高効率で初代培養細胞をトランスフェクトするためにジーンパルサーMXcellのエレクトロポレーションシステムの使用

本プロトコルの全体的な目的は、マウス胚由来線維芽細胞（mfs）を用いて、一次細胞株を導入するための最適なエレクトロポレーション条件を特定することです。例として、MF細胞と選択した核酸を、gene Pulser MX cell systemに接続された96ウェルエレクトロポレーションプレートにロードし、1回のランで複数のエレクトロポレーション条件をテストします。最適化実験では、エレクトロポレーション後に細胞を培養し、導入効率を分析します。

エピ蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーを用いることで、今後のトランスフェクションに最適なエレクトロポレーション条件を選択することが可能です。こんにちは。BioRad Laboratoriesの遺伝子発現部門のシニアサイエンティスト、Adam McCoyです。本日は、初代細胞株のトランスフェクションに最適なエレクトロポレーション条件を容易に特定するための手順をご紹介します。

当研究室では、これらの細胞における遺伝子発現を研究するためにこの手順を用いています。本日は、3つの異なる継代数のマウス胚性線維芽細胞（MEFs）を使用します。異なる継代数の培養細胞を使用する理由は2つあります。

まず、細胞の状態がいかに重要であるかを示します。初代細胞株では、培養期間がわずか数日延びるだけで、トランスフェクション効率に差が生じることがあります。次に、細胞が古くなるとトランスフェクション効率は低下しますが、最適な条件を特定するプロセス自体は同じであることを示します。実際の実験で、異なる日数の細胞を扱うことはおそらくないでしょう。

ご自身の実験デザインに合わせて、同様の手順で行うことができます。遺伝子発現におけるコントロール細胞と処理細胞を比較したい場合は、まず最適な条件を決定し、その後、特定した条件を用いて実験を行うことができます。あるいは、最適化と本実験を同時に行うことも可能です。

本日実演するように、私はGFPをコードするプラスミドを用い、フローサイトメトリーでトランスフェクション効率を確認します。しかし、siRNAの導入やリアルタイムPCRによる遺伝子発現の解析など、目的が異なる場合でも、エレクトロポレーションの手順は同じです。それでは始めましょう。

本プロトコルで使用するマウス胚性線維芽細胞（MEFs）は接着細胞です。したがって、これらの細胞を扱うための最初のステップは、トリプシン化を含む標準的な組織培養プロトコルを用いて、フラスコの底から細胞を剥離させることです。細胞がフラスコから剥離した後、血清を含む培地でトリプシンを中和し、50 mLコニカルチューブに細胞を回収します。

回収後、細胞を遠心分離してペレット化します。既知量のPBSに再懸濁して細胞を洗浄してください。完全に再懸濁させた後、エレクトロポレーション実験に1 mlあたり100万個の細胞濃度が必要であることを念頭に置いて、細胞数をカウントします。

細胞数に基づいて適切な細胞数を算出し、清潔なチューブに回収します。遠心分離を行い、細胞をペレット化します。その後、上清を注意深く除きます。

細胞をエレクトロポレーションバッファーに再懸濁して濃度を1 million cells/mLにし、20 µg/mLのプラスミドを添加します。プレートは96ウェルに分割されており、列は1から12、行はAからHまでラベル付けされています。4つのウェルのセット（ウェルセット）ごとに一対の電極プレートを共有しているため、それらのウェル内の細胞には同じパルスが印加されます。例えば、ウェル1A、1B、1C、および1Dは単一のウェルセット内で電気的に接続されており、すべてに同じパルスが適用されます。

プロトコルが開始されると、次の4つのウェル（2A、2B、2C、2D）にはすべて2回目のパルスが印加されます。パラメータが同一であっても、96ウェルエレクトロポレーションプレートはプレートの上半分と下半分に分かれるように設定されています。そのため、プレート下部のウェル（1E、1F、1G、1H）にはすべて1回のパルスが印加されますが、これは上部のウェル（1A、1B、1C、1D）に印加されたパルスとは異なるものです。

この実験では、プレートの半分のみを使用します。各ウェルセットの最初の3つのウェルには、異なる細胞齢の細胞が入っています。最上段の行Aの細胞は、5回継代されたものです。

B行の細胞は9回継代されており、C行の細胞は13回継代されています。D行には、エレクトロポレーション実施前にエレクトロポレーションバッファーのみが含まれています。設定が正しいことを確認するために、プロトコルを再確認することをお勧めします。

このプロトコルでは、6回の指数関数的減衰パルスに続き、6回の矩形波パルスを印加します。指数関数的減衰パルスは200 voltsから450 voltsまで増加し、すべて350 micro ferretsのみを使用します。これは、使用されるジーンパルスまたはエレクトロポレーションバッファーの抵抗値が低いためです。

矩形波パルスは、電圧とパルス幅の両方が変化します。装置の静電容量設定を、エレクトロポレーション混合液のコンダクタンスに合わせる必要があります。DMEMのような、より抵抗値の高いバッファーをエレクトロポレーションに使用する場合、同様の電圧範囲を使用できますが、指数関数的減衰パルスに対しては950 µFなどのより大きな静電容量に設定してください。

使用しているバッファーの最適な静電容量が不明な場合は、テストするエレクトロポレーション条件において静電容量も変化させる必要があります。次のステップでは、この実験に使用する各ウェルに、細胞とプラスミドの混合液を150 µLずつ分注します。使用する各ウェルセットの4番目のウェルには、エレクトロポレーションバッファーを満たします。

プレートをロードした後、MXLプレートチャンバーにセットし、蓋を閉じます。次に、パルスボタンを押して細胞を電気穿孔します。電極装置は、選択したプロトコルで指定された条件に従い、各ウェルに順次電気パルスを印加します。

すべての細胞にエレクトロポレーションを行うのに数秒かかります。パルスが完了したら、プレートチャンバーからプレートを取り出します。各ウェルから細胞を回収し、あらかじめ温めておいた培地を含む培養皿に移してください。

これらの細胞は、10% FBSを添加したDMEMで培養されています。エレクトロポレーションを行わないコントロールサンプルは、残りの細胞・プラスミド混合液から採取し、エレクトロポレーション後の細胞に使用したものと同組成のプレウォーム済み培地を含む培養皿に加えます。最後に、円を描くように混ぜ合わせます。

次に、プレートを軽く叩いて細胞を分散させ、37 °C、5% carbon dioxide のインキュベーター内で 24 時間培養します。その後、トランスフェクション効率を分析し、実験に最適なエレクトロポレーション条件を特定します。最適なエレクトロポレーション条件が決定したら、今後の実験に向けて2つのエレクトロポレーション手法から選択できます。研究者は、引き続き 96 well plates で細胞を処理するか、キュベットを用いてサンプルを1つずつ処理するかのいずれかを選択できます。

キュベットは一度に1つのサンプルしか処理できず、96ウェルプレートの1ウェルに必要な量の4倍の容量を必要としますが、少数のサンプルのみが必要な場合は、個別のキュベットの方が安価で使いやすく便利です。Gene PulseまたはMX cellシステムは、プレートとキュベットで同一のエレクトロポレーション設定を使用できるように設計されています。プレートチャンバーの代わりに、キュベット用にはmxl shock podを使用してください。

装置背面からプレートチャンバーを取り外し、ショックポッドを接続します。ショックポッドはウェル設定A、B、C、D1にプログラムされたパルスのみを供給するため、別のプログラムを選択する必要がある場合があります。保存済みのプログラムを選択するには、ホームボタンを押してください。

次に、オプション3の「user protocols」を選択します。すでに正しいユーザーフォルダにいる場合は、Enterキーを押して「user protocols」を選択し、下にスクロールします。目的のプログラムをハイライトさせ、Enterキーを押してそのプログラムを選択してください。

装置の準備が完了しました。プログラムを選択したので、キュベットをセットアップします。プラスミドとMEFの混合液は、前述と同様の方法で調製します。

各0.4 cmのvetに、96ウェルプレートの1ウェルセットあたりに使用したのと同じ容量をロードします。1ウェルセットは4ウェルであり、1ウェルあたり150 µLのバッファーまたは細胞混合液を使用したため、1つのvetあたり600 µLのプラスミド細胞混合液を使用しました。

次に、キュベットをショックポッドチャンバーにセットし、「pulse」ボタンを押して細胞に電気ショックを与えます。エレクトロポレーション後、プレート法の操作と同様に細胞を混合し、あらかじめ加温した培地を満たした細胞培養プレートに分注します。エレクトロポレーションを行わないコントロール用のウェルも設定してください。最後に、プレートを swirling（旋回）させ、軽くタッピングします。

その後、細胞を37°C、5% carbon dioxideの条件下で24時間放置して回復させ、トランスフェクション後の細胞の回復を待ってからトランスフェクション効率を分析します。トランスフェクション効率を、エピ蛍光顕微鏡を用いて定性的に、またフローサイトメトリーを用いて定量的に分析します。エレクトロポレーションに成功し、GFP遺伝子を発現している細胞は、エピ蛍光顕微鏡下で緑色に見えます。ここに典型的な成功例を示します。位相差顕微鏡で細胞を観察することで、トランスフェクションされた細胞とされていない細胞の両方を可視化できます。

ここでは、200 Vという最も低い電圧でエレクトロポレーションパルスを負荷した細胞を示しています。細胞密度が高いため、細胞はほぼコンフルエントな状態です。同一視野をエピ蛍光顕微鏡で観察すると、多くの細胞がGFPマーカーを発現していますが、これらは250 Vの時の前の画像に見られた細胞のごくわずかな割合にすぎません。

位相差顕微鏡で観察される生存細胞の総数は、エピ蛍光観察下ではわずかに減少します。印加電圧が最大である375 Vにおいて、GFP発現細胞の数が増加していることがわかります。生存細胞の可視数は減少していますが、残存細胞の大部分がGFPを発現しています。

どの条件が最適かは、実験設計によって異なります。ある実験では、トランスフェクションされた細胞数が最大であることが最適となる場合があります。また別の実験では、トランスフェクション効率（パーセンテージ）が最高であることが最適となる場合があります。

各条件下でGFP陽性となる細胞の割合と、細胞の継代数に伴いその割合がどのように変化するかに注目します。フローサイトメトリーを用いることで、異なる各エレクトロポレーション条件におけるトランスフェクション結果に関する定量的な情報を得ることができます。ここでは、継代におけるGFP陽性細胞の割合を示します。

5つの細胞。12種類のエレクトロポレーション条件のうち、最大 transfection 率はおよそ80%であり、これは最高電圧の指数関数的減衰（exponential decay）を用いた条件6および、電撃前の細胞継代を9回行った最強の方形波パルス条件12において観察されました。

トランスフェクション率の全体的なパターンはほぼ同一ですが、示されているトランスフェクション率はごくわずかに低下しています。以下は継代13代目の細胞におけるGFP陽性細胞の割合であり、若い細胞と比較してトランスフェクション率が著しく低下していることがわかります。最高のトランスフェクション率でも若い細胞で達成された値の約半分にとどまっており、分離後できるだけ早く健康な細胞を使用することの重要性が示されています。

以上で、MXLエレクトロポレーションシステムを用いて、MAPsやその他の初代細胞株に最適なエレクトロポレーション条件を特定する方法を説明しました。この手順を行う際は、分離後できるだけ早く健康な細胞を使用すること、および使用するエレクトロポレーションバッファーに適合したエレクトロポレーション条件を選択することが重要です。これで全てです。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。