Name: 高効率で初代培養細胞をトランスフェクトするためにジーンパルサーMXcellのエレクトロポレーションシステムの使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-07T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: 学ぶ Gene Pulser MXcellシステムを用いた初代マウス胎児線維芽細胞の電気穿孔条件最適化法。フローサイトメトリーと蛍光顕微鏡でトランスフェクション効率を解析し、細胞生物学研究に有用なプロトコルを確立します。

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1）細胞調製<ol><li>接着細胞を使用する場合、それはトリプシンおよびエレクトロポレーションする前に細胞を収集することが必要です。 </li><li>つの異なる継代数を表す4つのマウス胚性線維芽細胞（MEF）の文化、間のトランスフェクションを比較するために、各フラスコに、以下を実行します。 </li><li>細胞培養培地をオフに吸引除去する。 </li><li>細胞を洗浄するためにPBSを追加。 </li><li> PBSを取り外し、セルをカバーするのに十分なトリプシンを追加し、トリプシンで細胞を剥離できるように数分待ちます。 </li><li> 、細胞の状態を確認するための顕微鏡とフラスコをチェックして細胞を分離するためにフラスコを放つし、細胞がすべて取り外されていることを確認するために再びフラスコを確認してください。 </li><li>必要に応じて追加の時間と繰り返しを待つ。 </li><li>すべてのセルがデタッチされると、トリプシンを中和する血清含有培地を加える。 </li><li>遠心チューブに細胞を移し、遠心分離により細胞をペレット化（RCF = 300 × g）で。 </li><li> PBSの既知の量で上清と再懸セルを削除します。 </li><li>細胞を数える。 </li><li>細胞懸濁液の適切な量は、実験用のセル（あなたが1 × 10 6細胞/ mLの密度で、ウェル当たりの細胞を150μLが必要になります）、必要な数を提供するために、新しいチューブに移す。 </li><li>細胞を遠心分離します。 </li><li> 1 × 10 6細胞/ mLの細胞密度を達成するためにジーンパルサーのエレクトロポレーションバッファーの適切な量で上清と再懸セルを削除します。 </li><li>細胞懸濁液のプラスミド1mLあたり20μgのを加え、穏やかに混ぜる。 </li></ol> 2）エレクトロポレーション容器のセットアップとエレクトロポレーションプレートのセットアップとエレクトロポレーション<ol><li>ジーンパルサーMXcellのエレクトロポレーションシステムの電源モジュールにプラグプレートチャンバー。 </li><li> 96ウェルエレクトロプレートのウェルにピペット150μLの細胞の混合物またはバッファー。 </li><li>プレートチャンバーとパルスにプレートを置く。 </li><li>チャンバーからプレートを取り外します。 </li><li>各ウェルにピペッティングでよく内容を混ぜる。 </li><li>各ウェルから12ウェルプレートに予め温めておいたバッファーに細胞を移す。 </li><li>細胞を分散し、インキュベーターでそれを置くためにプレートをタップします。 </li><li>細胞は24時間で回復しましょう​​。 </li></ol>キュベットのセットアップとエレクトロポレーション<ol start="9"><li> ShockPodのジーンパルサーMXcellのエレクトロポレーションシステムとプラグ™キュベットチャンバーの電源モジュールからプレートチャンバーを外してください。 </li><li>ピペット0.4センチメートルギャップのエレクトロポレーションキュベットに細胞懸濁液600μL。 </li><li> ShockPodチャンバー内にキュベットを入れ、電気パルスを提供します。 </li><li>チャンバーからキュベットを削除します。 </li><li>キュベット内で上下にピペッティングによりキュベットの内容を混ぜる。 </li><li>各ウェルから12ウェルプレートに予め温めておいたバッファーに細胞を移す。 </li><li>細胞を分散し、インキュベーターでそれを置くためにプレートをタップします。 </li><li>細胞は24時間で回復しましょう​​。 </li></ol> 3）代表者の結果細胞をトランスフェクトし、それらを回復させた後、フローサイトメトリーを用いて、定量的に落射蛍光顕微鏡法を用いて、定性的にトランスフェクション効率を分析し、そして。 <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 成功エレクトロされ、現在はGFPの遺伝子を発現している図1。細胞は落射蛍光顕微鏡法の下に表示されます。 <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。位相コントラストでセルの表示は、トランスフェクションし、トランスフェクトされていない両方の細胞を可視化できる。これらは、200Vで最も低い電圧の電気パルスに曝された細胞である。細胞が原因で、高い細胞密度に大きくコンフルエントです。 <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。落射蛍光下のビューの同じフィールドには、細胞がGFPマーカーを発現している数を示していますが、これらは前の画像に表示されているセルのうちのごく少数です。 <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4。250Vで、位相コントラストで見て生きている細胞の総数はわずかに減少する。 <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig5.jpg" alt="図5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図5"> 図5は、。落射蛍光の下で、一つはGFP発現細胞の数が増加していることがわかります。 <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig6.jpg" alt="図6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図6"> 図6。最高電圧印加、375Vで、目に見えるが少なく生きた細胞があります。 <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig7.jpg" alt="図7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図7"> 図7。しかし、残りの細胞の大部分は、GFPを発現している。最適となる条件は、実験の設計に依存します。いくつかの実験でトランスフェクトされた細胞の最大数は、他の実験で最も高い割合のトランスフェクションが最良かもしれない、最適となります。 私たちは、それぞれの条件の下でGFP陽性とどのようにパーセントは細胞年齢とともに変化するセルの割合に興味を持っています。フローサイトメトリーは、別のエレクトロポレーション条件のそれぞれの下でトランスフェクションの結果に関する定量的情報を提供することができます。 <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig8.jpg" alt="図8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図8"> 図8。ここでは12エレクトロポレーション条件のそれぞれの下に5個の細胞が示されている通路に正のGFPである細胞の割合。最大トランスフェクションの割合は、最強の方形波パルスの下で最も高い電圧指数減衰パルス、状態6、および70％の下で約80％が、条件12をテストした。 <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig9.jpg" alt="図9" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図9"> 図9。細胞では、エレクトロポレーションの前に9回を渡された、トランスフェクションの割合の全体的なパターンはほとんど同じですが、トランスフェクションの割合で非常にわずかな減少で。 <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig10.jpg" alt="図10" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図10"> 図10。ここに示されているのは継代の若い細胞に比べてトランスフェクションの割合の著しい減少を示し13細胞におけるGFP細胞のパーセンテージです。最高のトランスフェクションの割合は、できるだけ早く分離した後、健康な細胞を使用することの重要性を実証する若い細胞で達成されたものを約半分であった。 <table border="1"><tbody><tr><td colspan="3">ジーンパルサーMXcellを使用してMEF細胞をトランスフェクトするために使用されるエレクトロポレーション条件</td></tr><tr><td>条件（1-6） 指数減衰パルス、 1000ohm 350 uFのあるすべての、 </td><td>電圧（V） </td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 200 </td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> 250 </td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td> 300 </td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td> 326 </td><td></td></tr><tr><td> 5 </td><td> 350 </td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td> 376 </td><td></td></tr><tr><td>条件（7-12） 方形波パルス、 2000 UF、1000オーム、および1パルスを持つすべての</td><td>電圧（V） </td><td>パルス持続時間（ミリ秒） </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 200 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 250 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 9 </td><td> 300 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 200 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> 11 </td><td> 250 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> 12 </td><td> 300 </td><td> 20 </td></tr></tbody></table>

著者らは、この記事で使用する試薬や器具を生産するバイオラッドラボラトリーズによって採用されています

このビデオの記事では、簡単にMEFのその他の一次細胞株に対して最適なエレクトロポレーション条件を識別するためMXcellのエレクトロポレーションシステムを使用する方法を示します。多くは多くの独立した実験の必要性をなくすことができる、同時に実行される実験や最適化条件の複製のために96ウェルプレートフォーマットが可能です。この手順を行いながら、一つはできるだけ早く分離後の健康な細胞を使用するとエレクトロポレーションバッファーに一致しているエレクトロポレーション条件を使用することを忘れないようにすべき。

<table><tbody><tr><td>Gene Pulser&amp;#174; 電気穿孔バッファー</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2676</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser MXcell&amp;#8482; 電気穿孔システム</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2670</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser MXcell&amp;#8482; ShockPod&amp;#8482; キュベットチャンバー</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2673</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser MXcell&amp;#8482; ShockPod&amp;#8482; キュベットチャンバー付き電気穿孔システム</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2674</td><td></td></tr></tbody></table>

高効率で初代培養細胞をトランスフェクトするためにジーンパルサーmxcellのエレクトロポレーションシステムの使用

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

それは、エレクトロポレーションは、プライマリ細胞にプラスミドDNAやsiRNAを導入するための最も効果的な方法であることがますます明らかになってきている。ジーンパルサーMXcellのエレクトロポレーションシステムとジーンパルサーのエレクトロポレーション緩衝液（Bio - Rad社）は、特に簡単に哺乳動物の細胞や、プライマリおよび幹細胞のような困難なトランスフェクション細胞に核酸をトランスフェクトするために開発されました。我々はすぐに最高のエレクトロポレーション条件を識別する簡単な実験を実行する方法を説明します。我々は最適化が実行されると実験を同時に実施できるように、エレクトロポレーション条件の範囲でいくつかのサンプルを実行する方法について説明します。我々はまた、同じエレクトロポレーション効率を維持しながら、最適な条件は、標準的なエレクトロポレーションキュベットで使用できる96ウェルエレクトロポレーションプレートを使用してエレクトロポレーションキュベットにエレクトロプレートからスイッチを容易に識別方法を紹介します。ビデオでは、我々はまた、エレクトロポレーション実験の成功または失敗につながることができる重要な要因のいくつかを議論します。

この手順では、迅速かつ簡単に、マウス胚繊維芽細胞（MEF）や他の主要な細胞のために最高のエレクトロポレーション条件を識別するためにジーンパルサーMXcellのエレクトロポレーションシステムを使用する方法を示します。トラブルシューティングのための考慮事項は、関連するビデオで説明しています。

高効率で初代培養細胞をトランスフェクトするためにジーンパルサーMXcellのエレクトロポレーションシステムの使用

プライマリー細胞にプラスミドDNAまたはsiRNAを導入するには、エレクトロポレーションが最も効果的な方法であることがますます明らかになっています。Gene Pulser...

本プロトコルの全体的な目的は、マウス胚由来線維芽細胞（mfs）を用いて、一次細胞株を導入するための最適なエレクトロポレーション条件を特定することです。例として、MF細胞と選択した核酸を、gene Pulser MX cell systemに接続された96ウェルエレクトロポレーションプレートにロードし、1回のランで複数のエレクトロポレーション条件をテストします。最適化実験では、エレクトロポレーション後に細胞を培養し、導入効率を分析します。エピ蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーを用いることで、今後のトランスフェクションに最適なエレクトロポレーション条件を選択することが可能です。こんにちは。BioRad Laboratoriesの遺伝子発現部門のシニアサイエンティスト、Adam McCoyです。本日は、初代細胞株のトランスフェクションに最適なエレクトロポレーション条件を容易に特定するための手順をご紹介します。当研究室では、これらの細胞における遺伝子発現を研究するためにこの手順を用いています。本日は、3つの異なる継代数のマウス胚性線維芽細胞（MEFs）を使用します。異なる継代数の培養細胞を使用する理由は2つあります。まず、細胞の状態がいかに重要であるかを示します。初代細胞株では、培養期間がわずか数日延びるだけで、トランスフェクション効率に差が生じることがあります。次に、細胞が古くなるとトランスフェクション効率は低下しますが、最適な条件を特定するプロセス自体は同じであることを示します。実際の実験で、異なる日数の細胞を扱うことはおそらくないでしょう。ご自身の実験デザインに合わせて、同様の手順で行うことができます。遺伝子発現におけるコントロール細胞と処理細胞を比較したい場合は、まず最適な条件を決定し、その後、特定した条件を用いて実験を行うことができます。あるいは、最適化と本実験を同時に行うことも可能です。本日実演するように、私はGFPをコードするプラスミドを用い、フローサイトメトリーでトランスフェクション効率を確認します。しかし、siRNAの導入やリアルタイムPCRによる遺伝子発現の解析など、目的が異なる場合でも、エレクトロポレーションの手順は同じです。それでは始めましょう。本プロトコルで使用するマウス胚性線維芽細胞（MEFs）は接着細胞です。したがって、これらの細胞を扱うための最初のステップは、トリプシン化を含む標準的な組織培養プロトコルを用いて、フラスコの底から細胞を剥離させることです。細胞がフラスコから剥離した後、血清を含む培地でトリプシンを中和し、50 mLコニカルチューブに細胞を回収します。回収後、細胞を遠心分離してペレット化します。既知量のPBSに再懸濁して細胞を洗浄してください。完全に再懸濁させた後、エレクトロポレーション実験に1 mlあたり100万個の細胞濃度が必要であることを念頭に置いて、細胞数をカウントします。細胞数に基づいて適切な細胞数を算出し、清潔なチューブに回収します。遠心分離を行い、細胞をペレット化します。その後、上清を注意深く除きます。細胞をエレクトロポレーションバッファーに再懸濁して濃度を1 million cells/mLにし、20 µg/mLのプラスミドを添加します。プレートは96ウェルに分割されており、列は1から12、行はAからHまでラベル付けされています。4つのウェルのセット（ウェルセット）ごとに一対の電極プレートを共有しているため、それらのウェル内の細胞には同じパルスが印加されます。例えば、ウェル1A、1B、1C、および1Dは単一のウェルセット内で電気的に接続されており、すべてに同じパルスが適用されます。プロトコルが開始されると、次の4つのウェル（2A、2B、2C、2D）にはすべて2回目のパルスが印加されます。パラメータが同一であっても、96ウェルエレクトロポレーションプレートはプレートの上半分と下半分に分かれるように設定されています。そのため、プレート下部のウェル（1E、1F、1G、1H）にはすべて1回のパルスが印加されますが、これは上部のウェル（1A、1B、1C、1D）に印加されたパルスとは異なるものです。この実験では、プレートの半分のみを使用します。各ウェルセットの最初の3つのウェルには、異なる細胞齢の細胞が入っています。最上段の行Aの細胞は、5回継代されたものです。B行の細胞は9回継代されており、C行の細胞は13回継代されています。D行には、エレクトロポレーション実施前にエレクトロポレーションバッファーのみが含まれています。設定が正しいことを確認するために、プロトコルを再確認することをお勧めします。このプロトコルでは、6回の指数関数的減衰パルスに続き、6回の矩形波パルスを印加します。指数関数的減衰パルスは200 voltsから450 voltsまで増加し、すべて350 micro ferretsのみを使用します。これは、使用されるジーンパルスまたはエレクトロポレーションバッファーの抵抗値が低いためです。矩形波パルスは、電圧とパルス幅の両方が変化します。装置の静電容量設定を、エレクトロポレーション混合液のコンダクタンスに合わせる必要があります。DMEMのような、より抵抗値の高いバッファーをエレクトロポレーションに使用する場合、同様の電圧範囲を使用できますが、指数関数的減衰パルスに対しては950 µFなどのより大きな静電容量に設定してください。使用しているバッファーの最適な静電容量が不明な場合は、テストするエレクトロポレーション条件において静電容量も変化させる必要があります。次のステップでは、この実験に使用する各ウェルに、細胞とプラスミドの混合液を150 µLずつ分注します。使用する各ウェルセットの4番目のウェルには、エレクトロポレーションバッファーを満たします。プレートをロードした後、MXLプレートチャンバーにセットし、蓋を閉じます。次に、パルスボタンを押して細胞を電気穿孔します。電極装置は、選択したプロトコルで指定された条件に従い、各ウェルに順次電気パルスを印加します。すべての細胞にエレクトロポレーションを行うのに数秒かかります。パルスが完了したら、プレートチャンバーからプレートを取り出します。各ウェルから細胞を回収し、あらかじめ温めておいた培地を含む培養皿に移してください。これらの細胞は、10% FBSを添加したDMEMで培養されています。エレクトロポレーションを行わないコントロールサンプルは、残りの細胞・プラスミド混合液から採取し、エレクトロポレーション後の細胞に使用したものと同組成のプレウォーム済み培地を含む培養皿に加えます。最後に、円を描くように混ぜ合わせます。次に、プレートを軽く叩いて細胞を分散させ、37 °C、5% carbon dioxide のインキュベーター内で 24 時間培養します。その後、トランスフェクション効率を分析し、実験に最適なエレクトロポレーション条件を特定します。最適なエレクトロポレーション条件が決定したら、今後の実験に向けて2つのエレクトロポレーション手法から選択できます。研究者は、引き続き 96 well plates で細胞を処理するか、キュベットを用いてサンプルを1つずつ処理するかのいずれかを選択できます。キュベットは一度に1つのサンプルしか処理できず、96ウェルプレートの1ウェルに必要な量の4倍の容量を必要としますが、少数のサンプルのみが必要な場合は、個別のキュベットの方が安価で使いやすく便利です。Gene PulseまたはMX cellシステムは、プレートとキュベットで同一のエレクトロポレーション設定を使用できるように設計されています。プレートチャンバーの代わりに、キュベット用にはmxl shock podを使用してください。装置背面からプレートチャンバーを取り外し、ショックポッドを接続します。ショックポッドはウェル設定A、B、C、D1にプログラムされたパルスのみを供給するため、別のプログラムを選択する必要がある場合があります。保存済みのプログラムを選択するには、ホームボタンを押してください。次に、オプション3の「user protocols」を選択します。すでに正しいユーザーフォルダにいる場合は、Enterキーを押して「user protocols」を選択し、下にスクロールします。目的のプログラムをハイライトさせ、Enterキーを押してそのプログラムを選択してください。装置の準備が完了しました。プログラムを選択したので、キュベットをセットアップします。プラスミドとMEFの混合液は、前述と同様の方法で調製します。各0.4 cmのvetに、96ウェルプレートの1ウェルセットあたりに使用したのと同じ容量をロードします。1ウェルセットは4ウェルであり、1ウェルあたり150 µLのバッファーまたは細胞混合液を使用したため、1つのvetあたり600 µLのプラスミド細胞混合液を使用しました。次に、キュベットをショックポッドチャンバーにセットし、「pulse」ボタンを押して細胞に電気ショックを与えます。エレクトロポレーション後、プレート法の操作と同様に細胞を混合し、あらかじめ加温した培地を満たした細胞培養プレートに分注します。エレクトロポレーションを行わないコントロール用のウェルも設定してください。最後に、プレートを swirling（旋回）させ、軽くタッピングします。その後、細胞を37°C、5% carbon dioxideの条件下で24時間放置して回復させ、トランスフェクション後の細胞の回復を待ってからトランスフェクション効率を分析します。トランスフェクション効率を、エピ蛍光顕微鏡を用いて定性的に、またフローサイトメトリーを用いて定量的に分析します。エレクトロポレーションに成功し、GFP遺伝子を発現している細胞は、エピ蛍光顕微鏡下で緑色に見えます。ここに典型的な成功例を示します。位相差顕微鏡で細胞を観察することで、トランスフェクションされた細胞とされていない細胞の両方を可視化できます。ここでは、200 Vという最も低い電圧でエレクトロポレーションパルスを負荷した細胞を示しています。細胞密度が高いため、細胞はほぼコンフルエントな状態です。同一視野をエピ蛍光顕微鏡で観察すると、多くの細胞がGFPマーカーを発現していますが、これらは250 Vの時の前の画像に見られた細胞のごくわずかな割合にすぎません。位相差顕微鏡で観察される生存細胞の総数は、エピ蛍光観察下ではわずかに減少します。印加電圧が最大である375 Vにおいて、GFP発現細胞の数が増加していることがわかります。生存細胞の可視数は減少していますが、残存細胞の大部分がGFPを発現しています。どの条件が最適かは、実験設計によって異なります。ある実験では、トランスフェクションされた細胞数が最大であることが最適となる場合があります。また別の実験では、トランスフェクション効率（パーセンテージ）が最高であることが最適となる場合があります。各条件下でGFP陽性となる細胞の割合と、細胞の継代数に伴いその割合がどのように変化するかに注目します。フローサイトメトリーを用いることで、異なる各エレクトロポレーション条件におけるトランスフェクション結果に関する定量的な情報を得ることができます。ここでは、継代におけるGFP陽性細胞の割合を示します。5つの細胞。12種類のエレクトロポレーション条件のうち、最大 transfection 率はおよそ80%であり、これは最高電圧の指数関数的減衰（exponential decay）を用いた条件6および、電撃前の細胞継代を9回行った最強の方形波パルス条件12において観察されました。トランスフェクション率の全体的なパターンはほぼ同一ですが、示されているトランスフェクション率はごくわずかに低下しています。以下は継代13代目の細胞におけるGFP陽性細胞の割合であり、若い細胞と比較してトランスフェクション率が著しく低下していることがわかります。最高のトランスフェクション率でも若い細胞で達成された値の約半分にとどまっており、分離後できるだけ早く健康な細胞を使用することの重要性が示されています。以上で、MXLエレクトロポレーションシステムを用いて、MAPsやその他の初代細胞株に最適なエレクトロポレーション条件を特定する方法を説明しました。この手順を行う際は、分離後できるだけ早く健康な細胞を使用すること、および使用するエレクトロポレーションバッファーに適合したエレクトロポレーション条件を選択することが重要です。これで全てです。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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