Name: のためのメゾスコピック蛍光トモグラフィー生体内イメージングショウジョウバエ /em (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: 学ぶメゾスコピック蛍光トモグラフィーを用いたDrosophila melanogasterの生体内3Dイメージング。多投影照明と光子輸送モデルにより、従来の蛍光顕微鏡の限界を超えて器官発生を可視化する手法です。

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C. Vinegoniは衛生研究所（NIH）助成1 - RO1 - EB006432の国立研究所からの支援を認めている。

この実験で使用されているキイロショウジョウバエの株式は、次のとおりです。 <ul style="list-style-type:none;"><li> elav - GAL4（FBti0002575） </li><li> AP - Gal4md544（FBal0051787） </li><li> UAS - srcEGFP（FBti0013990） </li><li> w1118（FBal0018186） </li></ul>すべての実験のために、UAS - Gal4のシステムは、目的の組織（すなわち、唾液腺やウィングディスク）にGFPを過剰発現するために使用された。具体的には、適切なGal4のトランスジェニック雌のショウジョウバエは、UAS - EGFPトランスジェニック仲間に交配した。十字架は、加湿インキュベーターで25℃で飼育した。蛹は、バイアルを（クロスの開始後約5-6日）の移入を開始するとき、彼らは白い蛹になる前の段階（蛹殻の形成後に0〜1時間）でGFP蛍光のために選択し、断層イメージングのために収集された。 <ol><li> 25℃で適切な十字架とリアを設定します° C </li><li> 5-6日クロスの開始後、イメージングのための蛍光子孫を選択します。バイアルの側面から白いprepupaeの穏やかな除去のためのウェット絵筆を使用してください。 </li><li>食品の粒子や蛹のケースをカバーし、試料の自家蛍光なる接着剤を除去するために、ペトリ皿に入れ、水またはPBSのドロップでprepupaeを置く。絵筆で優しくきれい。蛹のエージングが必要な場合、場所はぬれたペーパータオル（湿度の高いチャンバー）とやフライの食べ物ときれいな瓶の側面のペトリ皿に白いprepupaeを選択。これは、動物の適正な発展を可能にするために、十分な湿度があることを保証します。 </li></ol> ショウジョウバエ取り付け<ol><li>接着剤キャピラリーガラス管（800ミクロンの直径）フライの前方/後方の軸がチューブに平行に配向しているように、蛹のケースの底部分。 </li><li>回転ステージ上に垂直にキャピラリーチューブを修正。 </li><li>イメージングCCDのピクセル列に平行に回転軸の順番で回転ステージの傾斜軸を調整します。 </li></ol>決定フォワードモデル<ol><li>ガラスキャピラリーで蛹を修正し、前に説明したようにマウントします。 </li><li>蛍光色素（Cy5.5）とシリカキャピラリーチューブ（100ミクロン、OD）を埋める</li><li>前部/後部軸に対して45度で蛹内部毛細管を挿入</li><li>低開口数のレンズを持つ励起レーザービームで蛹を照らす。その垂直軸に沿ってさなぎを回転360度以上の蛍光透視画像を収集する。 </li><li>適切なフォワードモデルと実験データをフィットする</li></ol>イメージング唾液腺<ol><li>前に説明したように唾液腺のサナギに表現するGFPをマウントします。 </li><li>励起光を照らすと透視でその垂直軸に沿ってさなぎを回転360度以上のGFPの蛍光信号を収集する。 </li><li>フォワードモデルを利用して取得したデータを再構築</li></ol>タイムラプスイメージング<ol><li>翼成虫ディスクに白い前蛹期に発現GFPをマウントします。 </li><li>蛹の脱水を避けるために、撮影環境は蒸し暑く、室温で保管してください。 </li><li>連続的な照明を避けるためにシャッターを配置</li><li>励起光を照らすと透視でその垂直軸に沿ってさなぎを回転360度以上のGFPの蛍光信号を収集する。 </li><li>フォワードモデルを利用して取得したデータを再構築。 </li></ol>組織学<ol><li> 1X PBSで唾液腺CNS /目のディスクを解剖。 </li><li> 4％のホルムアルデヒド、室温で20分のための1X PEM（100mMのパイプ、1mMのEGTA、1mMのMgCl 2の ）で組織を固定してください。 </li><li> DAPIでVectashieldで固定し、マウントを外します（ベクトル） </li><li>蛍光顕微鏡による画像。 </li></ol>タイムラプス組織学<ol><li>白いprepupaeを収集し、湿度の高い室でそれらをステージング。 </li><li>異なる発達段階で蛹を集める</li><li>固定前に細い針（虫ピン000、FST）で2回刺す蛹のケースを（蛹殻形成後0時間）。 </li><li> 8％のホルムアルデヒド、穏やかに撹拌しながら室温で6〜8時間のための1X PEMのサナギを修正。 </li><li>固定の除去と1 × PBSで洗浄は、2つの部分に鋭い刃と固定さなぎをカットした後/ Pの軸に垂直な; </li><li>水没イメージングのためのカバーガラスをスライド上にDAPI（ベクトル）とマウントとVectashieldの2つの部分（ラボテック）。 </li><li>蛍光共焦点顕微鏡で画像を取得する。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1510/1510fig1thumb.jpg" alt="図1" border="0" /> 図1：してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1510/1510fig1.jpg">ここをクリックして</a>アルを参照して図1のargerのバージョン。

<ol><li>Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+and+listening+to+light%3A+the+evolution+of+whole-body+photonic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging.</a> Nat. Biotechnol. 23, 313-320 (2005).</li>
<li>J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography+as+a+tool+for+3D+microscopy+and+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies.</a> Science. 296, 541-545 (2002).</li>
<li>Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).</li>
<li>Vinegoni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+Drosophila+melanogaster+pupae+with+mesoscopic+fluorescence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography.</a> Nat. Methods. 5, 45-47 (2008).</li>
</ol>

著者らに開示すべき事項はありません。

蛹のケースとGFP発現D.の唾液腺をの生体内再構成対応する組織学（青、DAPI染色、緑、GFP蛍光）とキイロ前蛹（スケールバー、500ミクロン）を図1（a）に示されています。 D.のタイムラプスシリーズイメージングキイロ翼成虫ディスクは、図1（b）に示されています。画像は、4つの異なる時点（0,3.0、3.5、および6.5時間）で、単一のライブ試料から取得されています。最初の列でさなぎの背ビューに対して0度で1投影が表示されます。番目の列で再構成は赤線で示されたセクションに対応しています。最後に、組織との比較は、番目の列に示されている。明らかに、組織学的製剤には断層の再構成とよく相関する。 ショウジョウバエの蛹のケースとGFP発現唾液腺の（c）は平面の画像で。

のためのメゾスコピック蛍光トモグラフィー生体内</em開発の>イメージングショウジョウバエ</em

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

開発器官形成だけでなく、病気のprogessionと治療を可視化することは、しばしば大きく光学的に無傷の生体内の分子および機能的変化を調べるために能力に依存しています。ほとんどの既存の光イメージング法は、現代の光学顕微鏡の浸透の制限（0.5〜1mm）および光学肉眼検査の普及に課したの範囲の間にある次元のイメージングには不十分である（&gt; 1CM）[1]。従って、多くの重要なモデル生物、例えば昆虫、動物の胚または小動物の四肢は、生体内光学イメージングのためのアクセス不能のまま。 ナノメートル分解能の光学的イメージング法の開発に向けて関心が高まっているものの、イメージング侵入深さの改善に多くの成功の努力がなされていない。顕微鏡の限界を越えて生体内イメージングを実行する能力は、組織に存在する光子散乱に伴う困難と会ったという事実にあります。たとえば、画像全体の胚への最近の取り組み[2,3]は、散乱からのみ事後イメージングに適し作成する検査法を、それらをクリアするには、標本の特殊化学処理を必要とする。これらのメソッドは、しかし、特に発生生物学や創薬で、通常は二光子または共焦点顕微鏡で許可されているものより画像大きい標本の必要性を証拠。 我々は、メゾスコピック蛍光トモグラフィーという名前の新しい光学的イメージング技術を開発した[4]、1mmの5mmの大きさで、非侵襲的な生体内イメージングに適している。メソッドの交換の侵入深さの解像度が、前例のない断層像性能を提供し、それが画像の蛍光進化する能力を付与することにより発生生物学の観測（そしておそらく生物学的研究の他の地域）における新たな次元として時間を追加するために開発されている時間をかけて応答をタグ付け。そのようなものですから、遺伝子の突然変異または外部からの刺激に対する形態学的または機能的な依存関係の研究を加速することができ、重要なのは、同じ、開発生物の長手方向の経時的可視化を可能にすることにより、開発や組織機能の全体像をキャプチャすることができます。 技術は360度の投影でデータを収集するように変更実験室の顕微鏡とマルチプロジェクション照明を利用しています。それは、メゾスコピック範囲に適した現実的な反転のスキームを構築するために幾何光学の原理と組み合わせ光子輸送方程式のフォッカープランク液にフェルミの簡素化を適用します。これは、最大サイズは数mmまでの試料での非透過的な三次元構造の全身の可視化、生体内で可能です。 我々は、生体内で、6時間連続して上でリアルタイムに不透明なショウジョウバエ蛹の翼の形態形成に従うことによってショウジョウバエの組織を開発するの画像三次元構造により、技術の生体内の性能を実証している。

メゾスコピック蛍光トモグラフィは、組織切片の蛍光顕微鏡の浸透の制限を越えて動作します。技術は、マルチプロジェクション照明と光子輸送記述に基づいています。我々は、生体内でのGFP発現翼成虫ディスクの形態形成の全身3次元可視化を実証<em&gt;キイロショウジョウバエ。</em

発生中の器官形成や、疾患の進行および治療を可視化することは、多くの場合、光学的な解析能力に大きく依存しています...

Drosophila melanogasterの発生中の器官の再構成を行うには、蛹の内部における光の伝搬を最も適切に記述する前方モデルを決定する必要があります。まず、白色の前蛹を選択し、蛹の前後の軸がキャピラリーチューブと平行になるようにチューブの端に接着します。少量の蛍光色素を満たした小さなキャピラリーチューブを、蛹の殻の中に挿入します。慎重に軸調整を行った後、蛹を360度回転させます。異なる角度で画像を収集します。取得した蛍光透過照明データを用いて、器官の発達をイメージングするためのフォワードモデルを決定します。こんにちは、私はマサチューセッツ総合病院ハーバード医学部、センター・フォー・アシスタンス・バイオロジーのClaudiaです。ハーバード医学部パラマウント研究室のUla Petouです。そして、ミュンヘン工科大学およびヘリマンセンター・ミュンヘンの生物医学イメージング研究所のDaniel Rozanskiです。本日は、Oph Melano Castaの全身を3次元再構成する手順をご紹介します。当研究室では、蛹の状態における器官の発達をin vivoで可視化するためにこの手順を用いています。それでは始めていきましょう。開始する前に、光学投影トモグラフィーの技術的な詳細について、本動画よりも詳しく説明した、事前に視聴すべき付随動画は存在しませんのでご注意ください。さらに、別のビデオでは、作製した大型動物の組織または器官のイメージングについて解説しています。このビデオで扱うすべての実験では、ショウジョウバエのトランスジェニック系統を使用します。それらは、唾液腺で発現するEL A gal four、成虫の翅および胸部の幼虫前駆組織で発現するapteris gal four、そして蛍光タンパク質を生成するトランスジーンです。gal4駆動のUAS-GFPおよびwhite 1118を保持し、蛍光を発しないコントロール雄（UASトランスジェン保持）を、GAL4トランスジェンを保持する処女雌と交配させ、組織特異的なGFP発現を実現させます。交配は、少量のパン酵母を散布した標準ハエ培地を用いて、8〜10匹の処女雌と雄で行います。バイアルは、12時間明暗サイクルの加湿インキュベーター内、25 °Cで維持します。交配開始の2日後、親個体を新しいバイアルに移します。その後5〜6日が経過すると、PUIがPrepUとともにバイアル内に現れ始めます。蛍光解剖顕微鏡下で、GFP発現個体を選択します。白いpre PUIを選択することで、個体が約1時間の間白いままであるため、動物の正確なステージングが可能になります。蛹化の後、それらは色素沈着し、茶色になります。GFPを発現している蛹を濡れた筆を用いてバイアルから慎重に回収し、ペトリ皿内の水またはPBSの一滴の中に置きます。この際、自家

mesoscopic-fluorescence-tomography-for-vivo-imaging-developing

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Biology

生物学

ショウジョウバエの血球は胚の全体にわたって分散させる。このプロトコルは、蛍光標識した血球で胚を使用してこれらの移行をマウントし、イメージする方法を示します。...

のライブイメージングキイロショウジョウバエ胚性血球移行

ソース: Hellerman, M. B., et al. Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye. J. Vis. Exp.

蛍光顕微鏡法を用いたショウジョウバエの蛹眼のライブイメージング

トマト/ GFP-FLP / FRT法は、ショウジョウバエの生活にモザイク視細胞を可視化することを含む。これは、数日または数週間の網膜における光受容体の個々の細胞の運命を追跡するために使用することができる。この方法は、網膜変性および神経変性疾患または光受容細胞の発生の研究に最適です。...

モザイク大人のライブイメージングのためのトマト/ GFP-FLP / FRT方法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;視細胞

本論文では、直接蛹殻を介して画像細胞挙動への高速走査型共焦点顕微鏡を使用する方法を示します。そのまま蛹ケースを残すことによって、このメソッドを直接学ぶことは困難であるショウジョウバエの発生段階で動的な細胞プロセスの観察と測定を可能にします。...

の蛹ケースを画像化<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

免疫染色は、組織内の特定の細胞タイプやタンパク質を可視化するための効果的な技術です。超音波処理を利用することにより、ここに記載されているプロトコルは、免疫染色の前に後期胚および幼虫からショウジョウバエ・メラノガスター組織を解剖する必要性を軽減する。私たちは、ホルムアルデヒド固定全マウント幼虫の免疫染色のための効率的な方法を提供します。...

後期胚および幼虫の超音波処理により促進免疫蛍光染色<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;組織<em&gt;その場で</em

このプロトコルは、生きたショウジョウバエの蛹の眼神経上皮をイメージングするための効率的な方法を提供します。この方法は、組織の動きと不均一なトポロジーを補正し、複数のGFPタグ付き接合タンパク質を使用して細胞境界の視覚化を強化し、簡単に組み立てられるイメージングリグを使用します。...

のライブイメージングショウジョウバエ蛹アイ

ここで我々 は説明の幼虫が 3...

生体内で1 分子追跡ショウジョウバエ運動神経がシナプス前ターミナルで

マイクロコンピュータ断層撮影を用いた開発のあらゆる段階で、無傷の ショウジョウジョウバエメラノガスター...

微小断層撮影による ショウジョウバエメラノガスター の動物全体イメージング

光シートベースの蛍光顕微鏡は、発生生物学において最も価値のあるツールです。比較研究の大きな問題は、周囲分散です。我々のプロトコルは、複数の標本の同時ライブイメージングのための実験的なフレームワークを記述し、したがって、この問題に積極的に取り組む。...

サンプルチャンバーベースの光シート蛍光顕微鏡における複数の昆虫胚の同時ライブイメージング

初期のショウジョウバエの胚では、多くの細胞小器官は運動性である。原則として、それらは特定の蛍光プローブを介して生きたまま画像化することができるが、卵殻は胚への直接適用を妨げる。このプロトコルは、マイクロインジェクションを介してそのようなプローブを導入し、次いで粒子画像速度測定を介してバルクオルガネラ運動を分析する方法を記述している。...

ショウジョウバエ胚における脂質含有細胞小器官の細胞骨格依存性トラフィッキングの可視化

ここでは、ショウ ジョウバエ...

拡大顕微鏡を用いたショウ ジョウバエ の胚全体拡大による超解像イメージング

学ぶメゾスコピック蛍光トモグラフィーを用いたDrosophila melanogasterの生体内3Dイメージング。多投影照明と光子輸送モデルにより、従来の蛍光顕微鏡の限界を超えて器官発生を可視化する手法です。

のためのメゾスコピック蛍光トモグラフィー生体内イメージングショウジョウバエ

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