デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）を用いたマウス大腸炎モデル

マウスに3% DSSを4日間経口投与します。体重、下痢の有無、および糞便中の血便を毎日記録します。4日目以降、DSSを滅菌水に替えます。水投与を3日間続けた後、マウスを安楽死させ、結腸を摘出します。

結腸の測定および重量測定を行います。その後、結腸をスイスロール状またはソーセージ状に成形し、顕微鏡下で観察します。本ビデオ記事では、潰瘍性大腸炎のマウスモデルにおける結腸の採取および処理方法を実演します。

この手順は、デキストラン硫酸ナトリウム処理を開始する前に、ヴァンダービルト大学がん生物学研究室のChristopher Williams博士の研究室で潰瘍性大腸炎を研究するために用いられます。実験期間を通じて、ベースライン体重を測定します。マウスの体重を毎日測定した後、3% w/vのデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）水溶液を調製します。

このモデルを効果的に機能させるためには、低分子量のDSSを使用する必要があります。マウスケージごとのウォーターボトルを満たす十分な量のDSS溶液を調製し、0.45 µmの酢酸セルロースフィルターでろ過してください。マウスケージ内の飲料水ボトルを、3% DSS溶液が入ったボトルに交換します。施設で自動給水システムを使用している場合は、マウスが他の水源にアクセスできないよう、給水ノズルに除外チップを取り付けてください。

4日後、大腸炎による全身性の影響を定量化するため、マウスの体重を再度測定します。重症の場合、体重減少が一般的に見られますが、同日に確認できず、さらに数日経過してから顕著になる場合があります。4日目に、DSS溶液を水に交換し、さらに3日間維持することで、大腸上皮がある程度回復するようにします。

3日後（7日目）に、マウスの体重を再度測定します。その後、次節に示すように、安楽死させたマウスから結腸を採取します。結腸を採取するには、安楽死させたマウスの腹側を露出し、腹部へ支障なくアクセスできるようにします。

腹部全体を70%ethanolで湿らせます。組織鉗子で腹部の正中線を掴んで持ち上げ、微細先端鋏を用いて皮膚をテント状に張らせます。

腹部を切開し、腹腔内臓器を露出させます。切開線を正中線の剣状突起先端まで延長し、その後、両側の肋骨弓の下縁に沿って延長します。小腸、盲腸、および結腸を確認します。

周囲の腸間膜から結腸を慎重に剥離または剥離させます。その後、骨盤深部の結腸を切断し、直腸から遠位結腸を遊離させます。

動脈や静脈を切断しないよう注意してください。また、結腸は裂けやすいため、注意が必要です。したがって、腸間膜から結腸を慎重に切り離してください。

近位結腸を遊離させるため、結腸のColona sequel縁で切断します。結腸を取り出し、20ゲージの経腸栄養針と10 mLシリンジを用いて管腔内に挿入し、EITから便が完全に消失するまで氷冷PBSで結腸内を洗浄します。結腸の遠位端を自分に最も近い位置に保ち、正しい方向性を維持することが重要です。

まず、デジタルノギスを用いて結腸の長さを測定します。結腸の長さは、損傷の重症度を示すもう一つの指標となります。大腸炎により浮腫が増加し、結腸全体の長さが短縮します。

この段階で、採取した結腸は、肉眼的解析のためにソーセージ状に処理するか、あるいは急性結腸炎の組織学的解析のためにスイスロール状に作成することができます。以下のセクションでは、結腸をソーセージ状に処理する手法について説明します。結腸全体の肉眼的解析においては、結腸の正しい方向性を維持することが重要です。そのため、結腸の遠位端を自分に最も近い位置に置いてください。

非吸収性縫合糸を2本（一方は約1インチ、もう一方は2インチの長さ）に切断します。2インチの縫合糸を使用して、十分な密封性を維持しつつ、結腸の遠位端を切除縁にできるだけ近い位置で結紮します。次に、10%緩衝ホルマリンリン酸溶液5 mLを満たした20ゲージのフィーディングニードルを結腸の近位端に挿入します。

経管針のバルブ直近の近位側に、残りの縫合糸を緩く結びます。次に、経管針のバルブ部分で結腸をしっかりと保持し、結腸が拡張するまで十分な量のホルマリンを注入します。経管針を抜去しながら縫合糸の結び目を締め、注入により拡張した結腸を保持させます。

結腸をソーセージのように丸め、10%緩衝ホルマリンリン酸液を15 mLコニカルチューブに満たし、チューブにラベルを貼ります。結腸をチューブに入れ、24時間固定します。24時間後、ホルマリンを適切な廃棄容器に捨て、70%エタノールに交換してさらに24時間静置します。

結腸は70%エタノール中で室温で無期限に保存することが可能です。結腸を解析する準備が整ったら、コニカルチューブから取り出します。結腸を傷つけないように注意しながら、メスを用いて両端の紐を切断します。

遠位端に最も長い紐がついていることを確認してください。結腸を遠位端から近位端に向かって縦方向に切断し、長いシート状にします。これで、結腸を解剖顕微鏡下で観察することができます。

結腸を縦方向に切開し、平らに広げます。結腸を丸めるには、2組のピンセットを使用し、両手で操作する必要があります。ピンセットで遠位結腸縁の両側端を把持し、ピンセットを回転させては離す動作を繰り返し、近位縁に向かって順次結腸を丸めていきます。これにより、3次元的な螺旋状（スイスロール状）の構造を作成します。

結腸がワトマン濾紙に付着している場合は、少量のPBSで濾紙と結腸を湿らせて形状を維持します。ピンセットでロールをしっかりと保持し、27.5ゲージの針で切断します。ロールから針を抜く際に、針を曲げることでロールを固定します。

次に、ロールをラベル付きの組織カセットに入れ、そのカセットを10%緩衝ホスフェート formalin 液の容器に入れます。組織を固定するため、室温で24時間放置します。24時間後、formalin 液を捨て、70% ethanol に交換してさらに4時間置きます。

結腸は70% ethanolを用いれば、室温で無期限に保存することが可能です。本モデルを用いることで、結腸の採取、固定、および解析が可能となり、大腸炎の重症度を解析できます。結腸全体の肉眼的解析を行うには、結腸にformalinを注入して完全に拡張させ、ソーセージ状に処理して解析することができます。

開封したソーセージは平らに置く必要があります。ソーセージ法が正しく行われていれば、固定された結腸は拡張し、粘膜表面全体を解剖顕微鏡下で容易に操作し、観察することができます。組織学的解析を行う場合は、結腸をスイスロール状に巻いて処理することができます。

ロールを針で固定し、組織カセットに入れて固定します。適切にロールが巻かれていれば、切片を作成しスライドに貼付した際に、大腸全体の代表的な切片となります。スイスロールの切片をヘマチンおよびASINで染色することで、大腸損傷の範囲を判定することができます。スライド上のロールの中心が大腸の遠位端であることを留意してください。

この例では、水で処理したコントロール群と比較して、DSS処理した結腸に炎症と陰窩の損傷が認められます。ここでは、急性結腸炎のマウスモデルから結腸を採取し、処理する方法について説明しました。この処置を行う際は、安楽死させる前に十分に準備を整えておくことが重要です。

例えばマウスの実験では、各マウス用のチューブとカセットにラベルを貼り、すべての器具と試薬をすぐに使用できる状態で準備しておきます。さらに、マウスの体重と結腸の長さを詳細に記録してください。最後に、処理に十分な時間を割り当てているか確認してください。

この手法に慣れていない場合は通常マウス1匹あたり15分、熟練している場合は6〜8分かかります。