のためのメゾスコピック蛍光トモグラフィー生体内イメージングショウジョウバエ

Drosophila melanogasterの発達中の器官を再構成するために、蛹内部における光の伝搬を最適に記述する前方モデルを決定する必要があります。まず、白色の前蛹を選択し、蛹の前後の軸がキャピラリーチューブと平行になるようにチューブの末端に接着します。次に、少量の蛍光染料を満たした小さなキャピラリーチューブを蛹のケース内に挿入します。

慎重に軸調整を行った後、蛹を360度回転させます。異なる角度から画像を撮影します。得られた蛍光透過照明データを用いて、器官の発達をイメージングするための順方向モデルを決定します。

こんにちは。私はマサチューセッツ総合病院ハーバード医学部、アシスタンスバイオロジーセンターのClaudiaです。私はハーバード医学部パラマウントラボのUla Petouです。そして私はミュンヘン工科大学およびヘリマンセンター・ミュンヘンの生物医学イメージング研究所のDaniel Rozanskiです。本日は、Oph Melano Castaの全身を3次元再構築する手順をご紹介します。

当研究室では、瞳孔の状態における器官の発達をin vivoで可視化するためにこの手順を用いています。それでは始めていきましょう。開始する前に、光学投影トモグラフィーの技術的な側面について、本ビデオよりも詳細に解説した、事前に視聴すべき付随ビデオは存在しないことにご注意ください。

さらに、もう一方のビデオでは、調製した大型動物の組織または器官のイメージングについて説明します。このビデオで扱うすべての実験では、ショウジョウバエのトランスジェニック系統を使用します。具体的には、唾液腺で発現する EL A gal four、成虫の翅および胸部の幼虫前駆組織で発現する apteris gal four、および蛍光タンパク質を発現させるトランスジーンを使用します。

gal4駆動のUAS-GFPおよびwhite 1118系統を用い、UASトランスジェンを保持する非蛍光コントロール雄を、組織特異的なGFP発現を実現するためにGAL4トランスジェンを保持する処女雌と交配させます。交配は、少量のパン酵母を散布した標準的なショウジョウバエ培地を用い、8〜10匹の処女雌と雄で設定します。バイアルは、12時間の明暗サイクル条件下、加湿された25 °Cのインキュベーター内で管理します。

交配開始の2日後、親を新しいバイアルに移します。その5〜6日後から、PUIがPrepUを伴ってバイアル内に定着し始めます。蛍光解剖顕微鏡を用いて、GFP発現に基づき個体を選択します。白いpre PUIを選択することで、それらが約1時間白く留まるため、動物の適切なステージングが可能になります。

蛹化後、それらは色素沈着し、茶色になります。GFPを発現している蛹を、濡らした絵筆を用いてバイアルから慎重に回収し、ペトリ皿の中の水またはPBSの滴に置きます。この際、自発蛍光物質が付着していないよう、絵筆で綺麗に拭き取らなければなりません。絵筆を用いて配置した後、トモグラフィーイメージングが可能な状態となります。

PrepUを適切な発生段階までさらに成熟させる必要がある場合は、濡らしたペーパータオルを入れたペトリ皿内、または清潔なフードバイアル内に保管してください。これにより、イメージングに必要な十分な湿度と適切な発育が確保されます。PrepUは、直径800 micronのガラスキャピラリーチューブの内壁に付着させる必要があります。

前蛹の後端にシアノアクリレート系接着剤を塗り、ハエの前後の軸がチューブと平行になるように、接着面を下にしてチューブ内に入れます。動物の前端部分はキャピラリーチューブから外側に突き出した状態になります。これで、キャピラリーチューブを顕微鏡の回転ステージに固定します。

垂直方向において、回転ステージの傾斜軸を調整し、チューブの回転軸が撮像用CCDのピクセル列と平行になるようにします。フライの位置を微調整した後、撮像に進みます。この例では、唾液腺に蛍光を発する個体を撮像します。唾液腺にGFPを発現する個体は、EAG fourとU-A-S-G-F-Pのストックを交配させることで得られます。

まず、固定した前蛹を準備し、励起光を照射してGFP蛍光信号を収集します。透過照明下で、前蛹を垂直軸に沿って360度回転させ、透過照明画像を撮影します。各画像は10度の回転に対応しています。

総取得時間は、蛍光量および励起ビームの強度に依存します。一般的な所要時間は1分程度です。この例では、翅の成虫原基にGFPを発現させたDSO蛹のイメージングを行います。

この蛹は、Aus GAL fourとU-A-S-G-F-P系統の交配によって得られたバイアルから採取できます。前蛹は、既述の方法で固定します。ただし、本実験のイメージング時間は約8時間であるため、動物の脱水と死を防ぐために、環境を室温に保ち、湿度を維持することが極めて重要です。目的組織における蛍光の消光を防ぎ、またレーザービームによる動物の焼損を避けるため、励起ビームにシャッターを設置します。前述の通り、励起ビームで照射し、透過照明によってGFP蛍光信号を収集します。

前蛹を垂直軸に沿って完全に回転させます。データ収集時の回転時間はわずか1分であり、異なる時間間隔で繰り返し行います。発生過程における翅のタイムラプス画像シリーズを作成するためには、1時間あたり100枚の割合で、少なくとも6時間データを取得します。

損傷や光退色を防ぐため、このシャッターで全光露光量を制御することが極めて重要です。この動画では、PrepU段階から瞳孔頭部回避までの間に取得した画像を示しています。三次元画像を再構成する際、拡散では近似できない強力な前方散乱が発生するため、これを考慮に入れる必要があります。

再構築を行うには、光伝搬の前方散乱モデルを決定する必要があります。簡略化のため、吸収は無視します。散乱量は実験的に検証します。そのために、標準的な蛍光を持つ異物を、非蛍光の白い1118前蛹に挿入し、それをスキャンして前方モデルデータを生成します。まず、100 µmのシリカキャピラリーチューブにPS 5.5蛍光染料を満たすことから始めてください。

毛細管現象を利用して、前軸に対して45度の角度で毛細管を蛹に挿入し、PrepUを毛細管に固定して、前述のように回転ステージ上の適切な位置に配置します。次に、低開口数レンズを用いて励起レーザービームで前蛹を照射し、前蛹の蛍光透過照明画像を収集します。前述の通り、MATLABソフトウェアを使用してデータを明示的な理論的フォワードモデルに適合させます。再構成プロセスを容易にするため、前方散乱領域を記述し、かつ実験データにも適合する輸送方程式の拡散近似を選択します。

適切なフォワードモデルを決定した後、唾液腺を再構成し、タイムラプス断層撮影再構成画像を得ることができます。フリースペース断層撮影を使用する場合は、屈折率整合のための構成アルゴリズムを設定することも可能です。まず、発生初期の唾液腺の3D再構成を示します。

比較のため、唾液腺の組織学的染色を行うと、再構成結果が組織像とよく一致していることがわかります。この翅の成虫原基の発達に関するタイムラプス動画は、単一の生体標本から取得したものです。比較のため、同時点の翅原基の組織学的染色を行うと、再構成結果が組織像とよく一致していることがわかります。

これまで、ショウジョウバエの生体内で三次元構造を時間経過とともにイメージングするためのシステムの構築方法について説明しました。これにより、ショウジョウバエの形態形成を追跡し、6時間連続して翼の発達を観察することが可能になります。この手順を行う際は、ショウジョウバエ体内における光伝播の適切な前方モデルを選択することが極めて重要です。

この手法は、組織学的技法と組み合わせて用いることで、眼の瞳孔段階における器官形成の解明に寄与させることができ、また、同程度のサイズを持つ異なる生物の研究に向けて修正して適用することも可能です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。