高効率で初代培養細胞をトランスフェクトするためにジーンパルサーMXcellのエレクトロポレーションシステムの使用

このプロトコールの全体的な目標は、マウス胚、線維芽細胞、またはmfsを使用して初代細胞株をトランセクトするための最適なエレクトロポレーション条件を特定することです。一例として、選択したMF細胞と核酸を、遺伝子Pulser MX細胞システムに付着した96ウェルエレクトロポレーションプレートにロードすることで、1回のランで複数のエレクトロポレーション条件を試験することができます。最適化実験では、細胞を培養し、エレクトロポレーション後にトランスフェクション効率を分析します。

エピ蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーを使用して、将来のトランスフェクションに最も効率的なエレクトロポレーション条件を選択できます。こんにちは、BioRad Laboratoriesの遺伝子発現部門のシニアサイエンティストであるAdam McCoyです。本日は、初代細胞株のトランセクトに最適なエレクトロポレーション条件を簡単に特定するための手順をご紹介します。

私たちの研究室では、この手順を用いて、これらの細胞における遺伝子発現を研究しています。今日は、mesまたはマウス胚性線維芽細胞の3つの異なるパッセージ番号を使用します。私は 2 つの理由で異なるパッセージ番号カルチャを使用しています。

まず、細胞の健康がいかに重要であるかを示します 初代細胞株では、培養に数日余分に滞在するだけでも、トランスフェクション効率に違いが生じる可能性があります。次に、トランスフェクションの効率が古い細胞とともに低下するにもかかわらず、最適な条件を特定するプロセスは同じであることを示したいと思います。あなたの実験には、おそらく異なる年齢の細胞は含まれないでしょう。

独自の実験計画でも同じ手順に従うことができます。遺伝子発現とコントロール細胞、処理細胞を比較する場合は、まず最適な条件を見つけ、次に特定した条件を使用して実験を行うことができます。または、最適化を行い、一緒に実験することもできます。

今日は、GFPコードプラスミドを使用して、フローサイトメトリーによるトランスフェクション効率を調べます。しかし、エレクトロポレーションの手順は、irnaの導入やリアルタイムPCRによる遺伝子発現の観察など、何か違うことをしていても同じです。それでは始めましょう。

このプロトコルで使用されるマウス胚性線維芽細胞、またはmetsは接着細胞です。したがって、これらの細胞を扱う最初のステップは、トリプシンを含む標準的な組織培養プロトコルを使用してフラスコの底から細胞を持ち上げることです。イゼーション。細胞がフラスコから分離した後、血清を含む培地でトリプシンを中和し、細胞を50ミリリットルの円錐管に集めます。

遠心分離機に集められたら、細胞の後の細胞はペレット化されています。それらはresusで洗浄し、既知の量のPBSに懸濁する必要があります。完全に再懸濁したら、エレクトロポレーション実験には1ミリリットルあたり100万個の細胞の濃度が必要であることを承知の上で、細胞を数えます。

細胞数に基づいて適切な細胞数を計算し、それらをきれいなチューブに移します。Centrifugeは、細胞をペレット化するためにもっと多くのことを望んでいます。次に、スナットを慎重に取り外します。

エレクトロポレーションバッファー中の細胞を1ミリリットルあたり100万個の細胞の濃度に懸濁し、プラスミドのミリリットルあたり20マイクログラムを添加します。プレートは96のウェルに分割され、列は1から12まで、行は8からHまでラベル付けされ、各セットは4つのウェルのセットであるか、またはウェルセットが一対の電極プレートを共有して、それらのウェル内のセルが同じパルスを経験するようにします。たとえば、セル 1 A、1 B、1 C、および 1D は 1 つのウェルセットに電気的に接続されており、すべて同じパルスを受信します。

次の4つのウェルのセット、2つ、A、B、C、およびDは、プロトコルが開始されると、パラメータが同じであっても、96ウェルエレクトロポレーションプレートもプレートの上半分と下半分が分割されるように設定されています。したがって、プレートの底にある1つのE、1つのF、1つのG、および1つのHはすべて1つのパルスを受け取りました。しかし、それは上部のウェル1、A、B、C、Dが受け取るパルスとは異なります。

この実験では、プレートの半分のみを使用します。各ウェルセットの最初の3つのウェルには、異なる年代の細胞が含まれています。一番上の行Aのセルは5回継代されています。

行Bのセルは9回、行Cのセルは13回継代されています。行Dには、エレクトロポレーションの前にのみエレクトロポレーションバッファーが含まれています。プロトコルをチェックして、設定が正しいことを確認することをお勧めします。

このプロトコルは、6つの指数関数的減衰パルスとそれに続く6つの方形波パルスを配信します。指数関数的減衰パルスは200ボルトから450ボルトに増加し、すべて350マイクロフェレットのみを使用します。使用されている遺伝子パルスまたはエレクトロポレーションバッファーの抵抗が低いためです。

矩形波パルスは、電圧とパルス幅の両方で異なります。機器の静電容量設定は、エレクトロポレーション混合物のコンダクタンスに一致させる必要があります。DMEMのようなエレクトロポレーションに高抵抗のバッファを使用する場合は、同じ電圧範囲を使用できますが、指数関数的減衰パルスには950マイクロフェレットなどの大きな静電容量を使用できます。

使用しているバッファーの最適な静電容量がわからない場合は、テストするエレクトロポレーション条件で静電容量を変化させる必要もあります。次のステップは、この実験に使用した各ウェルに150マイクロリットルの細胞プラスミド混合物をロードすることです。使用されている各ウェルセットの4番目のウェルには、エレクトロポレーションバッファーが充填されています。

プレートをロードした後、MXLプレートチャンバーに入れて蓋を閉めます。次に、パルスを押して細胞を食べます。この装置は、選択したプロトコルで指定された条件に従って、設定された各ウェルに電気パルスを順番に送達します。

すべての細胞を電気で祈るには数秒かかります。パルスが完了したら、送付されたプレートチャンバーミックスからプレートを取り出します。各ウェルの細胞を、予温培地を含む培養皿に移します。

これらのmesは、エレクトロポレーションされていない10%FBSコントロールサンプルを添加したDMEMで増殖させ、残りの細胞プラスミド混合物から採取し、戦前の培養物を含む培養皿に添加しています。エレクトロポレーションセルで使用されるものと同じ組成の培地。ついに渦巻きます。

次に、プレートを軽くたたいて細胞を分散させ、インキュベーターに摂氏37度、二酸化炭素5%で24時間置いてから、トランスフェクション効率を分析し、実験に最適なエレクトロポレーション条件を特定します。最適なエレクトロポレーション条件が特定されたら、将来の実験のために2つのエレクトロポレーション方法を選択できます。研究者は、96ウェルプレートの細胞を引き続き食べることも、キュベットの細胞を一度に1サンプルずつ食べることもできます。

キュベットは一度に1つのサンプルしか食べられず、96ウェルプレートのうち1ウェルに必要な量の4倍の量を必要としますが、必要なサンプルが少ない場合は、個々のキュベットの方が安価で使いやすいです。遺伝子パルスまたはMX細胞システムは、今回プレートとキュベットで同じエレクトロポレーション設定を使用できるように設計されています。プレートチャンバーの代わりに、キュベット用のmxlショックポッドを使用してください。

機器の背面からプレートチャンバーのプラグを抜き、ショックポッドを差し込みます。ショックポッドは、A、B、C、D 1のウェルセット用にプログラムされたパルスのみを供給するため、別のプログラムを選択する必要がある場合があります。以前に保存したプログラムを選択するには、ホームを押します。

次に、オプション 3 のユーザー プロトコルを選択します。すでに正しいユーザーフォルダにいる場合は、Enterキーを押してユーザープロトコルを選択し、下にスクロールします。正しいプログラムを強調表示するには、Enterキーを押してそのプログラムを選択します。

これで、機器の準備が整いました。プログラムが選択されたので、キュベットをセットアップします。プラスミドとMEFの混合物は、前に示したのと同じ方法で調製されます。

各0.4センチメートルの獣医に、ウェルセット全体に使用されるのと同じ容量をロードします。96ウェルプレートで。ウェルセットは4つのウェルであり、1ウェルあたり150マイクロリットルのバッファーまたは細胞混合物のいずれかを使用し、1ウェルあたり600マイクロリットルのプラスミド細胞混合物を獣医ごとに使用した。

次に、獣医をショックポッドチャンバーに入れ、パルスを押して電気ショックを細胞に送ります。エレクトロポレーションをプレート法混合と同様に進行させた後、細胞は次に、コントロールの予熱培地セットで満たされた細胞培養プレートにアリコートを移します。エレクトロポレーションされていないウェルは、プレートを渦巻き、タップします。

その後、細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で24時間回復させた後、細胞をトランスセクトした後のトランスフェクション効率を分析し、細胞を回復させます。エピ蛍光顕微鏡を使用してトランスフェクション効率を定性的に分析し、エレクトロポレーションに成功し、現在GFP遺伝子を発現しているフローサイトメトリー細胞を使用して定量的に分析すると、ここに示すエピ蛍光顕微鏡法で緑色に見える典型的な成功結果が得られます。位相差のある細胞を見ることで、トランスフェクトされた細胞と切除されていない細胞の両方を可視化することができます。

ここに示されているのは、200ボルトで最低電圧のエレクトロポレーションパルスにさらされたセルです。細胞密度が高いため、細胞は大部分がコンフルエントです。落射蛍光下での同じ視野は、多数の細胞がGFPマーカーを発現していることを示していますが、これらは前の画像で250ボルトで見える細胞のごく一部にすぎません。

位相コントラスト下で見られる生細胞の総数は、エピ蛍光下でわずかに減少します。GFPを発現する細胞の数は、印加される最高電圧375ボルトで増加していることがわかります。目に見える生細胞は少ないですが、残りの細胞の大部分がGFPを発現しています。

どの条件が最適かは、実験計画法によって異なります。一部の実験では、トランスフェクションされた細胞の最大数が最適である可能性があります。他の実験では、トランスフェクションの割合が最も高いものが最善かもしれません。

私たちは、各条件下でGFP陽性である細胞の割合と、その割合が細胞の年齢の流れによってどのように変化するかに関心があります。サイトメトリーは、異なるエレクトロポレーション条件のそれぞれにおけるトランスフェクション結果に関する定量的な情報を提供することができます。ここに示されているのは、継代でGFP陽性である細胞の割合です。

5つのセル。12種類のエレクトロポレーション条件のそれぞれにおいて、最大トランスフェクション率は、最高電圧指数関数的減衰下で約80%でした。最も強い方形波パルス試験条件12の下でのパルス条件6および70は、エレクトロポレーションの前に細胞を9回通過させた。

トランスフェクションの割合の全体的なパターンはほぼ同じですが、示されているトランスフェクションの割合はごくわずかに減少しています。以下は、継代13細胞におけるGFP細胞の割合であり、これは、若い細胞と比較してトランスフェクションの割合が著しく減少していることを示している。トランスフェクションの割合が最も高いのは、若い細胞の約半分であり、分離後できるだけ早く健康な細胞を使用することの重要性を示しています。

MXLエレクトロポレーションシステムを使用して、エレクトロプロベーションマップやその他の初代細胞株の最適な条件を特定する方法を紹介しました。この手順を実行する際には、単離後できるだけ早く健康な細胞を使用し、エレクトロポレーションバッファーに一致するエレクトロポレーション条件を使用することを覚えておくことが重要です。というわけで、これだけです。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。