のライブイメージングキイロショウジョウバエ胚性血球移行

ショウジョウバエの血球は胚の全体にわたって分散させる。このプロトコルは、蛍光標識した血球で胚を使用してこれらの移行をマウントし、イメージする方法を示します。

このビデオでは、ショウジョウバエの胚をイメージングするためにマウントする手順を説明しています。彼らの胚性マクロファージ。胚は、産卵ケージ内のリンゴジュース寒天プレートにハエによって一晩置かれます。

翌日、アグリプレートを取り外し、胚をアグリプレートから細胞ストレーナーに洗浄し、さらに洗浄して破片を取り除きます。胚を含む細胞ストレーナーは、漂白剤に沈められて胚をコーティングします。漂白剤を洗い流した後、胚を水滴に移します。

次に、水滴を吸引し、胚をハローカーボンオイルで覆います。目に見えるHe細胞を有する適切にステージングされた胚は、2つの貼り付けられたカバースリップの間の膜ごとにペトリに移され、油中で慎重に整列されます。次に、3枚目のカバースリップを胚の上に置き、ネイルワニスで所定の位置に接着します。

胚内の血球の運動性は、顕微鏡上の最上部のカバースリップを通じて画像化できるようになりました。こんにちは、ソウルのレンタル部門のブライアン・ストルム研究室とキングス・カレッジ・ロンドンの分子生物物理学のジェニファー・ザイドです。私は、バース大学生物学・生化学部ウッドラボのイアン・エバンスです。

今日は、Josephs bryoをこの生物の胚性マクロファージである生体画像、血液部位にマウントする手順をお見せします。この手順を使用して、これらの重要な免疫細胞に対する発生的分散および風の応答と、それらがこれらのプロセスを実行するために利用する細胞骨格機構を研究します。それでは始めましょう。

この手順は、UAS制御下で、血細胞特異的なgal fourドライバーおよび遺伝的にコードされた蛍光レポーターを含む適切なTRO、OALラインを取得することから開始します。ここでは、蛇のガル4を使用して、UASレッドスティンガーからの蛍光赤色核マーカーの発現を駆動します。推奨されるGALの4つのドライバーとUASコンストラクトの範囲については、付属の書面によるプロトコルを参照してください 置くケージに各性別のショウジョウバエを配置します。

敷設ケージは、プラスチックチューブの底に取り付けられた55ミリリットルのリンゴジュースアグリプレートで構成され、もう一方の端をガーゼで覆って空気の流れを確保します。あるいは、穴が開いた単純なプラスチック製のピーカーを使用することもできます。基部に穿孔し、ハエが新しい予熱リンゴジュースの火格子に変化して順応した後、少なくとも2日間、ハエが産卵ケージに順応し、ハエが摂氏25度で一晩置くことができるようにします。

より目立たないように病期分類された胚の収集に関する情報については、添付の書面によるプロトコルを参照してください。ハエが産卵に適切な時間インキュベートされたら、ウォッシュボトルを使用してプレートに約3ミリリットルの水を適用します。次に、柔らかい先端の絵筆を使用して、リンゴジュースから胚を取り除き、ビーカーの上に細胞ストレーナーをかざしている肉眼で簡単に、脱落した胚を見ることができます。

リンゴジュースの水を細胞ストレーナーに注ぎ、胚を採取します。次に、リンゴジュースに水を追加します。アーテ。所望の数の胚が収集されるまで、濾過プロセスを繰り返す。

次に、ウォッシュボトルを使用して、細胞ストレーナー内の胚を約10ミリリットルの水で洗浄します。胚を洗浄したら、細胞ストレーナーをリンゴジュースの蓋に置きます エアレート。細胞ストレーナーに胚を懸濁させるのに十分なきちんとした漂白剤を加えて、胚をコーティングします。

細胞ストレーナーとペトリ皿の蓋を解剖顕微鏡に移し、胚の装飾を追跡します。明視野照明下では、背側付属器が溶解すると装飾が完了し、これは2分以内に行われるはずです。装飾が完了したら、胚を含む細胞ストレーナーを漂白剤から取り外し、再びストレーナーをビーカーにかざします。

ウォッシュボトルを使用して、残留漂白剤をやさしく、しかし徹底的に洗い流します。細胞ストレーナーの下側に青色の実験用ティッシュを塗布し、残りの水分を拭き取ります。青色が白またはピンクに変わった漂白剤が残っている場合は、洗濯を続け、漂白剤の痕跡がすべて取り除かれていることを確認してから、次の手順に進みます。

細胞ストレーナーから余分な水分を取り除くと、次のステップで絵筆で胚を拾いやすくなります。胚からすべての漂白剤を取り除いたら、細い絵筆でペトリ皿の蓋に水滴を置きます。ストレーナーからコーティングされたすべての胚を採取し、液滴に再懸濁します。

次に、細胞ストレーナーの外側にケムワイプを塗布して、胚を乾燥させます。胚が乾燥したら、ハロカーボンオイルを一滴、700個加えてすべての胚を覆います。次に、胚を含む液滴に隣接して2番目の小さな油滴を置きます。

蛍光解剖顕微鏡で胚を検査します。目的の遺伝子型の適切に病期分類された胚を同定して、細胞の横方向の移動を画像化します。腹側の正中線上。

ステージ13〜14の胚を選択します。この例では、細胞は蛍光核によって識別され、頭の中や腹側神経索に沿って見え、胚上に分散した後の血液の運動性を画像化するために背側血管が発達しています。ステージ15の胚を選択します。この段階では、ヘモは胚全体に分散しています。

ただし、正中線からの横移動後、胚の腹側に3本の平行な血液線が見えるはずです。胚を選択したら、湾曲した5番の時計用鉗子を使用して、選択した胚をすくい上げます。バイアルの膜に穴を開けないように注意してください。

次に、50ミリメートルのペトリパーマルマックス皿の下側にある2滴目の油に胚を置きます。ハローキャロンオイル700の小さな一滴を約1センチ離して2滴置きます。解剖顕微鏡の明視野照明下で各滴にカバースリップを塗布します。

湾曲した鉗子を使用して、最大15個の胚を慎重に移植します。胚の腹側を上にして、カバーの端と平行に合わせます。胚が少量の油滴で整列するとスリップし、2つのカバースリップの間に均質な層を形成するために胚が広がるようにします。

オイルが広がった後、これには数分かかる場合があります。胚がまだ腹側にあることを確認してください。胚がわずかに転がっている場合は、横を上にします。

鉗子でそれらを再度再配置します。最後に、3番ピンセットを使用します。胚の上に3番目のカバースリップを置きます。

以前に接着した2枚のカバースリップを埋めます。このカバースリップをカバーに接着します。マニキュアを使用したスリップサポート。

これで、胚をイメージングする準備が整いました。このSRP gal 4 UAS Red Stinger胚を腹側を上にしてマウントし、ライカM2 0 5蛍光解剖顕微鏡でタイムラプス画像を取得しました。彼の細胞は、赤い標識された核によって視覚化されます。

映画は、発育のステージ12から13で、細胞が頭を離れて腹側正中線を下って移動するところから始まります。約1時間後、彼のサイトは正中線から移動し始め、腹面に沿った横方向に分散します。開発の残りの部分について。

ヘモサイトは非常に活性で、胚全体に移動します。ジョセフ胚を監視して動きを追跡する方法、または生体内で生きている血液側を展示する方法を示す必要があります。この手順を行うときは、胚を慎重に取り扱うことが重要です、特にペトロパーマ皿では、胚が油に入ると、脱水症状に対して比較的耐性がありますが、コリオンを取り除くときは胚を長時間漂白しないように注意する必要があります。

最後に、いくつかの胚をマウントすることで、ライブイメージングに最適な向きの胚を得る可能性を最大限に高めることができます。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。