Name: 高純度の取得トキソプラズマオーシスト (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-03T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: 学ぶ不連続塩化セシウム勾配法によるToxoplasma gondiiオーシストの高純度精製技術。感染猫糞便から分子生物学・組織培養実験に適した高純度オーシストを安全に分離する方法です。

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原稿のテクニカルレビューにご協力いただいたNichole Brinkman氏とMichael Ware氏、ならびに技術的および事務的サポートを提供いただいたAbu Sayed博士とLinda Ransick氏に感謝いたします。本研究は、米国環境保護庁（EPA）の研究開発局による、Dynamac, Inc.との契約番号EP-D-06-096、および米国農務省（USDA）との機関間合意番号DW-12-92289801-0を通じた一部資金提供と協力によって実施されました。本内容は当局による審査を受け、出版が承認されています。商標名や市販製品への言及は、それらの推奨や使用の勧告を構成するものではありません。MJSの現在の住所：Dynamac, Inc. Cincinnati, OH。

1. T. gondiiオーシストを取り扱う際の一般的な安全上の注意事項
 <ol>
 <li>T. gondiiオーシストを扱う際は、すべての安全上の注意事項に従うことが重要です。ほとんどの健康な個人において、T. gondii感染は免疫系によって容易に制御されますが、生涯にわたる感染が残ります。免疫不全の方は特にトキソプラズマ症にかかりやすく、T. gondiiオーシストを扱うべきではありません。また、感染により深刻な出生欠損を引き起こす可能性があるため、妊婦の方もT. gondiiオーシストを扱うべきではありません8。</li>
 <li>T. gondiiオーシストは、指定された区域で、訓練を受けた人員のみが扱う必要があります。指定区域に入る他の人に知らせるため、T. gondiiオーシストの作業中であることを示す標識を掲示しなければなりません。</li>
 <li>T. gondiiオーシストを扱う際は、実験衣、使い捨てガウン、使い捨て手袋、および適切な保護メガネまたはフェイスシールドなどの適切な個人用保護具（PPE）を着用してください。</li>
 <li>手袋は頻繁に交換することが推奨されます。T. gondiiオーシストで汚染された手袋で、いかなる実験器具も操作しないでください。</li>
 <li>T. gondiiオーシストを扱う際は、必ず使い捨ての吸収性ライナーを敷いた、オートクレーブ可能な金属製トレイを使用してください。使用するラックやチューブなどが、すべて使い捨てであるか、またはオートクレーブ可能であることを確認してください。</li>
 <li>すべてのT. gondii廃棄物は、少なくとも1時間、2回オートクレーブ滅菌しなければなりません。</li>
 <li>すべての非使い捨て器具（ラック、トレイなど）も同様に、少なくとも1時間、2回オートクレーブ滅菌しなければなりません。</li>
 <li>液体の吸引に使用する真空ラインは、真空ポンプの汚染を防ぐため、Vacushield™フィルターに接続してください。</li>
 <li>T. gondiiオーシストを用いた作業完了後、影響を受けたすべての実験台天板を消毒しなければなりません。調製直後の10%次亜塩素酸ナトリウムを作業区域にたっぷりと塗布し、乾燥させてください。その後、その区域を水で十分にすすいでください。</li>
 </ol>
2. バッファーおよび溶液の調製
 <ol>
 <li>752.66 gのスクロースを600 mlのddH2Oに溶解し、1 Lの2.2 Mスクロース溶液を調製する。加熱攪拌機を用いて穏やかに加熱しながら攪拌し、スクロースを溶解させる。完全に溶解した後、ddH2Oで全量を1 Lに調整する。その後、溶液をオートクレーブで20分間以上滅菌する。</li>
 <li>6.05 gのTris-HClと3.7 gのEDTAを700 mlのddH2Oに加え、pHを7.2に調整した後、ddH2Oで全量を1 Lにして、1 LのTEバッファー（50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA）、pH 7.2を調製する。</li>
 <li>CsCl密度勾配用として、21.75 gのCsClを103.25 mlのTEバッファーに加えて、比重1.15のCsClストック溶液（1.15-CsCl）を調製する。溶液Aは、TE 30 mlと1.15-CsCl 20 mlを混合して調製する。溶液Bは、TE 20 ml、1.15-CsCl 30 ml、およびフェノールレッド溶液12.5 μlを混合して調製する。溶液Cは、TE 10 mlと1.15-CsCl 40 mlを混合して調製する（表1）。</li>
 <li>40 gのNaOHを800 mlのddH2Oに溶解し、1 Lの1 N水酸化ナトリウム（NaOH）溶液を調製する。溶解後、ddH2Oで全量を1 Lに調整する。</li>
 <li>20 mlのH2SO4を980 mlのddH2Oに混合し、1 Lの2%（体積比）H2SO4溶液を調製する。</li>
 </ol>
 3. ショ糖浮遊法
 <ol>
 <li>2% H2SO4に含まれるT. gondiiオーシストの糞便懸濁液10 mlを、50 mlコニカル遠心チューブに加える。ここで、糞便懸濁液とは、既報8のショ糖浮遊法により前処理されたサンプルを指すことに留意されたい。感染猫から糞便サンプルを最初に採取した際、文献8に記載されているショ糖浮遊法で処理を行う。この追加のショ糖浮遊は、CsCl精製工程に持ち込まれる糞便デブリをさらに最小限に抑え、可能な限り純粋なT. gondiiオーシストを得るために必要である。</li>
 <li>糞便懸濁液に1 N NaOH 6 ml（3/5容量）を加え、2% H2SO4を中和する。ボルテックスミキサーで十分に混ぜ合わせる。</li>
 <li>糞便懸濁液に等量（16 ml）の2.2 Mショ糖を加え、最終濃度を1.1 Mとして、ボルテックスミキサーで十分に混ぜ合わせる。</li>
 <li>10 mlピペットを用いて、ショ糖/糞便懸濁液の上にddH2O 10 mlを慎重に重層する。懸濁液を室温で、ブレーキなしの条件にて1,200 x gで20分間遠心分離する。</li>
 <li>上層の水層と界面層を慎重に回収し、ピペットを回さないようにして気液界面からピペッティングし、新しい50 mlコニカル遠心チューブに移す。界面層を回収する際は、ショ糖の混入を最小限に抑えることが重要である。</li>
 <li>チューブをボルテックスし、残ったショ糖/糞便ペレット溶液を混ぜ合わせる。</li>
 <li>手順3.4および3.5を繰り返す。</li>
 <li>2つのオーシスト界面溶液の容量をddH2Oで50 mlに調整し、室温で2,000 x gで10分間遠心分離する。</li>
 <li>各チューブから上澄みを吸引し、ペレットを5 mlのTEバッファーで再懸濁させ、オーシスト懸濁液を合わせて回収する。合計の回収容量は10 mlとなる。</li>
 </ol>
4. CsCl密度勾配
<ol>
 <li>50 mlのポリカーボネート製Oak Ridgeチューブを用い、18ゲージの鈍端オートクレーブ可能スチール針を装着した50 mlシリンジと2方活栓を使用して、各層を慎重に下層へ重ねることで、不連続CsCl密度勾配を作成する。注：勾配層を容易に区別するため、溶液Bにフェノールレッドを添加している（表1）。</li>
 <li>以下の溶液を、記載された順にゆっくりとチューブに加える。このとき、流量が0.5 ml/secを超えないように注意すること。
<ol>
 <li>TE/オーシスト懸濁液試料 10 ml</li>
 <li>溶液A 8 ml</li>
 <li>溶液B 8 ml</li>
 <li>溶液C 8 ml</li>
</ol>
</li>
 <li>Oak Ridgeチューブを、4 °Cで12,000 x gにて60分間、ブレーキなしで遠心分離する。固定角ローターの使用も可能だが、高速スイングバケットローターを使用すると、チューブ側壁への糞便残渣の塗布を最小限に抑えつつ、懸濁液試料からオーシストをより良好に分離できる。塗布の程度は糞便懸濁液の組成に依存するため、糞便懸濁液が極めて汚れている場合は、CsCl密度勾配分離を2回行う必要がある。</li>
 <li>遠心分離後、溶液AとBの間にある不透明または白色のオーシスト含有バンドを回収する。糞便残渣による汚染を最小限にするため、勾配を乱さないように直接オーシストバンドまで進み、10 mlピペットを用いてオーシスト界面を回収する。回収したオーシスト界面を新しい50 mlコニカル遠心チューブに移す。洗浄ステップでのオーシストのペレット化に支障をきたす可能性があるため、オーシスト界面を回収する際に吸引されるCsCl溶液の量を最小限にするように努める。</li>
 <li>30-40 mlのddH2Oでオーシストを洗浄する。チューブを室温、2,000 x gで10分間、ブレーキなしで遠心分離する。オーシストペレットを乱さないように、上清を慎重に吸引除去する。この洗浄操作をさらに2回繰り返す。</li>
 <li>最終洗浄の終了後、上清を慎重に吸引除去し、ペレットを10 mlの2%硫酸に再懸濁して、使用時まで4 °Cで保存する。これでオーシストをさらに操作する準備が整った。オーシストの純度は、試料中に糞便残渣がないことを顕微鏡下で確認することでチェックできる。</li>
</ol>

<ol><li>Dubey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+viable+Toxoplasma+gondii+in+beef%2C+chicken%2C+and+pork+from+retail+meat+stores+in+the+United+States%3A+risk+assessment+to+consumers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Prevalence of viable Toxoplasma gondii in beef, chicken, and pork from retail meat stores in the United States: risk assessment to consumers.</a> J. Parasitol. 91, 1082-1093 (2005).</li>
<li>Tenter, A. M., Heckeroth, A. R., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+from+animals+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: from animals to humans.</a> Int. J. Parasitol. 30, 1217-1258 (2000).</li>
<li>Bowie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreak+of+toxoplasmosis+associated+with+municipal+drinking+water%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Outbreak of toxoplasmosis associated with municipal drinking water.</a> Lancet. 350, 173-177 (1997).</li>
<li>Moura, L. de <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waterborne+toxoplasmosis%2C+Brazil%2C+from+field+to+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Waterborne toxoplasmosis, Brazil, from field to gene.</a> Emerg. Infect. Dis. 12, 326-329 (2006).</li>
<li>Jones, J. L., Dubey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waterborne+toxoplasmosis+-+Recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Waterborne toxoplasmosis - Recent developments.</a> Exp. Parasitol. doi: 10.1016/j.exppara.2009.03.013, (2009).</li>
<li>Dumetre, A., Darde, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+detect+Toxoplasma+gondii+oocysts+in+environmental+samples%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">How to detect Toxoplasma gondii oocysts in environmental samples.</a> FEMS Microbiol. Rev. 27, 651-661 (2003).</li>
<li>Dumetre, A., Darde, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Toxoplasma+gondii+oocysts+by+cesium+chloride+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of Toxoplasma gondii oocysts by cesium chloride gradient.</a> J. Microbiol. Methods. 56, 427-4230 (2004).</li>
<li>Dubey, J. P. Toxoplasmosis of Animals and Man. , 2nd Edition, CRC Press, Inc. Boca Raton, FL. (2009).</li>
</ol>

高純度の取得トキソプラズマ</em不連続塩化セシウム勾配別>オーシスト

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondiiは、ヒトに広く感染する真正細胞内寄生の原虫病原体である。これは、食料や水を介して感染が広がる疾患のアウトブレイクと関連する、よく知られたアピコンプレクサ門原虫である。確定宿主はネコ科動物であり、そこで性的複製が起こり、非常に感染力が強く、環境中でも耐性を示すオーシストの発生をもたらす。感染は、汚染された肉に含まれる組織嚢子または土壌や水に存在するオーシストを経口摂取することによって起こる。健康な個体では通常無症状であるが、生涯にわたる潜伏感染となり、免疫が低下した場合には再活性化し、トキソプラズマ脳炎を引き起こして死に至る可能性がある。トキソプラズマに汚染された肉は、ヨーロッパや米国においてこれまで主な感染源であったが、動物の管理・飼育方法の改善や食品の取り扱い・加工プロセスの向上により、肉中のトキソプラズマ嚢子の有症率は著しく低下している1,2。それにもかかわらず、ヒトの血清陽転率は依然として比較的高いため、オーシストに汚染された土壌や水からの暴露が可能性として考えられる。実際、世界中で水を介したトキソプラズマ症のアウトブレイクが報告されており、環境中のオーシスト形への暴露が重大な健康リスクをもたらすという理論を裏付けている3-5。これまで、環境中におけるトキソプラズマオーシストの有症率に関する研究は、環境中のオーシストを検出するためのツールが不足しているため限られている5,6。これは主に、研究目的のために感染したネコから大量かつ高純度のトキソプラズマオーシストを効率的に精製するためのプロトコルが確立されていないことに起因している。本研究では、分子生物学的および組織培養的処理に適した、感染したネコの糞便からトキソプラズマオーシストを容易に精製する改良型CsCl法の開発について述べる7。T. gondiiヨーロッパおよびアメリカ合衆国では、これまで cyst が主な感染源であったが、最近の動物管理および畜産慣行の変化、並びに食品の取り扱いや加工手順の改善により、肉中の T. gondii cyst の有症率は著しく低下している。T. gondii肉中の嚢子1, 2. それにもかかわらず、ヒトにおける血清陽性率は依然として比較的高く、卵嚢で汚染された土壌や水からの暴露が可能性としてあることを示唆している。実際、トキソプラズマ症の水系によるアウトブレイクは世界的に報告されており、環境中の卵嚢形態への暴露が重大な健康リスクをもたらすという理論を裏付けている。3-5. これまでに、環境中の卵嚢のまん延度を理解するための研究は、環境中の卵嚢を検出するためのツールが欠如していることから、限定的であった5,6。 T. gondii水中や環境中のオーシストの存在に関する研究は、環境中のオーシストを検出するためのツールが不足しているため、限定的である5, 6。これは、多数の高純度のT gondii感染された猫からの研究用卵嚢。本研究では、感染した猫の糞便から容易にトキソプラズマ卵嚢を精製する改良型CsCl法の開発について述べる。T. gondii感染した猫の糞便から得られ、分子生物学的および組織培養的操作に適したオーシスト7.

本研究では、分子生物学的解析および組織培養操作に適した、感染猫の糞便からT. gondiiオーシストを容易に精製するための改良CsCl法の開発について述べる

Toxoplasma gondiiは、ヒトに頻繁に感染する絶対細胞内寄生性の原虫病原体である。本種は、...に関連する、十分に特性解析されたアピコンプレクサ類である。

Toxoplasma gondii のオーシストは通常、感染した猫の糞便から採取され、浮遊法を用いて単離されることで、部分的に精製された懸濁液、分子生物学的および組織培養用の試料が得られます。しかし、この寄生虫を用いた実験では、これを達成するために高度に精製されたオーシストが必要です。オーシストはさらにショ糖密度勾配遠心法を用いて精製されます。この工程では、オーシストを再懸濁し、ショ糖溶液の上に水を重ねて遠心分離を行うことで、大部分の糞便物質からオーシストを分離します。次に、osis層を塩化セシウムを敷いた新しいチューブに移し、遠心分離を行います。得られた明確なOSISバンドを回収して洗浄すれば、高純度なteon io assistを必要とする実験に使用できる状態になります。こんにちは、私は米国環境保護庁（EPA）の国立曝露研究研究所の請負業者であるDynam社の社員、サラ・スタッグス博士です。本日は、不連続塩化セシウム密度勾配を用いて、実験的に感染させたネコの糞便からToxoplasma gondii oocystを精製する手順をご紹介します。この手順は、分子生物学および組織培養実験に使用するためのoocystを単離するために、当研究室で日常的に用いられています。それでは始めましょう。Toxoplasma gondiiを扱う作業を開始する前に、重要な安全上の注意事項を考慮する必要があります。免疫不全の状態にある方、妊娠中の方、または妊娠を希望されている方は、トキソプラズマ症に感染するリスクがあり、病気や深刻な先天性異常を引き起こす可能性があるため、この病原体を扱わないでください。感染リスクを軽減するため、本手順のための専用スペースを確保し、入室前に他者に警告する標識を掲示してください。T-One IOシストを扱う際は、ラボコート、使い捨てガウン、使い捨て手袋、および適切な保護メガネまたはフェイスシールドを着用してください。手袋は頻繁に交換し、汚染された手袋で器具に触れないようにしてください。また、使い捨ての吸収性ライナーを敷いた、オートクレーブ可能な金属製トレイの上で作業することが重要です。同様に、使用予定のラック、チューブ、その他の器具が、使い捨てであるかオートクレーブ滅菌可能であることを確認してください。使い捨てではない器具を使用する場合は、使用後に1時間×2サイクルのオートクレーブ滅菌を必ず行ってください。また、真空ポンプの汚染を防ぐため、すべての真空ラインを真空シールドフィルターに接続してください。シストの分離が完了したら、作業面に新鮮な10%次亜塩素酸溶液を塗布してください。そのまま乾燥させ、その後、当該領域を水で数回すすぎます。適切な安全対策が講じられたことを確認した後、実験を進めることができます。T Guni OYSの回収に先立ち、まずスクロース、フロート、および塩化セシウム勾配に必要なすべての溶液を調製する必要があります。遠心分離の手順です。必要となる溶液には、オートクレーブで20分間のサイクルにより滅菌した2.2 molarのスクロース溶液、1リットルのTEバッファー pH 7.2、1 normalの水酸化ナトリウム溶液、2%の硫酸溶液、および比重1.15の塩化セシウムストック溶液が含まれます。1.15塩化セシウムストック溶液を用いて、塩化セシウム密度勾配の作製に使用する溶液A、B、およびCを調製します。溶液Aは、30 mLのTEに20 mLの1.15塩化セシウムストック溶液を混ぜて作製します。溶液Bは、20 mLのTEに30 mLの1.15塩化セシウムストック溶液を混ぜ、さらに12.5 µLのフェノールレッド溶液を加えて作製します。最後に、溶液Cは、10 mLのTEに40 mLの1.15塩化セシウム溶液を混ぜて作製します。まず、2%硫酸に含まれる10 milliliterのT osis糞便懸濁液を採取し、50 milliliterの円錐形遠心チューブに移して、ショ糖浮遊法の準備を開始します。糞便試料は、JP Duby博士の著書『Toxoplasmosis of Animals and Humans』に記載されているショ糖浮遊法ですでに処理済みの、感染猫の糞便を使用します。この追加ステップにより、塩化セシウム精製過程における糞便残渣の量がさらに減少するため、T goiシストの最高純度を達成することができます。次に、糞便懸濁液に1 N水酸化ナトリウム溶液を液量の5分の3量加えて、硫酸を中和します。ボルテックスミキサーで懸濁液を十分に混合します。続いて、等量のスクロースを加え、再度ボルテックスミキサーで懸濁液を十分に混合します。1匹あたり10 mLのピペットを使用し、ショ糖糞便懸濁液の上に脱イオン水を10 mL慎重に重ねます。慎重に重層させた後、チューブを遠心機にセットし、室温で1200 ×gで20分間遠心分離し、停止後のブレーキはかけません。ピペットの先端が膨らまないように注意しながら、気液界面からゆっくりとピペットで吸引し、上層の水および界面層を回収します。界面層を回収する際は、混入するスクロース層の量を最小限に抑えることが非常に重要です。これらの層を新しい50 milliliterコニカル遠心チューブに移します。チューブをボルテックスして、残りのスクロース糞便ペレット溶液を混合します。前述の水オーバーレイによる遠心分離の手順をもう一度繰り返します。遠心後、上層の水層と界面層を回収し、新しいチューブに移します。二回蒸留水を用いて、2つのオーオーシスト界面溶液の容量を50 millilitersに調整します。その後、チューブを室温で2000 ×g、10分間遠心分離します。最後に、各チューブから上清を吸引して除去します。ペレットを5 mLのTEAバッファーで再懸濁し、浸透圧懸濁液を回収します。これでosisの塩化セシウム密度勾配遠心への準備が整いました。まず、50 mLのポリカーボネート製Oak Ridgeチューブを用いて、不連続塩化セシウム勾配を作成します。18ゲージの鈍端オートクレーブ可能スチール針を装着した50 mLシリンジを使用して、TEを含むosis懸濁液10 mLをポリカーボネートチューブに加えます。2方活栓を用い、以下の溶液をチューブの底部にゆっくりと直接加えます。溶液A 8 mL、溶液B 8 mL、溶液C 8 mLの順に加えます。流量が0.5 mL/秒を超えないように注意してください。また、溶液Bに含まれるフェノールレッドは、勾配層を判別するのに役立ちます。これで、固定角高速ローターを用いて、Oak ridgeチューブを4°Cで、ブレーキなしで12,000 ×gにて60分間遠心分離する準備が整いました。遠心分離が完了したら、溶液AとBの間にある不透明な白い帯を回収します。この帯にオオクシストが含まれています。10 mLピペットを使用して、勾配を乱さないように直接オオクシストの帯まで進み、オオクシストを回収してください。シストを回収する際は、吸引する塩化セシウム溶液の量を最小限に抑えてください。塩化セシウムが過剰にあると、洗浄時のシストのペレット化が困難になる可能性があるためです。次のステップで、OSISを新しい50 milliliterコニカル遠心チューブに移します。次に、Oシストを30 to 40 millilitersの二回蒸留水で洗浄し、室温で2000 times G、10分間、ブレーキなしで遠心分離します。Oシストのペレットを乱さないよう注意しながら、上清を慎重に吸引してください。洗浄をさらに2回繰り返します。最後の洗浄が終わったら、上清を慎重に吸引し、ペレットを10 millilitersの2% sulfuric acidに再懸濁させます。顕微鏡下でOSISを確認し、サンプルからすべての糞便残渣が正常に除去されていることを確かめてください。これでOSIはさらなる操作が可能な状態になりました。また、使用するまで4°Cで保存することも可能です。ここでは、微分干渉顕微鏡を用いて400倍の倍率で観察した、精製前のOSIの状態を示します。視野内に大量の糞便汚染物質が存在しており、OSI嚢胞の同定が非常に困難であることがわかります。塩化セシウム密度勾配精製プロトコル後、400倍で観察したOISSの外観がこちらです。糞便由来の不純物が除去されていることに注目してください。以上で、不連続塩化セシウム密度勾配を用いて、実験的に感染させたネコの糞便からToxoplasma gondiiを精製する方法を説明しました。この手順を行う際は、すべての安全ガイドラインに従うこと、および塩化セシウム密度勾配を形成する際に各層を非常にゆっくりと加え、勾配を乱したり混ぜたりしないよう常に注意することが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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