ケージに入れます。

動物をホームケージに戻します。7〜10日後、動物が覚醒し活動的になった時点で、PNセグメントの採取が可能になります。移植を開始するために、麻酔をかけた動物をサーマルバリアの上に置きます。

動物が完全に麻酔状態にあることを確認した後、創傷クリップを取り外し、皮膚切開部を広げます。皮膚を容易に剥離させ、汚染を避けることができるため、事前の除毛は必ずしも必要ではありません。被毛を切断する必要がないため、浅層筋肉の縫合線を切断して外側広筋を露出し、さらにこの筋肉内の縫合線を切断します。

縫合線を脛骨神経の切断端まで辿り、神経から縫合糸を取り除きます。精密ピンセットを使用して、脛骨神経の15 millimeterの範囲で神経外膜を剥離し、この遠位端を切断します。神経セグメントを取り出し、滅菌済みのHank's平衡塩溶液に浸します。

次のステップである、PN移植のための脊髄損傷の誘導への準備が整いました。PN移植は自家移植または他家移植のいずれかで行うことができます。麻酔をかけたラットをサーマルバリア上に配置し、前節で述べたように抗生物質と鎮痛剤を投与して、脊髄の片側切断損傷を誘導します。まず、後頭切痕と、突出した第2胸椎（T2）の背側椎突起の位置を確認します。

これらの外的な指標間の全域にわたって切開を加えます。浅層の僧帽筋の中線を切開し、その下にある頸部深筋を分離します。開創器を挿入して筋肉を広げた状態に保ちます。

深層の脊髄上筋を、C4、C5、およびC6の背側椎突起から切除します。R jurorsを用いてC5の部分的な椎弓切除を行い、脊髄の右側全体および左側の内側部分を露出させます。脊髄正中線の指標として、顕著な背側静脈を使用してください。

次に、マイクロメスを用いて硬膜を穿刺し、C5脊髄にかけて切開線を広げます。引き伸ばしたガラスマイクロカニューレを用いて、その下のクモ膜下腔および軟膜に小さな切開を加えます。緩やかな圧力をかけながら、マイクロピンセットで組織を剥離して除去しやすくし、脊髄の右背側を吸引し始めます。

脊髄の中間部および腹側部分へと切り進み、背側から腹側まで、また正中線から外側髄膜まで完全に貫通する長さ2 mmの空洞を作成します。HEMIセクションの病変空洞内に、生理食塩水に浸したゲルフォームを配置します。止血を行うため、あらかじめ採取しておいた末梢神経セグメントをHank液から取り出します。

神経セグメントの近位3 mmの神経外膜を軽く触知し、この端をHEMI切断病変腔の吻側壁に合わせます。神経外膜から硬膜に向けて10-0縫合糸でセグメントを固定します。次に、移植片の端を覆うように硬膜を縫合し、移植片を2枚のセルエラスティック膜で挟み込みます。

移植片をC6、C7およびT1の椎骨突起に沿って配置します。神経の遠位端を脊髄や筋肉組織に接触させないでください。4-0縫合糸を用いて筋肉を層状に縫合し、皮膚切開部は皮膚ステープラーで閉鎖します。

最後に、動物をサーマルバリアの上に置いたホールドケージに入れ、その後ホームケージに戻します。動物が覚醒し活動的になると、PN移植片の遠位端に到達した再生軸索が脊髄へ戻って伸展できないことがよくあります。そのため、コンドロイチンACEを微量注入し、損傷部位周辺の瘢痕組織を分解させます。

この手順はPN移植から21日後に実施します。まず、動物が完全に麻酔状態にあることを確認してください。次に、以前に示した方法で創傷クリップを取り除き、抗生物質および鎮痛剤を投与します。微細鑷子とスプリング鋏を用いて表在性の縫合糸を切断し、神経移植片を囲む弾性膜を露出させます。

神経の長さを弾性膜から慎重に剥離します。神経を術野から避けて寄せます。第7頚椎椎弓の右側で部分的な椎弓切除術を行います。

マイクロメスを用いて髄膜を穿刺し、吸引によってC7脊髄に1 mm³の背側四分の一病変腔を作成します。止血させるため、生理食塩水に浸したゲルフォームを病変腔に配置します。その後、ゲルフォームをコンドロイチン硫酸に浸したものと交換します。

A BC。病変部位を15分間処置し、5分ごとにコンドロイチンを浸したゲルフォームを新しく交換する。神経移植片の外側をショラステック膜で覆う。浅層の筋肉を4-0縫合糸で、皮膚切開部を皮膚ステープラーで閉鎖する。

動物をサーマルバリアの上に置いた保持ケージに入れ、覚醒して活動的になったらホームケージに戻します。その2日後、PN移植から23日後に、動物に再度手術を行い、脊髄にコンドロイチンNAを微量注入します。前回と同様に、麻酔をかけた動物から創傷クリップを取り除き、抗生物質および鎮痛剤を投与します。

表在性の縫合糸を切断し、神経移植片を囲む弾性膜を露出させます。移植片を乱さないように注意しながら、C7の移植部位を露出させます。次に、先端を細く加工したガラスカニューレ付きのハミルトンシリンジを用いて、脊髄の右側、移植片と脊髄の接合部から遠位に約1 mmの点に、chondroitin ace A BCを1 µL微量注入します。

神経セグメントの遠位2 mmからEURをそっと剥離し、この端をC7病変腔に対置させます。神経外膜を通して10-0縫合糸を用いて、セグメントを硬膜に固定します。浅層筋肉を4-0縫合糸で、皮膚切開部を皮膚ステープラーで閉鎖します。

動物をサーマルバリア上の保持ケージに入れ、覚醒して活動的になったらホームケージに戻します。この手順が最適化されると、末梢神経節が宿主の脊髄と密接に統合され、移植片に再生する脊髄軸索を可視化できるようになります。私たちは、上行性および下行性の biotinylated dextrin amine (BDA) を用いて、移植片に拡散充填を行いました。

脊髄軸索は通常、移植片に進入し、移植片の長手方向に対して比較的直線的に成長し、1日あたり約1mmの速度で移植片の遠位端まで伸展します。末梢神経軸索は隣接する脊髄に浸潤します。遠位端に到達した際に、周囲の瘢痕組織から抑制性プロテオグリカンを除去するためにコンドロイチンNACEが使用された場合、溶媒（vehicle）で処理したときとは異なり、処理後は末梢神経軸索が宿主組織へと伸展することはほとんどありません。

しかしながら、遠位インターフェースをコンドロイチンで処理した場合、移植片から脊髄へと再神経支配を行う軸索が有意に多く伸展します。軸索伸展が観察される動物1匹あたり15〜20個の切片のうち、ここに示す1つの代表的な切片において、この棒グラフはconjoin nace A BC処理後に軸索伸展が有意に増加したことを示しています。移植片内の軸索への電気刺激に応答して、脊髄ニューロン上のシナプスマーカーを免疫化学的に検出することで、移植されたグラフトとホスト脊髄との間の機能的接続性を評価することができます。

遠位接合部を含むこの脊髄領域を、ビオチン化デキストランアミン（緑色）およびシナプスマーカーであるsynapsin（赤色）で免疫細胞化学染色しました。矢印はマーカーの共局在領域を示しており、移植片から再生した一部の繊維が機能的なシナプス接合を形成したことを示しています。移植片と脊髄ニューロン間の機能的接続は、c-Fos発現のアッセイによっても実証されました。遠位インターフェースより先の宿主ニューロンにシナプス刺激を与えると、この経シナプス活性化マーカーにより、移植部位の同側組織に多くのc-Fos陽性ニューロンが確認され、高倍率で観察すると、移植部位の対側組織ではc-Fos陽性ニューロンがほとんど観察されませんでした。

脊髄損傷後の再生を促進するために、末梢神経移植に向けた脊髄損傷部位の準備方法について説明しました。この処置を行う際は、移植前に十分な神経長を確保すること、および移植片を脊髄損傷部位に密接に接触させることが重要です。以上で説明を終わります。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。