のためのメゾスコピック蛍光トモグラフィー生体内イメージングショウジョウバエ

ショウジョウバエ・メラノガスター内の発達中の器官の再構築を行うためには、蛹自体の内部での光の伝播を最もよく表すフォワードモデルを決定する必要があります。この手順は、白い前蛹を選択し、ポッパの前後軸がチューブと平行になるように毛細血管チューブの端に接着することから始まります。小さな毛細管に蛍光染料を充填し、瞳孔ケースに挿入します。

慎重に軸を調整した後、蛹を360度回転させます。画像はさまざまな角度で取得されます。取得した蛍光透過照明データは、臓器の発達を画像化するために使用される前方モデルを決定するために使用されます。

こんにちは、私の名前はクラウディアで、ハーバード大学医学部のマサチューセッツ総合病院のアシスタンスバイオロジーセンターにいます。ハーバード大学医学部パラマウント研究所のウラ・ペトゥと、ミュンヘン工科大学およびミュンヘン・ヘリマン・センター・バイオロジカル・イメージング研究所のダニエル・ロザンスキーです。今日は、Oph Melano Castaで全身を3次元復元する手順をご紹介します。

私たちの研究室では、この手順を使用して、瞳孔期の臓器の発達をin vivoで視覚化します。それでは、始める前に始めましょう。このビデオの前に視聴すべきビデオは付属していませんので、光学プロジェクション断層撮影の技術的な側面については、ここよりも詳しく説明しています。

さらに、もう1つのビデオでは、より大きな動物の調製された組織や臓器のイメージングについて説明しています。このビデオで取り上げているすべての実験では、フォージショウジョウバエの導入遺伝子が使用されます。それらは、唾液腺で発現するEL A gal four、成虫の翼と胸部の幼虫前駆組織で発現するApteris gal four、蛍光タンパク質を作る導入遺伝子です。

U-A-S-G-F-Pと呼ばれるgal 4および白色1118に応答して、UAS導入遺伝子を有する非蛍光対照雄は、GAL4導入遺伝子を有する処女雌に交配されて組織を達成する。GFPクロスの特異的発現は、パン酵母を振りかけた標準的なフライ培地上に8〜10人の処女女性と男性から設定されます。表面では、バイアルは摂氏25度で加湿インキュベーターに収納され、12時間の明るい暗いサイクルの下で保管されます。

交配の開始から2日後、両親は新鮮なバイアルに移され、5〜6日後にPUIはバイアルに白いPrepUを装着し始めます。私は蛍光解剖スコープ下でのGFP発現に選ばれました。白いプレプイを選択すると、動物は約1時間白いままであるため、動物の適切なステージングが保証されます。

瞳孔形成後、彼らは色素沈着または茶色がかった色になります。puiを発現するGFPは、濡れた絵筆を使用してバイアルから穏やかに収集され、ペトリ皿の水またはPBSの滴に入れられ、購入する必要があります自己蛍光材料をきれいに拭き取る必要があります。絵筆を使用して、断層撮影の準備が整いました。

もし PrepU 正しい発達段階に到達するために老化を続ける必要がある場合は、濡れたペーパータオルと一緒にペトリ皿に入れるか、清潔な食品バイアルに入れておくことができます。これにより、イメージングに十分な湿度と適切な現像が確保されます。PrepUは、直径800ミクロンのガラスキャピラリーチューブの内部に接着する必要があります。

瞳孔の後端を瞬間接着剤で塗り、ハエの前方後方アクセスがチューブと平行になるように、前蛹の接着面をチューブに向けます。動物の前部は毛細管に張り出します。これで、キャピラリーチューブが顕微鏡の回転ステージに固定されました。

垂直位置で、回転ステージの傾斜軸を調整して、チューブの回転軸がイメージングCCDのピクセル列と平行になるようにします。フライの位置をいじった状態で、イメージングを進めます。この例では、蛍光唾液腺を有する動物をophに画像化し、その唾液腺においてGFPを発現させるのは、EAG 4とU-A-S-G-F-Pストックとの間の交配から生成することができる。

まず、装着した蛹前蛹から始め、励起ビームで蛹前を照射し、GFP蛍光シグナルを収集します。トランスイルミネーションでは、PrepUを垂直軸に沿って360度回転させ、トランスイルミネーション画像を取得します。各画像は 10 度の回転に対応します。

総取得時間は、蛍光の量と励起ビームの強度によって異なります。一般的な時間は1分程度です。この例では、翼の虚円板にGFPを発現するDSOの蛹を画像化します。

この蛹は、Aus GAL 4とU-A-S-G-F-Pストックの間の交配のバイアルから収集できます。前蛹は前述のように取り付けられます。ただし、この実験のイメージング時間は約8時間であるため、環境が湿度が高く、室温に保たれることが重要です 動物の脱水や死亡を避けるために、励起ビームにシャッターを配置して、目的の組織の花の四つん這いの消光を防ぎ、動物が以前のようにレーザービームによって火傷しないようにします。 励起ビームで照射し、トランス照明によりGFP蛍光シグナルを収集します。

前蛹はその垂直軸に沿って完全に回転します。データ収集中、回転はわずか 1 分で、異なる時間間隔で繰り返されます。開発中の翼のタイムラプス画像シリーズを作成するには、1時間あたり100枚の画像の割合で少なくとも6時間データを取得できます。

危害や写真の漂白を防ぐために、このシャッターで総光量を制御することが重要です。この動画は、PrepUステージと瞳孔頭部嫌悪感の間で取得した画像を示しています。3次元画像を再構築する際には、拡散では近似できない強い前方散乱を考慮する必要があります。

したがって、再構成を光伝搬の前方散乱モデルにするには、簡単にするために、吸収を無視します。散乱量は実験的にテストされています。これを行うには、標準化された蛍光を有する異物を非蛍光白色1118 pre pupaに挿入し、次いでこれをスキャンしてフォワードモデルデータを生成するために、100ミクロンのシリカ毛細管にPS 5.5蛍光色素を充填することから始まる。

毛細管現象を使用して、毛細管を前軸に対して45度の角度で蛹に押し込み、PrepUを毛細管に取り付けて、前述のように回転ステージに適切に配置します。次に、低開口レンズを備えた励起レーザービームで蛹前を照らし、蛹前の蛍光透過照明画像を収集します。前述のように、MATLABソフトウェアを使用してデータを明示的な理論順方向モデルに適合させます 再構成プロセスを容易にするために、前方散乱領域を記述し、実験データにも適合するため、輸送方程式の確固たる近似が選択されます。

正しい前方モデルを決定したら、唾液腺を再構築し、タイムラプス断層撮影の再構築を取得できます。フリー・スペース・トモグラフィーを使用する予定の場合は、索引マッチングの構成アルゴリズムもセットアップできます。まず、開発初期の唾液腺の3D再構築を示します。

比較のために、唾液腺の組織学的染色は、再構成が組織学とよく相関していることを示しています。この翅の想像円盤の現像のタイムラプス動画は、1つの生きた標本から撮影したものです。比較のために、同じ時点における翼板の組織学的染色は、再構成が組織型とよく相関していることを示しています。

oph内の3次元構造をin vivoで、および経時的にイメージングするシステムを構築する方法を示しました。これにより、私たち、ショウジョウバエの形態形成を追跡し、6時間連続して翼の発達を追跡することができます。この手順を実行するときは、ショウジョウバエ内の光伝搬に適したフォワードモデルを選択することが重要です。

この方法は、組織学的手法と組み合わせて使用 して、眼球瞳孔期の臓器発達に光を当てることができ、同様のサイズのさまざまな生物の研究に変更を加えることができます。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。