Name: マウスES胚細胞の単離と導出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 1 s
Description: 学ぶマウス胚から原始生殖細胞を単離する手法。生殖発生学と不妊症・がん研究への応用を理解し、発生段階10.5～11.5日の性腺隆起から細胞を採取・培養する技術を習得する。

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;博士ルーシーセンター、博士ブリジットウィルフォードとMSU ALAC認定マウスの施設での研修や動物のケアと支援のためのマイクBasett、博士ドウェインワイズ博士ニールまず、原稿編集のためKourtneyウィルキンソン：著者はの非常に貴重な助けに感謝セザールモンロイ、ハンナスウォープ、およびMSUのビデオ制作とその支援のためのボビーハドルストン、顕微鏡と画像キャプチャと彼の支援のための。この研究は、インスティテューショナルリサーチとミシシッピ州立大学で生物科学科のオフィスによって資金を供給された。

パート1：妊娠中のマウスの開腹<ol><li>頸椎脱臼を使用して、10.5から11.5 DPCで妊娠C57BL6J雌マウスを安楽死させる。 </li><li>その後抗菌石鹸で腹部をきれいに、そして、それを剃る。 </li><li>シェービング後は、生理食塩水で腹部を洗う。 </li><li>その後、滅菌ガーゼで腹部を乾かします。 </li><li>新しい滅菌フィールドでマウスをカバー。 </li><li>鉗子と解剖鋏を使用して腹側切開を行います。 </li><li>腹腔からの全体の子宮を識別し、削除。マウスの胚は子宮内部に表示されます。 </li><li> D - PBSで満たしたシャーレに子宮を転送し、それを氷上で保管してください。 </li><li>滅菌メスや鉗子を用いて、胎盤及び各胚の余分な胚組織を削除します。 </li><li> D - PBSで満たされた新鮮なシャーレに胚を移す。 </li><li>マウス胚の長さを測定します。我々は、サイズが胚の年齢に応じて異なることがわかった。例8.5のDPCは、16mmの平均で測定さ11mmの12.5 DPCの平均で測定さ6mmの10.5 DPCの平均で測定。 </li><li>その後、DNA抽出のための彼らの尾を取り除く。 </li></ol>パート2：生殖隆起の解剖実体顕微鏡と光源ショットFostec下<ol><li>シャーレにろ紙を置きます。その後、胚を乾燥させ、解剖のために固定するために、ろ紙の上にマウス胚を置きます。 </li><li>滅菌メスを用いて、臍帯の起源上記のマウス胚の横カットを行います。 </li><li>実体顕微鏡下で、無菌細かい鉗子と滅菌細かいからかいの針を使用して、泌尿器系が表示されるように腸や肝臓を取り除く。 腎臓は、腹腔内の横方向に配置され、そして膀胱は腎臓に比べて内側と尾側に位置しています。生殖腺の隆起が膀胱の両側に配置されているので、胚が雄として識別することができます。女性では、生殖腺の尾根はしっかりと腎臓の尾外側端に接続されている。 </li><li>その背後にある針をスライドさせて生殖隆起ピール。生殖隆起は、それを支える組織を離れて切断することによって除去される。 </li><li>新鮮なD - PBSで満たされた新しいペトリ皿に生殖腺隆起を転送する。 顕微鏡的に、男性の生殖隆起は、形状が大きく、楕円形、ストリップする必要があります。対照的に、女性の生殖隆起を発見する必要がある、細長い形状を有し、雄の生殖隆起と比較して小さくなる。 </li></ol>パート3：生殖隆起の消化実体顕微鏡の下で： <ol><li>中腎の解剖：中腎と罰金とシャープな針を使用して尾根から生殖腺を区切ります。 <ul><li>それはPGCの導出過程で生い茂るれる体細胞組織であるため、生殖隆起から中腎を削除することが重要です。 </li></ul></li><li>生殖隆起の消化：新鮮なD - PBSの0.5ulドロップできれいな生殖腺隆起を収集。コラゲナーゼ/ディスパーゼ溶液20ml（1mg/ml時の最終濃度）を追加します。 <ul><li>胚は、個別に処理されるべきです。それぞれの胚は、独自の個別およびラベル付けペトリ皿を持っている必要があります。 </li></ul></li><li>生殖腺のリッジは、ミンシング：滅菌針および滅菌細かい鉗子4号を使用して小片に生殖隆起をカット。 </li><li>インキュベーション：ペトリ皿を37℃インキュベーターに転送されます℃で15分間。 <ul><li>インキュベーション時間は、組織間で異なる可能性があります。 </li></ul></li><li>ピペッティング：15分後、組織は、ピペッティングにより解離させることができる。 40〜100 mmの間で直径と引っ張らガラスキャピラリーピペットを使用すると上下にピペッティングでピースを分割。これは、小さな塊を形成します。最後の洗浄のための事前暖めD - PBSのドロップの0.5ミリリットルに塊を転送する。 </li><li>洗浄後、エッペンドルフチュー​​ブに塊を転送する。 <ul><li>上のコラゲナーゼに組織を公開しないでください。 </li><li>単一の細胞懸濁液を作成しないでください。これはコロニー形成のために重要です。それは単一の細胞懸濁液の場合は、始原生殖細胞は分化し、移行する傾向がある。 </li><li>このプロセスは20分以内にする必要があります、またはあなたの細胞は、生存能力を失うことになる。 </li></ul></li><li>室温で5分間2000rpmで遠心する。 </li><li>遠心後、上清を除去し、メディアから補足ノック​​（37℃で予め温めておいた）0.5 mlにペレットを再懸濁します。 </li></ol>パート4：始原胚細胞の培養 "あなたは分離し、導出のため始原生殖細胞の生存を維持するためにすぐに次の手順を実行する必要があります。 <ol><li> 24時間このプロセスの前に、張J.ら、2008年からプロトコルを以下の有糸分裂的不活化MEF - CF1フィーダー層を準備する必要があります。 <ul><li> oneプレグナで20皿を準備するNT雌性マウス（6-8胚）。 </li><li> MEFには5-6継代後（成長を促進し、差別化を防ぐ）フィーダー層となる能力を失う。 </li><li> 48時間以上経過したMEFを使用しないでください。 </li></ul></li><li>すぐにメッキの始原生殖細胞の前に、MEFの培地は、徐々にMEFフィーダー層から削除する必要があります。 </li><li>その後、MEFフィーダー層上に予め温めておいた補充ノックアウト培地0.5ml /ウェルを追加。 <ul><li> MEFのメディアは、始原生殖細胞の分化を誘導するウシ胎児血清が含まれています。 </li><li>グロー因子の活性を確保するために使用する前にノックアウト媒体は、直ちに正貨特定の成長因子を補充する必要があります。 </li></ul></li><li> MEFフィーダー層上に対称的な分布、プレートの始原生殖細胞を使用する。 <ul><li>これらの作品が近すぎる場合は、集約する傾向があり、不十分な添付または分化を開始高密度コロニーを作る。 </li><li>培養皿は、胚胚細胞株名、継代数、および日付で標識されている必要があります。 </li></ul></li><li>慎重に、37℃、5％CO 2インキュベーターに培養皿を転送する。 </li><li>細胞を24時間ごとに監視します。 </li><li> 48時間後、コロニーの付着を妨げることを避けるために文化の非常に上からメディア250mlのを削除します。その後、新鮮なノックアウト添加培地（37℃で予め温めておいた℃）250 mlを加える。 </li><li>手順7の後に、別の48時間待機してから、完全にすべてのメディアを取り出し、新鮮なノックアウト添加培地（37℃で予め温めておいた）に交換してください。 PGCコロニー形成されるまで8-10日のためにこの2日おきください。 </li></ol>パート5：胚胚細胞<ol><li> PGCの分離の10日後、胚性生殖細胞のコロニーが形成されています。 </li><li>胚性生殖細胞系は、マニュアルの文章ごとに8-10​​日で生き続けています。彼らは未分化な形態を提示し、そのようなalkalyneホスファターゼ、OCT - 4、SSEA - 1、およびSOX - 2のような多分化能マーカーを発現し続ける</li></ol>ノート<ul><li>無菌/滅菌条件は、培養室で不可欠です。 </li><li>導出と文化のために、始原生殖細胞は、浄水器クラスIIバイオセーフティキャビネット内で処理されます。 </li><li>インキュベーションは、加湿37℃、5％CO 2インキュベーターです。 </li><li>すべての培地および試薬は4℃で保存されている0.2ミクロンフィルター、° Cで使用する前に濾過し、使用前に37℃で事前に暖めています。 </li><li>解剖の手順中に、すべての胚や組織は氷上で保存する必要があります。 </li><li>すべての試薬のフラスコは、キャビネット内に配置する前にエタノールで除染されています。 </li><li>手袋、白衣、看護師のキャップの使用は必須です。 </li></ul>結論私達は分離する方法を示していますビデオ、派生、および10.5から11.5 DPCのマウス胚の生殖腺尾根から文化胚性生殖細胞を提供している。再現性の分離および胚生殖細胞株の長期的な文化は、男性と女性の胚で配偶子形成の発達過程で、遺伝的およびエピジェネティックな胚のパターン、生殖腺形成、周囲の臓器の環境への影響を初期胚発生の研究のための重要な基盤を提供します。とがんと不妊につながる経路の決定。 <img src="/files/ftp_upload/1635/1635figure1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1">

<ol><li>DeFelici, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDeFelici%2C+M+%22Cell+Biology%3A+A+laboratory+Handbook%22">Cell Biology: A laboratory Handbook</a>. 1, Second Edition, 73-85 (1998).</li>
<li>Donovan, P. J., De Miguel, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+Germ+Cells+into+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Turning Germ Cells into Stem Cells.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 13, 463-471 (2003).</li>
<li>Labosky, P. A., Hogan, B. L. M. Part 12: Mouse Primordial Germ Cells: isolation and in vitro culture. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLabosky%2C+PA+%22Molecular+embryology%3A+methods+and+protocols%22">Molecular embryology: methods and protocols</a>. Sharp, P. T., Mason, I. 97, Humana Press. Totowa, NJ. (1999).</li>
<li>Mc Laren, A., Southee, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+Mouse+Embryonic+Germ+Cells+into+Meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Entry of Mouse Embryonic Germ Cells into Meiosis.</a> Developmental Biology. 187, 107-113 (1997).</li>
<li>Yoshimizu, T., Obinata, M., Matsui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+tissue+and+cell+interactions+play+key+roles+in+mouse+germ+cell+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stage-specific tissue and cell interactions play key roles in mouse germ cell specification.</a> Development. 128, 481-490 (2001).</li>
<li>Zhang, J., Hhvorostov, I., Teitell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+MEFs+to+Matrigel+I%3A+Passaging+hESCs+in+the+Presence+of+MEFs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

ミシシッピ州立大学：この研究は私たちのマウスのプロトコル＃08030（ホールディングおよびプロトコルを繁殖生殖系列の開発と腫瘍形成における活性酸素、ROSの役割）の見直しと動物実験と使用委員会（IACUC）承認後に実施された。

鉗子14号、15、メス35ミリメートル、解剖ハサミ、外科分野、抗菌石鹸、生理食塩水0.9％、ガーゼ、氷の泡コンテナ、カミソリの刃、メス35ミリメートル、微細な鉗子第4と5、罰金からかい針ハンドル、ろ紙シート、およびガラスピペットを引っ張った。<br /<br /&gt;設備：解剖顕微鏡、光源ショットFostec、倒立顕微鏡、マイクロピペット10、200ul、遠心分離、バイオセーフティキャビネット。

マウスes胚細胞の単離と導出

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

初期の発達段階の間に後で配偶子への始原生殖細胞（始原生殖細胞）に分化し、胚性生殖細胞の能力（EG）は、がんと不妊についての我々の仮説に対応するために最適なモデルです。このプロトコルは、10.5から11.5日後に交尾（DPC）のマウス胚での開発生殖腺から始原生殖細胞を単離する方法を示しています。マウス胚から生殖腺隆起（C57BL6J）を開発してから以前に分裂ノックアウト媒体の存在下でマイトマイシンCで不活化し、白血病阻害剤を添加したマウス胚線維芽細胞のフィーダー層（MEF - CF1）に播種、コラゲナーゼと機械的な破砕により解離させた因子（LIF）、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、および幹細胞因子（SCF）。培養条件のPCG識別、分離、および確立のためにこれらの最適化されたメソッドを使用すると、40日以上用EG細胞の長期培養を可能にします。胚性生殖細胞系は、多能性の状態の一般的な使用されるマーカーの胚の表現型と発現を示した。単離および培養中の胚細胞の派生は、in vitroでその開発を理解し、酸化ストレスへの曝露後の遺伝的およびエピジェネティックなレベルでの累積損傷を監視する機会を提供するツールを提供しています。

開発の初期段階で始原生殖細胞に分化する胚性生殖細胞の能力は、がんと不妊についての我々の仮説に対応するために最適なモデルです。このプロトコルは、10.5から11.5日後に交尾のマウス胚での開発生殖腺から始原生殖細胞を単離する方法を示しています。

マウスES胚細胞の単離と導出

初期発生過程において、胚性生殖細胞（EG）が始原生殖細胞（PGC）へと分化し、その後配偶子へと分化する能力は……

こんにちは。ミシシッピ州立大学の生殖遺伝学・幹細胞研究室のハル・モレノです。こんにちは。同じくミシシッピ州立大学の生殖遺伝学・幹細胞研究室のクララ・セントです。原始生殖細胞（PGC）は、それぞれ精巣における精原細胞および卵巣における卵原細胞の前駆細胞です。マウス胚において、PGCは8.5日から9.5日にかけて後腸から生殖堤へと移動します。その後、PGCは10.5日から11.5日に生殖堤に到達します。TAsが後方に移動し、雌では生殖腺堤の形成が始まります。PGCsは腎臓の側端に移動し、雌の生殖腺堤を形成し始めます。対照的に、雄ではPGCsは膀胱の両側に移動します。それでは、開始しましょう。雄のalridge Ger細胞は、不妊症や癌の原因となる酸化ストレス下における生殖細胞の発達経路を研究するための優れた研究モデルです。それでは、始めていきましょう。本日は、胎生10.5日から11.5日のマウス胚の生殖堤から始原生細胞（PGCs）を採取および単離する方法を説明します。生殖堤を機械的に破壊して分散させ、マウス胚性線維芽細胞のフィーダー層上に播種します。最適化された条件下で10日間培養すると、胚性生殖細胞コロニーに胚性表現型が現れます。また、継代後には、多能性マーカーの発現によってこれらの細胞を同定することが可能です。無菌解剖のこのステップでは、以下の材料が必要です。滅菌野、ピンセット、はさみ、カミソリの刃、抗菌石鹸、生理食塩水、PBS Pepを満たして氷上に置いたペトリ皿、およびガーゼを含むパッケージ。妊娠10.5〜11日のBL6雌マウスを頸脱骨により安楽死させます。腹部を抗菌石鹸で洗浄し、その後、除毛します。生理食塩水を用いて腹部を洗浄します。滅菌ガーゼで水分を拭き取ります。マウスを新しい滅菌ドレープで覆います。ピンセットとハサミを用いて腹側を切開します。腹腔内から子宮全体を同定し、摘出します。子宮内部に胚が確認できます。細心の注意を払って、子宮角にまだ付着している靭帯を切り離します。膣に沿って横切るように切開し、解剖を完了させます。子宮をGPVSを入れたペトリ皿に転写し、氷上で保持します。滅菌済みメスとピンセットを用いて、胚外組織を胚から分離します。口部胚をDPBSを満たした新しいペトリ皿に移します。口部胚の測定可能な長さを計測します。胚の齢によってサイズが異なることが分かりました。例えば、受精後8.5日の個体は平均6 mm、受精後10.5日の個体は平均11 mm、受精後12.5日の個体は平均16 mmでした。DNA抽出のために尾部を切除します。解剖には、実体顕微鏡、バイオセーフティキャビネット、PDS、滅菌メスが必要です。滅菌済みの微細ピンセット、ハンドル付きの滅菌済み微細解剖針、ペトリ皿、ろ紙を用意します。ペトリ皿にろ紙を敷き、その上に口期胚を置いて胚を乾燥させ、解剖時に動かないように固定します。実体顕微鏡下で、滅菌済みのメスを用いて、口期胚の臍帯の起始部より上方で横断的に切断します。滅菌済みの微細ピンセットと滅菌済みの微細解剖針を使用します。尿路系が見えるように、腸と肝臓を取り除きます。膀胱は正中面に位置しています。生殖堤が膀胱の両側に位置しているため、この胚は雄であると識別できます。滅菌済みの微小鉗子と滅菌済みの微細針を用いて、支持組織を切除し、右の雄性生殖堤を取り除きます。同様の手順で、左の雄性生殖堤も取り除きます。顕微鏡下で、両側の雄性生殖隆起を新鮮なDPDSを含む小型ペトリ皿に移します。雄性生殖隆起が中腎管に付着していることが確認できます。ステレオ顕微鏡下で、雄性生殖隆起は縦長の楕円形に見えるはずです。滅菌済みの微細鑷子と滅菌済みの微細解剖針を用いて、腸管を除去します。腎臓は腹腔内の側方に位置し、膀胱は腎臓と比較してより内側かつ尾側に位置しています。雌の生殖堤は、形態および解剖学的位置が異なるため、雄の生殖堤とは異なります。雌の生殖腺堤は、腎臓の尾側外端に強固に付着しています。滅菌済みの微細ピンセットと滅菌済みの微細針を用い、腎臓に付着している組織を切り離して、左側の雌生殖腺堤を取り除きます。同様の手順を繰り返し、右側の雌生殖腺堤を除去します。両側の雌生殖腺堤を、新鮮なPDSを含む小型ペトリ皿に顕微鏡下で移します。このとき、Neso Neraに付着した雄生殖腺堤を確認することができます。滅菌済みの細く鋭い針を用いて、雌の生殖堤（gonadal ridge）を確認します。雌の生殖堤は、雄の生殖堤と比較して細長い形状をしており、サイズが小さいことがわかります。滅菌済みの細く鋭い針を用いて、雌の生殖堤を中腎およびその他の体細胞組織から分離します。同様に、雄の生殖堤を中腎およびその他の体細胞組織から分離します。PGC誘導プロセスにおいて過増殖する体細胞であるため、新生脊髄から中腎（meso Neros）を取り除くことが重要です。コラゲナーゼ消化液を含む新鮮なDPVS 0.5 µLの滴の中に生殖腺脊髄を回収します。実体顕微鏡下で、滅菌済みの細く鋭い針を用いて生殖腺組織を細かく裁断します。ペトリ皿を37°Cのインキュベーターに15分間移します。15分後、40～100µmの異なる直径を持つ引き伸ばしガラスキャピラリーピペットを用いてピペッティングし、組織を分散させます。ピペッティングを繰り返して、組織片を細分化してください。これにより小さな凝集塊が形成されます。これらの小さな凝集塊をDPDXで洗浄した後、0.5 µLのDPDXで洗浄します。その後、2000 RPMで5分間、Eendキューブへ転送します。遠心分離後、室温で上清を除去し、ペレットを37°Cで24時間的に温めておいたサプリメント添加済みKnockout medium 0.5 mLで再懸濁します。この工程の前に、PGCを播種する直前に、不活化したマウス胚線維芽細胞（MEF）CCF1フィーダー層を準備しておく必要があります。準備したMEFフィーダー層から、培地を除去してください。次に、あらかじめ37°Cに温めておいた補完済みノックアウト培地を数ミリリットル、methフィーダー層に加えます。実体顕微鏡下で、均等に分布するようにPT GCを少量ずつmethフィーダー層上に播種します。これらの塊が近すぎると、凝集して高密度のコロニーを形成しやすく、接着不良や分化の開始を招く傾向があります。ディッシュには、胚性生殖細胞株の名前、継代数、および日付をラベル付けしてください。分離から10日後、37°C、5% CO₂のインキュベーター内で培養ディッシュを慎重に確認します。胚性生殖細胞のコロニーは、その特徴的な形態に基づいて同定できます。また、初回の継代後は、アルカリホスファターゼ、Oct4、SSEA-1、およびSSEA-2などの多能性マーカーの発現によっても同定可能です。本日は、生後10.5日および11.5日のマウスPGC（始原生生殖細胞）から胚性生殖細胞を採取し、培養する方法について解説します。生殖細胞の前駆細胞としての胚性生殖細胞の特性解析は、配偶子形成、不妊症、および癌に関連する研究において不可欠です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

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生物学

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