蛍光その場でハイブリダイゼーション（FISH）プロトコル

蛍光in situハイブリダイゼーションプロトコルは、ヒトの精子核において広く臨床診断の分野で取り入れられています。この方法論の一つの応用は精子数の倍数体スクリーニングです。不妊男性に与えられる生殖に関する助言の一環として、これらの個人において数値的異常の存在は一般的人口よりも高く、しばしば精液の異常なパラメータを示します。

これは、これらの異常を子供たちに伝えるリスクの増加を表しています。今日は、13, 18, 21, X, Y染色体を分析するための減縮した精子核における蛍光in situハイブリダイゼーションプロトコルを説明します。サンプルを採取した後、液化が起こるまで室温で20分間放置する必要があります。プロトコルを開始するには、サンプルを遠心分離管に移す必要があります。

実験の最初の部分で使用する溶液は、37度に加熱した高張溶液と、3対1の比率のメタノール酢酸です。これらは新鮮に調製する必要があります。その後、サンプルを1000Gで5分間遠心分離します。

次に、上清を優しく取り除き、高張溶液を10ミリリットルの体積になるまで1滴ずつ加えます。このチューブは37度で30分間保持し、その後サンプルを再度遠心分離します。遠心分離により、精子はチューブの底に集まり、低張溶液をメタノールに置き換えることができます。

酢酸での遠心分離を繰り返し、メタノール酢酸を白いペレットになるまで必要に応じて交換します。これが起こったら、さらにメタノール酢酸を加えます。最終的な体積は、さらなる拡散で得たい細胞分散に応じて調整します。

最後のステップは、固定サンプルをマイナス20度でメタノールに保管されたリードスライドに落とすことで拡散を作ることです。スライドの精子の拡散部分をダイヤモンド鉛筆で裏側からマークしておくと、将来の再定位に役立ちます。最適な細胞分散が確認されたら、スライドをマイナス20度で最低24時間保管します。

プロトコルに進む前に。実験のこの部分では、塩化ナトリウムクエン酸ナトリウム溶液、エタノールシリーズDRE fatalとfideを使用します。スライドが解凍されたら、固定サンプルを2回の連続したcoplan瓶に2回のSSCで洗浄し脱水します。

これは各coplanに対して3分かかります。次に、スライドをエタノールcoplan瓶に2分間浸す必要があります。増加する濃度の順序で、エタノールcoplan瓶を順に浸します。この時点で、次の段階に進むためにスライドを乾燥させる必要があります。

精子核のDNAは高度に凝縮しているため、変性させる前にクロマチンを減縮させる必要があります。これは37度のDTT溶液を使用して行うことができます。これは、精子の核でDNAを巻き込むプロタミンの硫黄橋を破壊する働きをする製品です。サンプルの反応性に応じて、DTTでのスライドのインキュベーション時間を調整する必要があります。

通常、これは約8分ですが、2〜15分の間に変化する可能性があります。この時間の後、スライドを2回のSSCに3分間、さらに3分間、そして各エタノールcoplan瓶に2分間移す必要があります。プローブハイブリダイゼーションでは、単一DNA鎖で作業することが不可欠です。これには、プローブの追加前に変性段階が必要で、73度のformer mite溶液で5分間のインキュベーション期間が含まれます。スライド処理を終えるには、エタノール溶液での最後の移行が必要で、スライドを1分間coplan瓶に浸します。

スライドは、臨床診断のために行われるFISH研究でハイブリダイゼーションする準備が整いました。最も一般的に分析される染色体には、性染色体と13、18、21番染色体が含まれます。これらの染色体を分析するために、vices製の多色DNAプローブキットを使用します。

これは、X、Y、18番染色体のアルファ衛星領域のプローブの組み合わせを緑色のオリジンとアクアにそれぞれラベル付けしたバイアルと、13、21番染色体に対応するプローブの組み合わせを緑色とオレンジにそれぞれラベル付けしたバイアルを含みます。追加するプローブ混合物の体積は、ハイブリダイゼーションしたい領域のサイズによって異なります。15×15のカバースライドを基準として、5マイクロリットルの体積で十分です。

両方のプローブ混合物は、使いやすくするためにハイブリダイゼーションバッファーで事前変性されているため、減縮して変性したスライドに直接追加できます。また、これらの実験で使用できる広範囲の染色体とロキに対応する他の商用プローブも利用可能です。通常、これらのプローブには、混合物を対象サンプルに追加する前に予備の変性処理が必要です。

このような状況では、製造元の指示に従うだけで十分です。対象領域をカバースライドで覆い、ゴム製接着剤で密閉します。その後、スライドはハイブリダイゼーションチャンバーに置く準備ができ、37度に予熱し、その温度で6〜24時間インキュベートします。

プロトコルの最後の部分では、異なる濃度の塩化ナトリウムクエン酸ナトリウム溶液と洗浄剤NP 40からなる2つの洗浄溶液を使用します。インキュベーション時間が過ぎたら、スライドをハイブリダイゼーションチャンバーから取り出し、ゴム製接着剤を取り除きます。次に、カバースライドを慎重に取り外します。

図示されているように、スライドを最初の洗浄溶液に2分間浸します。これは73度に予熱されています。次に、室温の2番目の洗浄溶液にさらに1分間移します。これら2回の洗浄は、非特異的なハイブリダイゼーションシグナルを排除するのに役立ちます。これら2回の洗浄の後、スライドが乾くのを待って、プロトコルの最後のステップを完了します。

この時点で、核の視覚化を容易にするために、核染色製品を追加します。この目的で使用される最も一般的な製品の1つはDPIです。追加する体積も、18×18のカバースライドを基準として、ハイブリダイゼーション領域のサイズに合わせて調整する必要があります。

DPIの8マイクロリットルの体積で十分です。カバースライドは爪楊枝で密封でき、準備は視覚化の準備ができています。そうでなければ、-20度で将来の分析まで保管できます。

視覚化に使用する顕微鏡は、dpi、Texas Red、FITC、およびaqua FITCとTexas Redの単一バンドフィルター用の三重バンドフィルターを備えたOlympus BX 60 epi蛍光顕微鏡です。三重バンドフィルターを通して、x、Y、18でハイブリダイゼーションされた準備は、これら3つの染色体のシグナルを表示します。aquaの単一バンドフィルターを使用すると、染色体18の蛍光シグナルのみを視覚化できます。正常な精子1本にこれらのシグナルの1つを期待する必要があります。

しかし、FITCの単一バンドフィルターのみを使用すると、一部の精子はX染色体に対応する蛍光グリーンシグナルを示します。緑色のシグナルがない精子は、Y染色体に対応する赤いシグナルを示すはずで、これはTexas Redフィルターを通して特に視覚化できます。三重バンドフィルターを通して1