Name: 遺伝子発現解析のための胚ゼブラフィッシュとcDNA合成からのRNA分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-07T16:40:00.000+00:00
Duration: 15 min 21 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ胚からの高品質RNA抽出とcDNA合成法。Triol試薬とQiagen RNEZミニキットを用いた精製により、遺伝子発現マイクロアレイ解析に適した安定したcDNAを得ることができます。

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パート1：TRIzol試薬を用いてトータルRNAの抽出 RNAを扱うときには、RNaseのない環境で動作するように非常に重要です。このようなRNAの手順でのみ使用するために予約されたピペットを持つと手順を開始する前に除染装置試薬（例えば、RNアーゼアウェイ）で作業領域をスプレーのような単純な予防策は非常に有用です。 <ol><li> 1.5mlマイクロチューブにRNAプール50ゼブラフィッシュの胚の十分な量を達成し、ピペットでできるだけ多くの水として削除する。 </li><li>すぐに胚を含んだマイクロ遠心チューブにTRIzol試薬1の250μlを加える。 TRIzol試薬はフェノールが含まれており、唯一のヒュームフードの下で使用する必要があります。 </li><li>組織が十分に中断されるまで、ペレット乳棒（約20ストローク）で胚を溶解し、ホモジナイズする。 </li><li>細胞が十分に均質化されている場合、1mlの総体積と等しくなるように750μlのTRIzol試薬を加える。 </li><li>核タンパク質複合体の完全な解離を許可するには、室温で5分間均質化した試料をインキュベートする。この段階では、サンプルはフラッシュが液体窒素で凍結し、-80℃またはプロトコルを継続することができます保存することもできます。 </li><li>クロロホルム0.2 mlを追加し続けると混合するために15秒間チューブをロックする。 </li><li> 4℃で15分間12,000 xgで遠心分離後、室温で2分間サンプルをインキュベートし、℃の</li><li>混合物は、下の赤色のフェノールクロロホルム相、中間相、そして無色の上部の水相に分離します。上部の水相は、RNAが含まれています。最上層は、TRIZOLの初期体積の約60％（約0.6 ml）を含むべきである。相間の層のいずれかを転送しないように注意しながら1 mlのピ​​ペットを使用して新しい微量遠心管に上部の水層を移す。 </li><li> RNAは0.5 mlのイソプロパノールを加える沈殿する。 </li><li>サンプルは室温で10分間座って、その後4℃で10分間、12,000 xgでサンプルを遠心分離することができます℃をRNAは、チューブの底にゲル状のペレットを形成します。 </li><li>ペレットが剥がれないように、ピペットで上清を除去し、1mlの75％エタノールでペレットを洗浄する。 4℃で5分間7,500 × gで穏やかに転倒し、遠心して、サンプルを混ぜる℃に</li><li>遠心分離後、ピペットでエタノールを除去し、10分間反転しながら、サンプルが乾燥することができます。 </li><li> RNaseフリー水100μlを添加してペレットを再懸濁し、10分間55℃でサンプルをインキュベートする。それは、RNAの水分補給を支援するためにインキュベーション中に頻繁に渦を指することをお勧めします。必要に応じて、ナノドロップND - 1000分光光度計を使用して、サンプルの質と量を確認することができますか、直接次の手順に進みます。 </li></ol>パート2：キアゲンRNeasyミニキットを使用してRNAクリーンアップキアゲン社RNeasyミニキット2は、他のメソッドから単離したRNAサンプルから汚染物質や不純物を除去するのに便利です。この手順では、β-メルカプトエタノール、エタノール、およびヌクレアーゼフリー水はキットに含まれるコンポーネントに加えて必要とされる。オプションのDNase処理は、この手順の実行中に推奨されます。 <ol><li>キットの初回使用時に、バッファのRPEは、Buffer RPEの1ボリュームに100％エタノールの4倍量を加えて調製する必要があります。 </li><li>手続きの日に、のBuffer RLTは新鮮に準備する必要があります。必要とされるのBuffer RLTの合計金額を計算する。 350μlの量は、サンプルごとに必要とされる。のBuffer RLTを準備するには、バッファの各1 mlのβ-メルカプトエタノール10μlを加える。これは、ヒュームフードの下で行われる必要があります。 </li><li>各サンプルにのBuffer RLTおよび100％エタノール250μlの350μlを加える。数回上下にピペッティングしてよく混ぜる。 </li><li>室温で1分間、8,000 xgで2 mlのコレクションチューブと遠心分離機内に配置されRNeasyカラムに、約700μlのあるべきサンプルを、転送する。 </li><li>遠心分離した後、フロースルーを捨てて、RNeasyスピンカラムにBuffer RW1 700μlを加える。 </li><li>室温で1分間、8,000 × gでサンプルを遠心し、フロースルーを捨てる。 </li><li>キアゲンのRNaseフリーDNaseキットによるDNase処理：DNase処理はオプションですが強く、最高品質のサンプルをお勧めします。 <ol style="list-style-type:upper-alpha;"><li>最初にDNase処理のキットを受け取るときには、DNアーゼは550μlヌクレアーゼフリー水を添加してのDNase Iストック溶液を準備しておく必要があります。反転によって静かに混和し、ボルテックスしないでください。ストック溶液の10μlを含む単回使用のバイアルに分注し。は、最大9ヶ月まで-20℃でストック溶液を保存することができます。融解したアリコートを必要に応じて6週間に4℃で保存することができますが、解凍後にアリコートを再凍結しないでください。 </li><li>のDNase Iインキュベーションミックスを準備するには10μlのDNase IをsにRDD 70μlのBufferを加えるサンプルあたりトクソリューション。静かに転倒し、遠心簡単にチューブ残液の形態チューブの側面を収集することによりミックス。直接RNeasyスピンカラムに80μlののDNase Iインキュベーションミックスを追加。室温で30分間DNase処理をインキュベートする。 </li></ol></li><li> DNase処理後に室温で1分間8000 × gでスピンカラムや遠心に350μlのBuffer RW1を追加します。 </li><li>遠心分離後にフロースルーを捨てて、スピンカラムに500μlのBuffer RPEを追加。室温で5分間サンプルをインキュベートする。 </li><li>室温で1分間、8,000 × gでサンプルを遠心し、フロースルーを捨てる。 </li><li>遠心分離後にスピンカラムに500μlの75％エタノールを加える。 </li><li> 8000 × gで遠心操作を繰り返しますが、室温で2分間。 </li><li>遠心分離後にフロースルーを捨てて、列が5分間乾燥させます。 </li><li>すぐにエタノールの痕跡を介して任意の左を削除するには、室温で5分間8000 × gで遠心。 </li><li>遠心分離が完了したら新しい1.5 mlのコレクションチューブにスピンカラムを移し、10μlのヌクレアーゼフリー水を加える。 1分間インキュベートし、次いで室温で1分間10,000 × gで遠心。 RNAはフロースルーになります。 </li><li>スピンカラムにヌクレアーゼフリー水のさらに10μlを加え、室温で1分間インキュベートする。室温で1分間、10,000 × gでサンプルを遠心分離します。 </li><li>遠心分離後にスピンカラムを削除し、破棄する。 RNAはフロースルーになります。 </li><li>製造元の指示に従って光度計ND - 1000分光光度計を用いてRNAの質と量を確認してください。 </li><li>さらに、変性ゲルを実行するか、RNAの完全性をチェックするためにAgilent 2100バイオアナライザを使用してください。 </li><li> cDNA合成を行うことができるようになるまでサンプルを-80℃で保存してください。 </li></ol>パート3：インビトロジェンのSuperScriptファーストストランドシステムを使用してcDNAを合成 RNAが分解につながるアーゼによる切断を容易に発生しやすくなります。その結果、多くの遺伝子発現のプロトコルは、直接RNAから合成され、より安定したcDNA産物を使用するために開発されている。ここでは詳細インビトロジェンのSuperScriptファーストストランド合成システム3を使用して第一鎖cDNAの合成を。それぞれのcDNA合成反応は、5μgのRNAを収容することができます。 <ol><li>手続きのミックスを開始する前に、手短に各コンポーネントを遠心してください。 </li><li>表1に示すように滅菌0.5 mlのマイクロ遠心チューブにRNA /プライマー混合物を準備します。 </li><li> ℃で5分間65℃でサンプルをインキュベートする。 </li><li>直ちに10分間氷スラリーにサンプルを移す。 </li><li>サンプルは、表2に示す成分とマスターミックスを調製冷却されている間。ボリュームは、1反応あたりに表示されます。反応の合計数に応じてボリュームを調整します。 </li><li>冷却後、各RNA /プライマー混合物に、手順5で調製したマスターミックスの9μlを加える。穏やかに混合し、短時間の遠心分離によって収集。各サンプルの合計量は19μLにする必要があります。 </li><li>サーマルサイクラーで2分間42℃でサンプルをインキュベートする。 </li><li> 、各チューブにのSuperScript II RTを1μl（50ユニット）を追加ミックス、および42℃でインキュベートサーマルサイクラーで60分間。 </li><li> 70で反応を終了して℃で15分間、4℃の寒さのサンプルクラーは、手順8および9のためにプログラムすることができます。 </li><li>サンプルは4 ° Cに達した後、氷浴に反応を転送する。 </li><li>氷の上で各試験管にRNase Hを1μlを追加し、37℃で20分間インキュベート℃に総量は、現在21μlです。あなたのサンプルにRNase Hの加算は、RNAテンプレートを低下させ、唯一の一本鎖cDNA産物を残す。 </li></ol>パート4：cDNAの単離と降水量<ol><li> 1.5 mlの位相ロックゲルチューブは、cDNA産物の単離に使用されます。 2分間、12,000 xgで遠心分離によって1.5 mlの位相ロックゲルチューブを準備します。ゲルは、すべてのチューブの底になっているはず。 </li><li> 、（トリス飽和、pHを8.0にバッファリング）81.5μlのフェノール24:1クロロホルムイソアミルアルコールの81.5μL、および位相ロックゲルチューブにサンプル（21μl）を追加します。穏やかに転倒を数回混ぜる。 </li><li>室温で5分間、12,000 xgでサンプルを遠心分離します。 </li><li> cDNAは、上部の水相にする必要があります。新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに上層を移す。総量は20μlの前後となるはずです。 </li><li> 3 M NaOAc、pHが5.2の1X量を加え、穏やかに混ぜる。上部の水相の体積は20μlに等しいだった場合例えば、、あなたは3 M NaOAc、pHが5.2の2μlを追加する必要があります。 </li><li> 5 mg / mlのグリコーゲンの7μlを加え、穏やかに混合する。 </li><li>イソプロパノールの1X量を加え、穏やかに混ぜる。一般的にこれは、イソプロパノールの約30μlです。 </li><li>サンプルは、部屋のtemperaturでインキュベートすることができますその後10分間eとは、室温で20分間12,000 xgで遠心。 </li><li>小さなcDNAのペレットは、チューブの底に形成すべきである。注意深くピペットで上清を取り除く。 </li><li> 70％エタノールと反転して混合液500μlを追加。 </li><li> 5分間12,000 xgでサンプルを遠心分離します。 </li><li>遠心分離後にピペットで上清を除去し、70％エタノールで洗浄し、遠心分離を（ステップ10と11）を繰り返します。 </li><li>遠心分離後にピペットで上清を取り除く。管の両側に残っている液体がある場合、それは簡単にチューブを回転させて収集することができます。余剰な溶液を取り除き、ペレットを室温で5分間乾燥させます。 </li><li>ペレットを溶解するヌクレアーゼフリー水20μlを添加する。ペレットの水分補給のための5分間55℃でサンプルを置きます。 </li><li> cDNA産物の量と質は、製造元の指示に従って、光度計ND - 1000分光光度計を用いてチェックされます。 cDNAは-20℃で保存することができます</li></ol>代表的な結果 RNAのクリーンアップの後、高品質のトータルRNAの約15μgのは50ゼブラフィッシュの胚から期待できる。トータルRNAの品質、分光光度計、ゲル電気泳動、およびAgilent 2100バイオアナライザを評価するために使用することができます。光度計ND - 1000分光光度計は280nm（図1）の吸光度と比較して260nmの吸光度を評価するために使用することができます。 280分の260の比率は、汚染物質の存在を明らかにし、可能な限り劣化の証拠を与えることができます。 260 / 1.9から2.0までの280比率は許容範囲とみなされます。さらに、それは非常にRNAの変性ゲルはRNAの完全性を評価するために実行することをお勧めします。 RNA鎖は小さい鎖はゲルさらに下に移行して、そのサイズに基づいて分離します。非分解サンプルでは、​​2つの強力なバンドとの塗抹標本として表示されます。塗抹標本は、サイズの異なるmRNAの鎖と​​28Sと18SのrRNAのに対応するバンドの人口の結果である。 28Sのバンドは、18Sのバンド（図2）などの約二倍強にする必要があります。また、トータルRNAの完全性は、Agilent 2100バイオアナライザを用いて評価することができる。 28Sと18SのrRNAを表す2つの明確なピークは（図3）期待されています。 28Sのピークはそれぞれ、約2:1のピーク下の面積と18Sのピークよりも大きくする必要があります。二つの異なるピークが低下した試料では観察されません。劣化を示すRNAサンプルは、その後の実験的な手続きを経て実施されるべきではない。 分光光度分析は、cDNA産物の品質（図4）を評価するために使用することができます。 280分の260は、1.8前後となるはずです。トータルRNAの5μgの入力を有するcDNA反応が日常的に我々の研究室ではcDNA産物の1〜2μgのをもたらす。 <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。 RNAサンプルの光度計のスペクトル。RNAのクリーンアップの後、RNAの量と質は、光度計ND - 1000分光光度計を用いて評価することができる。高品質のトータルRNAの約15μgのは、日常的に1.9から2.0前後280分の260比で50ゼブラフィッシュ胚から得られたれる。 <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig2.jpg" alt="図2" /> 図2 RNAの変性ゲル。トータルRNAの分離の整合性を評価するために、RNAの変性ゲルを実行することができます。 28Sと18SのrRNAに対応する2つの明るいバンドとスミアが期待されている。 28Sのバンドは、18Sのバンドの約2倍強にする必要があります。 <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。バイオアナライザによるRNAサンプルのトレース。トータルRNAの分離の整合性を評価するために、サンプルも、Agilent 2100バイオアナライザで分析することができる。 28Sと18SのrRNAのに対応する2つのシャープなピークが、、目に見えるはずです。 28Sのピークはそれぞれ、約2:1のピーク下の面積と18Sのピークよりも大きくする必要があります。 <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。 cDNAサンプルの光度計のスペクトル。光度分析光度計ND - 1000とは、cDNA産物の量と質を評価するために使用することができます。 280分の260の比は、1.8前後となるはずです。トータルRNAの5 UGの入力を有するcDNA反応が日常的に我々の研究室のcDNA 1-2 UGをもたらす。 表1は、。部品cDNA合成のステップ2でRNA /プライマー混合物について追加する。 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> ボリューム </td></tr><tr><td>トータルRNA（最大5μgの） </td><td> 10μlの</td></tr><tr><td>の10mM dNTPミックス</td><td> 1μL </td></tr><tr><td>オリゴ（dT）12-18（0.5μg/μLの） </td><td> 1μL </td></tr><tr><td> DEPC処理水</td><td> μL のn </td></tr><tr><td>合計ボリューム</td><td> 10μlの</td></tr></tbody></table> cDNA合成のステップ5の表2。反応混合物。記載されているボリュームは、反応毎にあります。反応の総数については、各成分の量を増やします。 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> ボリューム </td></tr><tr><td> 10X RTバッファー</td><td> 2μlの</td></tr><tr><td> 25 mMのMgCl2を</td><td> 4μlの</td></tr><tr><td> 0.1 mMのDTT </td><td> 2μlの</td></tr><tr><td> RNAseOUT </td><td> 1μL </td></tr></tbody></table>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22TRIzol+Reagent+Manual%22">TRIzol Reagent Manual</a>. , (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22RNEasy+Mini+Handbook%22">RNEasy Mini Handbook</a>. , 4th ed, (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22SuperScript+First-Strand+Synthesis+System+for+RT-PCR%22">SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR</a>. , Version E. (2003).</li>
</ol>

著者に開示すべき利益相反はありません。

RNA分子の脆弱性は、このプロトコルを通じて忘れてはならない最も重要な考慮事項です。 RNaseフリーである滅菌装置は、常に研究室のRNaseフリーゾーンで使用する必要があります。 RNAのみの手続きに使用する実験室の一部を確保しておくと便利です。この領域は頻繁にアウェイなどRNaseなどRNアーゼ除去製品、を散布してください。 RNAサンプルは常に手袋を使用して処理し、劣化を防ぐために、氷上で保存する。 このプロトコルは、市販の試薬やキットを利用しました。また、多数の追加の試薬およびトータルRNAアイソレーションのための市場で入手可能なRNA分離キットがあります。このプロトコルに含まれる試薬及びキットは、うまく機能し、日常的に我々の研究室で高品質のRNAが得られている。 別の方法として、二本鎖cDNA合成は、代わりに、このプロトコルで実証第一鎖合成の、実行することができます。それは安定性の向上を提供するので、二本鎖cDNAは、時々望まれて​​いる。さらに、一部のプロトコルは、入力として二本鎖cDNA産物を必要とする。しかし...

<table><tbody><tr><td>グリコーゲン (5 mg/ml)</td><td>Ambion</td><td>9510</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-100</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ用ペレットペッスル</td><td>VWR international</td><td>KT749520-0090</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Light, 1.5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>2302800</td><td></td></tr><tr><td>フェノール（Tris飽和）</td><td>ロシュグループ</td><td>3117944001</td><td></td></tr><tr><td>RNAse Away</td><td>VWR international</td><td>17810-491</td><td></td></tr><tr><td>RNaseフリーDNaseセット</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNEasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript&amp;#174; RT-PCR用第一鎖合成システム</td><td>Invitrogen</td><td>11904-018</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr></tbody></table>

遺伝子発現解析のための胚ゼブラフィッシュとcdna合成からのrna分離

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

多くの重要かつ複雑な実験手順は、高品質でインタクトなRNAの入力が必要です。劣化したサンプルや不純物の存在は、下流の実験的なアプリケーションでは悲惨な結果につながることができます。それは、優れたサンプルを確保するために多数の保護及び品質管理チェックと固体のテクニックを使用するために最も重要なこと、それゆえです。ここで、我々詳細商用RNA単離キットを用いてDNAと不純物の痕跡を除去するために市販の化学変性剤とそれに続くクリーンアップを使用して全体のゼブラフィッシュの胚からトータルRNAを分離するためのプロトコル。としてRNAは、直接RNA鋳型から合成されたcDNA産物を使用するほとんどのプロトコルはアッセイの遺伝子の発現は比較的不安定で、RNアーゼによる切断を容易に発生しやすくなります。我々は、詳細手順を市販のキットを使用して、より安定したcDNA産物にRNAに変換する。これらの手順を通して、サンプルは劣化や汚染がないことを保証するために数多くの品質管理チェックがあります。これらのプロトコルの最終製品は、マイクロアレイ解析、RT - PCRまたは長期保存に適しているcDNAである。

高品質の単離は、インタクトなRNAは、多くの実験室のプロトコルで必須の工程である。ここで、我々は全体のゼブラフィッシュの胚と遺伝子発現のマイクロアレイ解析を含む様々な実験手順で、後続のアプリケーションのためのcDNA合成からのRNA抽出を示しています。

遺伝子発現解析のための胚ゼブラフィッシュとcDNA合成からのRNA分離

多くの重要かつ複雑な実験操作では、高品質で分解されていないRNAの投入が必要です。サンプルの分解や不純物の混入は、…につながる可能性があります。

RNA抽出を開始し、十分な収量を得るために、50個のゼブラフィッシュ胚をマイクロ融合チューブ入りの乳鉢に回収します。十分に均質化した後、まずTRIzol試薬とクロロホルムを用いてRNAを抽出します。その後、Qiagen RNeasy Mini Kitを用いてRNAを洗浄および精製し、今後のアプリケーションや長期保存に適した、分解されていない高品質な全RNAを得ます。RNAは、より安定したcDNA産物へと合成されます。その後、cDNAを精製し、元のRNA鋳型鎖を除去します。こんにちは、私はパデュー大学保健科学科のJennifer Freeman博士の研究室のSam Petersonです。本日は、ゼブラフィッシュの胚全体から高品質なRNAを抽出し、それをcDNA産物へと変換する方法について解説します。通常、この手順は遺伝子発現プロファイルを研究するために用いられます。それでは始めましょう。RNAを取り扱う際は、RNAが含まれていない環境で作業することが非常に重要です。RNA操作専用のピペットを用意することや、全RNAの抽出を開始する前に作業エリアにRNase除去剤をスプレーするといった簡単な予防策を講じてください。抽出作業を開始するには、ドラフトチャンバー内で、1.5 mLのマイクロ遠心チューブにゼブラフィッシュ胚を50個回収します。可能な限り水分を取り除き、直ちにフェノールを含むTRIzol試薬250 µLを添加します。ペレットペッスルを用い、組織が十分に破砕されるまで胚を約20回ストロークしてホモジナイズします。次に、750 µLのトリアゾール試薬を加え、核タンパク質複合体が完全に解離するまで室温で5分間インキュベートします。5分後、0.2 mLのクロロホルムを加え、チューブを15秒間ロッキングして混合し、サンプルを室温で2分間インキュベートした後、4 °Cで12,000 Gにて15分間遠心分離します。混合液は、下層の赤いフェノール・クロロホルム相、中間相、および上層の無色の水相に分離します。上層は約0.6 mmで、ここにRNAが含まれています。上層の水相（約0.6 mm）全体を新しいマイクロFUZEチューブに移します。この際、中間相が混入しないように注意し、RNAを沈殿させるために0.5 mLのイソプロパノールを加えて混合します。そのまま室温で10分間静置した後、サンプルを4°Cで12,000 Gにて10分間遠心分離します。RNAはゲル状のペレットを形成します。ペレットを乱さないように上澄み液を除去し、1 mLの75% ethanolを加えて穏やかに転倒混和して洗浄し、4°Cで7,500 Gにて5分間遠心分離します。遠心分離後、エタノールを除去し、チューブを逆さまにして10分間乾燥させます。100 µLのRNaseフリー水を加え、55 °Cで10分間インキュベートしてペレットを再懸濁させます。RNAの再水和を促進するため、こまめにフィンガーボルテックスを行ってください。胚からRNAを抽出したので、続いてRNAの精製とDNA除去処理を行います。RNAの精製には、Rogen RN easy mini kitを使用します。初回使用時は、ドラフトチャンバー内で、1ボリュームのバッファーRPEに4ボリュームの100% ethanolを加えてください。Buffer RLT 1 mLあたり10 µLのβ-メルカプトエタノールを加えます。次に、サンプルに350 µLのBuffer RLTと250 µLの100% ethanolを加え、ピペッティングで数回混ぜ合わせます。その後、サンプル全量を2 mL コレクションチューブにセットしたRNeasyカラムに移します。室温で8,000 ×gで1分間遠心分離し、遠心後、ろ液を捨てて、スピンカラムに700 µLのBuffer RW1を加えます。再び 8,000 G で 1 分間遠心分離し、サンプルから DA を除去するために上清を捨てます。続いて、RNA-free DNA キットを用いて DNA の処理を行います。キットを受け取った後、DNA に 550 µL のヌクレアーゼフリー水を加え、転倒混和により穏やかに混ぜ合わせます。ストック溶液を 10 µL ずつ分注して保存し、-20 °C で冷凍保存してください。70 µLのバッファーRDDを、緩やかに転倒混和させた10 µLのDNAストック溶液に加えます。短時間遠心分離した後、直接R and easyスピンカラムAに加えてください。DNA処理液を室温で30分間インキュベートします。次に、350 µLのバッファーRW1をスピンカラムに加え、室温で8,000 Gで1分間遠心分離し、ろ液を捨ててから、500 µLのバッファーRPEをスピンカラムに加えます。サンプルを室温で5分間インキュベートしてください。室温で8,000 Gにて1分間、再度遠心分離し、ろ液を廃棄した後、スピンカラムに75% ethanolを500 microliters加えます。8,000 Gで再度遠心分離を行いますが、今回は室温で2分間行います。遠心分離後、ろ液を廃棄し、直ちにカラムを5分間乾燥させます。最後に、残留したethanolを取り除くため、室温で8,000 Gにて5分間遠心分離します。次に、スピンカラムを新しい1.5 mL回収チューブに移し、10 µLのヌクレアーゼフリー水を加えて1分間インキュベートしてRNAを溶出させます。10,000 Gで1分間遠心分離します。室温において、RNAはろ液中に回収されます。さらに10 µLの水を加え、溶出操作を繰り返します。製造元の指示に従い、NanoDrop ND 1000分光光度計を用いてRNAの量と質を確認します。さらに、変性ゲル電気泳動を行うか、Agilent 2100バイオアナライザを使用してRNAの完全性を確認します。RNAの質と量が十分であれば、cDNA合成に進みます。最後に、cDNA合成を行うまで、RNAを-80°Cで保存します。RNAプライマーの各成分を混合し、短時間遠心分離してcDNA合成を開始します。RNA、dNTPs、およびoligo dTを混合します。各成分を滅菌済みの0.5 mLマイクロチューブに加え、合計10 µLにします。具体的な液量は、付属の書面プロトコルを参照してください。その後、サンプルを65 °Cで5分間インキュベートします。サンプルを直ちに氷冷剤に移して10分間冷却させます。その間に、付属の書面プロトコルに従い、合計9 µLのバッファーマスターミックスを調製します。冷却後、バッファーマスターミックスとRNAプライマー混合液を合わせて穏やかに混ぜ、短時間の遠心分離で回収します。次に、混合したサンプルをサーモサイクラーに入れ、42 °Cで2分間インキュベートします。逆転写を開始するために、superscript two RTを1 µLチューブに加え、混合します。そのまま42 °Cで1時間インキュベートします。その後、70 °Cで15分間処理し、反応を停止させます。次に、サンプルを4 °Cまで冷却し、氷上の氷浴に移します。サンプルに1 µLのRNase Hを加え、37 °Cで20分間インキュベートします。RNase HがRNAテンプレートを分解し、一本鎖cDNA産物のみが残ります。これでcDNA合成は完了し、あとはクリーンアップと濃縮ステップを行うだけとなります。cDNA産物を単離するために、1.5 mLのPhase Lock Gelチューブを12,000 ×gで2分間遠心分離して準備します。すべてのゲルがチューブの底にあることを確認します。pH 8.0に調整したtris飽和フェノール 81.5 µL、24:1クロロホルム:イソアミルアルコール 81.5 µL、およびサンプルをphase lockゲルチューブに加え、緩やかに転倒混和を数回行います。サンプルを室温で12,000 ×g、5分間遠心分離します。cDNAは上層の水相に回収されるはずです。上層（約20 µL）を清潔な1.5 mLマイクロチューブに回収します。cDNAを沈殿させるため、pH 5.2の3 M 酢酸ナトリウムを2 µL加え、穏やかに混合します。5 mg/mL のグリコーゲンを7 µL加え、穏やかに混合します。次に、30 µLのイソプロパノールを加えて静かに混ぜ合わせ、サンプルを室温で10分間インキュベートします。その後、室温で12,000 Gにて20分間遠心分離します。遠心分離後、チューブの底に小さなCDNAペレットが現れます。ピペットを用いて上清を慎重に除去します。70% ethanolを500 µL加えてペレットを洗浄し、転倒混和します。サンプルを12,000 Gで5分間遠心分離します。遠心分離後、ピペットで上清を除去します。洗浄を繰り返し、エタノールを加えて遠心分離し、上清を除去します。2回目の洗浄後、チューブを短時間遠心して残っている液体を集めます。余分な液体を除去し、ペレットを室温で5分間乾燥させます。次に、ペレットを再水和させるために、ヌクレアーゼフリー水を20 µL加えます。サンプルを55 °Cで5分間保持します。再水和後のCD NAは-20 °Cで保存可能です。最後に、製造元の指示に従い、NanoDrop ND 1000 分光光度計を用いて cDNA 産物の量と質を確認します。50 個のゼブラフィッシュ胚から RNA を抽出および精製すると、通常、NanoDrop ND 1000 分光光度計で評価して約 15 µg の高品質な全 RNA が得られ、260/280 吸光度比は約 1.9 から 2.0 となります。抽出した RNA の完全性は、変性 RNA ゲルを用いて評価します。RNA は、18S および 28S リボソーム RNA に対応する 2 本の明るいバンドを伴うスメアとして現れます。28 S バンドの強度は、18 S バンドの約2倍である必要があります。あるいは、Agilent 2100 バイオアナライザーを用いて RNA の完全性を評価します。18 S および 28 S リボソーム RNA に対応する2つの鋭いピークが確認されます。28 sのピークは18 sのピークよりも大きくなければなりません。5 µgの全RNAを逆転写させると、NanoDrop ND 1000による測定で通常1〜2 µgのcDNAが得られます。cDNAの260/280吸光度比は約1.8です。ゼブラフィッシュ胚全体から全RNAを単離し、そのRNAをcDNA産物へと変換する方法について説明しました。この手順を行う際は、RNaseのない環境を維持することが重要です。以上で終了です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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