蛍光その場でハイブリダイゼーション（FISH）プロトコル

ヒト精子核における蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）プロトコルは、臨床診断の分野で広く導入されています。この手法の応用例の一つに、精子の倍数性スクリーニングがあります。不妊男性への生殖に関するアドバイスの一環として、これらの個体では一般集団よりも数的な異常の出現率が高く、しばしば精液パラメータの異常を示します。

これは、これらの異常を子孫に伝達するリスクが高まることを意味します。本日は、13番、18番、21番、XおよびY染色体の解析を目的とした、脱凝縮精子核における蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（FISH）プロトコルについて解説します。検体を採取した後、液状化が起こるまで室温で20分間放置します。プロトコルを開始するために、検体を遠心分離管に移します。

実験の最初に使用する溶液は、37 °Cに予熱した高張液と、3:1の割合のメタノール酢酸です。これらは調製直後のものを使用してください。その後、サンプルを1,000 ×gで5分間遠心分離します。

次に、上清を静かに取り除き、液量が約 10 milliliters になるまで高張液を滴下します。このチューブを 37 °C で 30 分間静置した後、サンプルを再度遠心分離します。遠心分離により精子がチューブの底に集まるため、低張液をメタノールに置換することができます。

白いペレットが得られるまで、メタノール酢酸の交換に伴う酢酸遠心分離を必要回数繰り返さなければなりません。この際、さらにメタノール酢酸を追加する必要があります。最終容量は、以降の工程で得たい細胞分散状態に応じて調整してください。

最終ステップとして、-20°Cで保存したメタノール入りのリードスライド上に固定試料を滴下し、展延標本を作成します。後の再局在化に備え、スライド上の精子展延領域を特定しておくと便利です。これは、スライドの裏面にダイヤモンドペンシルを用いて容易に行うことができます。最適な細胞分散が確認されたら、スライドを-20°Cで最低24時間保存してください。

プロトコルを進める前に。実験のこのパートでは、生理食塩水、クエン酸ナトリウム溶液、エタノール系列、DRE、fatalおよびfideを使用します。スライドの解凍後、固定したサンプルを2×SSCを含む2つのコプランジャーに順次浸し、洗浄および脱水させる必要があります。

各コプランで3分間かかります。その後、スライドをエタノール・コプラン瓶に、濃度の低い順にそれぞれ2分間浸します。次の段階に進むために、ここでスライドを乾燥させる必要があります。

精子核内のDNAは高度に凝縮されているため、変性させる前にクロマチンを脱凝縮させる必要があります。これは37 °CのDTT溶液を用いて行うことができます。DTTは、精子核内でDNAを巻き付けているプロタミン のジスルフィド結合を切断することで作用します。スライドのDTTにおけるインキュベーション時間は、精液検体の本剤に対する反応性に応じて調整する必要があります。

通常は8分程度ですが、2分から15分の間で変動することがあります。この時間の後、スライドを直ちに2×SSCに移して3分間、さらに再び3分間処理し、続いてエタノール・コプランジャーにそれぞれ2分間浸します。プローブハイブリダイゼーションでは、単鎖DNAを用いることが不可欠です。そのため、プローブを添加する前に変性段階が必要であり、フォームアミド溶液中、73 °Cで5分間のインキュベーションを行います。スライド処理の締めくくりとして、最終的なエタノール溶液への移行が必要であり、各コプランジャーにスライドを1分間浸します。

これで、臨床診断のために実施されるFISH法におけるスライドのハイブリダイゼーション準備が整いました。最も一般的に解析される染色体には、性染色体および第13番、18番、21番染色体が含まれます。これらの染色体を解析するために、Vysis社のマルチカラーDNAプローブキットを使用します。

本製品には、緑色およびアクア色でそれぞれ標識された染色体X、Y、および18のαサテライト領域用のプローブ混合液が入ったバイアル1本と、緑色およびオレンジ色でそれぞれ標識された染色体13および21用のプローブ混合液が入ったバイアルもう1本が含まれています。添加するプローブ混合液の量は、ハイブリダイゼーションを行いたい領域のサイズによって異なります。15 × 15のカバーガラスの基準として、5 µLの量で十分です。

どちらのプローブ混合液も、利便性のためにハイブリダイゼーションバッファー中であらかじめ変性されており、脱凝縮および変性処理済みのスライドに直接添加することができます。また、これらの実験に使用可能な、幅広い染色体や遺伝子座を対象とした他の市販プローブも利用可能です。ただし、通常、これらのプローブを標的サンプルに添加する前には、事前の変性処理が必要となります。

このような状況では、メーカーの指示に従うだけで十分です。標的領域をカバーガラスで覆い、ゴムセメントで封印します。その後、スライドを37 °Cに予熱したハイブリダイゼーションチャンバーに入れ、その温度で6～24時間インキュベートします。

プロトコルの最終段階では、異なる濃度のクエン酸ナトリウム塩溶液と界面活性剤NP 40で調製したこれら2種類の洗浄液を使用します。インキュベーション時間が経過した後、スライドをハイブリダイゼーションチャンバーから取り出し、ラバーセメントを除去します。その後、カバーガラスを慎重に取り除きます。

図に示すように、スライドを73 °Cに予熱した第1洗浄液に2分間浸します。次に、室温の第2洗浄液に移し、さらに1分間浸します。これら2回の洗浄により、非特異的なハイブリダイゼーションシグナルを除去します。これら2回の洗浄後、プロトコルの最終ステップを完了させるため、スライドが乾燥するまで待ちます。

この段階で、細胞核の可視化を容易にするために対比染色剤を添加します。この目的で最も一般的に使用される薬剤の一つにDAPIがあります。添加する液量は、18 × 18 mmのカバーガラスを基準として、ハイブリダイゼーション領域の大きさに合わせて調整する必要があります。

DPIを8 µL添加します。カバーガラスをネイルポリッシュで封止すれば、標本の観察準備は完了です。あるいは、解析まで-20 °Cで保存することも可能です。

可視化に使用する顕微鏡は、dpi、Texas Red、FITC用の3色フィルター、およびaqua、FITC、Texas Red用の単色フィルターを備えたOlympus BX 60 epi蛍光顕微鏡です。3色フィルターを使用すると、x、Y、および18番染色体でハイブリダイズさせた標本において、これら3つの染色体のシグナルが表示されます。aqua用の単色フィルターを使用すると、18番染色体の蛍光シグナルのみを可視化できます。正常な精子1個につき、これらのシグナルが1つ観察されるはずです。

しかし、FITCのみのシングルバンドフィルターを使用すると、一部の精子にX染色体に相当する緑色の蛍光シグナルが認められます。緑色のシグナルを欠く精子は、Y染色体に由来する赤色のシグナルを示すはずであり、これはTexas red用フィルターを通じて特異的に可視化できます。トリプルバンドフィルターを用いて1321ハイブリダイゼーションを可視化することで、これら2つの染色体のシグナルを区別することが可能です。

緑色のシグナルは第13番染色体に対応しており、FITC用のシングルバンドフィルターを用いて特異的に視覚化できます。Texas Red用のシングルバンドフィルターを用いることで、第21番染色体のシグナルを特異的に視覚化することが可能です。正常な精子はすべて、これら2つのプローブそれぞれに対して1つのシグナルを示すはずです。

まとめとして、本プロトコルの主要な段階を説明します。繰り返しになりますが、高品質な伸展を得るためには、メタノール酢酸を1滴ずつ滴下し、固定工程を正確に行う必要があります。また、脱凝縮過程での精子凝集の形成を避けるため、DTT溶液中のインキュベーション時間は、当該製品に対する精液試料の反応性に応じて調整しなければなりません。

精子をDTTに過剰に曝露させると、プロトコルの最終段階でシグナルが分散し、逆に曝露が不十分であると、プローブのハイブリダイゼーションが起こらず、一部のシグナルが消失します。精子サンプルの変性は必須ですが、プローブの変性はメーカーの指示に従って調整する必要があります。ハイブリダイゼーション後の2回の洗浄における時間と温度を厳密に管理することが重要です。

温度が高すぎたり、洗浄時間が長すぎたりすると、一部のシグナルが消失することがあります。一方で、その逆（温度が低すぎる、または洗浄時間が短すぎる）の場合は、非特異的なシグナルが除去されません。最後に、良好な可視化とシグナルの判定には、適切な特異的フィルターを備えた落射型蛍光顕微鏡の使用が不可欠です。以上となります。

ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。