Name: イメージングのミスマッチ修復とのDNA損傷に対する細胞応答枯草菌 /em (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-08T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 学ぶ、Bacillus subtilisを用いたDNAミスマッチ修復タンパク質のGFP融合によるリアルタイムイメージング法。この手法は生細胞内のDNA損傷応答メカニズムの動態解析に有用である。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者は、博士に感謝したい。最初に蛍光顕微鏡でLASを訓練するためのPhilina S.リーとアランD.グロスマン。著者らはまた、博士に感謝します。ヘルプとイメージングのためのヒントについてはメラニーBerkmenと肇小林。この作品は、文学、科学芸術の大学から、ミシガン大学、分子細胞、および発生生物学の部門からの資金投​​入を開始することによってサポートされていました。

顕微鏡の細胞の成長文化 1。一または二日には、イメージングの前に、Bを用意する枯草菌では、可視化したい翻訳融合タンパク質を含む菌株。ステップ1Aおよび1Bの試験のラウンドは、成長条件があなたの株の最高の画像を提供しているかを判断するために必要となります。ほとんどの場合、細胞は対数増殖期の間に撮像することがあります。 <ol class="ualpha"><li>いくつかのBの枯草菌の菌株（特に、不完全にその内因性遺伝子座での関心とGFPの遺伝子との間の翻訳融合の統合による成長株）、画像への2日前の初期成長は、高品質の画像のために必要です。初日に、ストリークB.枯草菌は、抗生物質（複数可）を含むLB寒天培地上に結像されるひずみと30℃で一晩インキュベート二日目に、単一のコロニーを0.85％生理食塩水100μlを接種し、30℃で一晩インキュベートした各希釈液100μLをめっきLB寒天プレート上で3つの10倍段階希釈液（選択的な抗生物質）、、℃を実行三日目に、細胞の光密集成長による希釈プレートを選択します。板上に光密集成長が潜在的に（ステップ4を参照）、優れた画像処理結果を得るために、健康、指数関数的に成長しているスターター接種した培地を提供します。このステップでは、染色FM4 - 64で最高品質の膜のイメージングのために特に有用である。 </li><li>他のB.枯草菌の菌株は、単に無菌スティックイメージングの前に一日で、単一のコロニーのための選択LB寒天培地に塗布され、30℃で一晩インキュベートすること翌日、このプレート上の細胞は、（ステップ4を参照）イメージングのための接種物として使用することは十分になります。 注：Bの枯草菌は 、液体培地で一晩培養では起因する遅滞期の成長 1 の長期間の原因となる胞子形成とクォーラムの応答、の組み合わせに適しているわけではありません 。 </li></ol> 2。イメージング、125mLの滅菌三角フラスコにS7 50 1から3培地の代わりに10mLの日の朝。 3。接種を得るために、単一コロニーまたは光コンフルエントの細胞を含むLB寒天プレートからS7 50培地2 mLまでの細胞を再懸濁します。 4。 0.1〜〜0.08の600nmで測定された初期の光学密度（OD 600）との文化のための10mLのS7 50培地を入れた三角フラスコに十分なS7 50中期細胞接種を追加。このステップでは、それは少なくとも10倍空気媒質の比にしておくことが重要です。従って、我々は125 mLの三角フラスコに接種した培地を10〜12.5mlのを使用してください。 5。文化は、OD 600を 〜0.5から0.8に達するまで30℃でそれぞれの文化を育てる。揺れ水浴を150から200までから毎分回転数で好ましい。 DNA損傷または不整合誘導剤で攻撃の文化は（表1参照）初期の指数増殖期細胞は、治療のために必要とされる成長の追加の期間でOD 600のターゲットに到達するようにOD 600になっているはず 例えば、2 -アミノプリンは、治療の一時間を必要とするため、2 -アミノプリンで治療された文化は、OD 600になっているはず〜0.3から0.4まで、このようなOD 600の治療/成長の結果の一時間いる〜0.5から0.8、それによって細胞がイメージングのための準備が整いました。 サンプル準備 1。ピペット1.5 mlマイクロ遠心チューブに培養細胞を300μl。 2。細胞膜のイメージングが必要な場合は、1 mg / mLの原液から各サンプルに汚れFM4 - 64膜（Invitrogen社）の1:1000希釈を追加。 FM4 - 64の滴定は、所望の蛍光信号を達成するために必要な場合があります。典型的な滴定の範囲は1:100、1:1000、および1:10,000です。 3。サンプルは最大10分間、室温で座ることを許可またはスライドは以下に述べるように培地1X Spizizensの1％アガロース（"スライドの準備"​​のステップ1を参照）を用いて調製されている間。 4。細胞の濃度が必要な場合、我々は、真空装置と、0.2μmフィルターを用いてフィルタリングセルを好む。その後、細胞を穏やかにPBS、別の適切な緩衝液または可視化に先立って培地とフィルターの表面から洗浄することができます。 スライドの準備 1。 1X Spizizensを1％アガロースを準備します。 5 0.5 Gアガロースと共に10X SpizizensストックのmLの45ミリリットルddH2Oに、そして溶融にマイクロ波を追加。ホット溶融アガロースは、ピペッティングすることは困難であり、アガロースがピペットの先端を入力しません固化。アガロースが〜55から65までの温度° Cまで、それは内に固化せずにピペットチップを入力するための水浴中で平衡化してください先端。 2。 1％はピペットの先端にアガロースを融解とSpizizensの20μlを描く。ピペット浅いアガロースパッドを形成するために、各スライドにアガロース溶液の一滴（約1〜2μL）も（我々は15ウェルスライドを使用して、表2を参照）。アガロースは、すぐに固化される。スライドは、細胞のアプリケーションの直前に行​​う必要があります。アガロースパッドを単独で室温で放置されている場合、それらは数分で脱水し、使用できなくなることがあります。 アガロースパッドが中央にしても、それぞれを埋めるがカバースリップの中断を回避するために最小の高さを持っている必要があります。、液滴が高すぎる（バブル的）またはサンプルはうまく境界を越えて広がる場合キムワイプでよくきれいなだけでスワイプして、適用新しいアガロースパッド。 3。各アガロースパッドの上に分散し、スライド全体を300μlのサンプルを（ステップ6を参照）を適用します。細胞のこの量は、スライド上の各ウェルをカバーする十分なはずです。 4。約10分間（23℃）、室温で座っているセルを搭載したスライドを許可する。このステップでは、アガロースパッドが撮像のために動かないで準備に落ち着くために細胞が可能になります。特別なニーズのためにこの温度は、温度シフト4を必要とする実験を行う際に、例えば、変更が必要な場合があります。 5。パッド自体を削除せずに、各ウェルからの過剰なメディアを離れて吸引除去する。 6。スライドの領域を越え、しっかりと均等に、かつ慎重に押して、スライドにカバースリップを適用します。カバーガラスがスライドに対して、カバースリップがスライド上に上げていないことが確認してください。 細胞の可視化 1。多くの異なる蛍光顕微鏡で問題なく動作します。それは、100X油浸レンズを持つことが重要です。シモンズラボは、使用しています。 <ul><li> 1,45 NA TIRFM 100Xの油浸対物レンズを搭載したオリンパスBX61顕微鏡</li><li>浜松ORCAR 2 CCD冷却カメラ</li><li>ルーメン200アークの金属（前）光源。 </li><li> GFP（FITC）、フィルタ励起460から500と放射510から560を検出するための</li><li> FM4 - 64の検出（TRITC）に対して、フィルタ励起510〜560および発光572〜648。 </li><li>画像はSlideBook 4.2（図1）を使用して捕獲された</li></ul> 2。白色光を使用してフォーカスに細胞をもたらす。 3。各蛍光体のために適切なフィルタを使用してイメージをキャプチャします。 代表的な結果代表的なイメージが（図1）が表示されます。 FM4 - 64染色4-7を明るくクリアになるはずですがGFP病巣は、明確に定義する必要があります。 GFPまたは膜の画像は、データを失うことなく、提示される最高品質の画像を可能にするために、任意の色を持つ擬似着色することができます。 <img src="/files/ftp_upload/1736/1736fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1：Bの代表的なGFPの画像 FM4 - 64膜の染色が赤で表示されている間、 枯草菌の翻訳融合タンパク質を。GFPタンパク質は、緑色で表示されます。白いスケールバーは3μmを示している（）MutS - GFP [関連する遺伝子型：mutS - GFP（SPC）、amyE：：Pspac mutL（猫 ）] 600μg/ mLの2 -アミノプリンおよび1mMのIPTGの存在下で行われる。 FM4 - 64信号がより明確にMutS - GFP病巣を示すために提示されない（B）MutL - GFP [関連する遺伝子型：mutL：：mutL - GFP（SPC）]。。2 -アミノプリンの存在下で（C） DnaX - GFP [関連する遺伝子型：dnaX：：dnaX - GFP（SPC）]。 （D）のRecA - GFP [関連する遺伝子型：recAの：：recAの- GFP（SPC）] 20 ng / mLのマイトマイシンCの（E）TAGC - GFP [関連する遺伝子型の存在下で：TAGC：：TAGC - GFP（SPC） 】1μg/ mLのマイトマイシンCの存在下で<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td>治療/濃度または量</td><td>機能</td><td>インキュベーションの時間</td></tr><tr><td>マイトマイシンC（MMC）[20〜150 ng / mLの] </td><td> DNAアルキル化剤</td><td> 1時間</td></tr><tr><td> 2 - アミノプリン（2 - AP）[600μg/ mLの] </td><td>ミスマッチの誘導</td><td> 1時間</td></tr><tr><td>ヒドロキシウレア（HU） </td><td> dNTPを枯渇させる</td><td> 3時間</td></tr><tr><td>紫外線（UV）20 J/m2 </td><td>チミン - チミンダイマーと6-4光産物</td><td> 20秒通常は、ソースによって異なります</td></tr><tr><td>グレー（電離放射線）5〜100 Gyの</td><td>二本鎖切断、一本鎖切断及び塩基損傷部位</td><td>ソースによって異なります</td></tr></tbody></table>DNA損傷とミスマッチ誘導治療の "&gt; 表1。サマリー <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（省略可能） </td></tr><tr><td> Multitest社スライド、15ウェル</td><td> MPのバイオメディカル</td><td> 6041505E </td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡のカバーガラス</td><td>フィッシャー</td><td> 12から544 - B </td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>フィッシャー</td><td> BP160 - 500 </td><td></td></tr><tr><td>マイトマイシンC </td><td>シグマ</td><td> M0503 - 2mgを</td><td>変異原性、摩耗の手袋</td></tr><tr><td> 2 - アミノプリン</td><td>シグマ</td><td> A3509 - 250mgの</td><td>手袋</td></tr><tr><td>ヒドロキシウレア</td><td>シグマ</td><td> H8627 - 25G </td><td>手袋</td></tr><tr><td> FM4 - 64 </td><td>インビトロジェン</td><td> T13320 </td><td>敏感な光</td></tr></tbody></table> 表2。特定の試薬 ​​と機器のリスト：

<ol><li>Hardwood, C. R., Cutting, S. M. Molecular Biological Methods for Bacillus. , John Wiley and Sons. Chichester. (1990).</li>
<li>Berkmen, M. B., Grossman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+organization+of+the+Bacillus+subtilis+replication+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle.</a> Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).</li>
<li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clp+and+Lon+proteases+occupy+distinct+subcellular+positions+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).</li>
<li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+is+required+for+the+RecA+localization+response+to+DNA+damage+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).</li>
<li>Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((b+Clamp+Directs+Localization+of+Mismatch+Repair+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis.</a> Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).</li>
<li>Simmons, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+responses+to+double-strand+breaks+between+Escherichia+coli+and+Bacillus+subtilis+reveals+different+requirements+for+SOS+induction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction.</a> J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).</li>
<li>Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+mismatch+repair+in+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of mismatch repair in bacterial cells.</a> Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).</li>
</ol>

試行錯誤は、各株の最高品質の画像の露光条件を見つけるために必要とされ、我々は100〜2000ミリ秒のエクスポージャーはGFP（FITC）とFM4 - 64（TRITCに適している間に1ミリ秒は、白色光の画像に適していることを見つける）のイメージ。露光時間は、使用するイメージング機器によって異なります。複数の系統が同じスライド上に存在する場合、パッドの国境から細胞のパッドの品質と拡散は、ひずみの差別化を複雑にする可能性があるので我々は、最も簡単なイメージングのための15ウェル顕微鏡のスライドごとに株の使用をお勧めします。画質は、直接細菌が休んでいるアガロースパッドの品質に依存します。最高品質の画像は、細菌が並んでいるアガロースパッドから取得されます。単分子層を防止する、茂みに細菌細胞を引き起こすパッドは、貧しい人々の画像が生成されます。脱水なパッドが正常に休ませる細胞を許可しない一方厚すぎるパッドは、高いバックグラウンド蛍光シグナルが生成されます。これらのアガロースパッドの欠陥は、通常、非常に悪い画質になります。井戸が悪い画像を生成している場合、単に次のウェルに移ります。それは、画像あたり50〜200個の細胞を捕捉するために理想的です。蛍...

特定のソリューションのレシピ1： 10倍S7 50塩 0.5 MのMOPS 100mMの硫酸アンモニウム 50mMのリン酸二水素カリウム 滅菌フィルター処理、および保管前にラップS7箔で50メディア 100xの金属 0.2 MのMgCl 2 70 mMのCaCl 2を 5mMのMnCl 2を 0.1mMのZnCl 2を 100μg/ mlのチアミン塩酸 2mMの塩酸 0.5mMのFeCl 3の * 最終的なボリュームへのdH 2 O *のFeCl 3を沈殿を防ぐために、最後に追加する必要があります。 箔のフィルターの滅菌後、ラップ100 ×メタルソリューション。 S7 50メディア 1X S7 50塩 1X金属 1％のグルコース 0.1％グルタミン酸 40μg/ mLのトリプトファン 40μg/ mLのフェニルアラニン 最終的なボリュームに蒸留H 2 O 10倍Spizizens（グラム/ L） 151.4 mMの硫酸アンモニウム（20グラム/ L） 803.8 mMのリン酸二水素カリウム（140グラム/ L） 440.9 mMリン酸カリウム二塩基性（60グラム/ L） 34.0 mMクエン酸ナトリウム（10グラム/ L） 16.6 mMのMgSO 4を （2G / L） 最終的なボリュームへのdH 2 O 滅菌フィルタリング

イメージングのミスマッチ修復とのdna損傷に対する細胞応答枯草菌</em

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

原核生物と真核生物の両方の生理的変化の複雑なセットを介してDNA損傷に応答する。遺伝子発現、既存の蛋白質の再分配、及び新たなタンパク質複合体のアセンブリの変化は、DNAの損傷とミスマッチDNAの塩基対の種々の方法によって刺激することができる。蛍光顕微鏡は、DNA損傷にと生きている細胞の複雑な細胞内のアーキテクチャの中でDNAの複製の状態を監視するために、これらおよび他の応答を可視化し定量化するための強力な実験ツールとして用いられている。蛍光レポータータンパク質とDNA複製と修復機構のコンポーネント間の翻訳融合は、手がかりを決定するために使用されているその同族病変の標的DNA修復タンパク質<em&gt; in vivoで</em&gt;そしてこれらのタンパク質が細菌細胞内で編成されているかを理解する。さらに、DNA損傷誘導性プロモーターに連結された転写と翻訳融合は、集団内の細胞は遺伝毒性ストレス応答を活性化されているいるを明らかにした。このレビューでは、我々は、画像にDNAの修復と、単一の細菌細胞のDNA複製複合体のアセンブリを蛍光顕微鏡を使用するための詳細なプロトコルを提供しています。特に、この作品は、イメージングのミスマッチ修復タンパク質、相同組換え、DNA複製とSOS誘導性蛋白質の焦点を当て<em&gt;枯草菌</em&gt;。ここで説明する手順のすべては、細菌種の様々なイメージングのタンパク質複合体に対して容易に適している。

詳細なプロトコルは、イメージングのためのDNA修復複合体のリアルタイムの形成を説明しています<em&gt;枯草菌</em&gt;細胞。

イメージングのミスマッチ修復とのDNA損傷に対する細胞応答枯草菌</em

原核生物と真核生物のいずれにおいても、一連の複雑な生理学的変化を通じてDNA損傷に応答します。遺伝子発現の変化、再分配...

ミスマッチ修復の翻訳融合タンパク質を発現するBaus TLU株。GFPと融合させたタンパク質を選択培地にストリークします。ストリークした細胞を、液体培養への新鮮な接種源として使用します。OD 600が0.3から0.4になるまで細胞を培養し、必要に応じてミスマッチ誘導処理を施します。その後、OD 600が0.5から0.8に達するまでさらに培養し、細胞を回収します。必要に応じて膜染色剤FM 4 64を添加し、準備したアガロースパッド付きのスライドに細胞を滴下し、余剰な培地を吸引除去して静置させます。カバーガラスを被せ、顕微鏡で細胞を観察します。こんにちは、ミシガン大学アンアーバー校の分子・細胞・発生生物学研究科、Lyle Simmons博士の研究室に所属しているAndrew Kow博士です。本日は、Bacillus subtilisにおけるDNAミスマッチ修復タンパク質、およびその他の修復タンパク質やリボソームタンパク質の翻訳融合物の可視化に用いられる手法をご紹介します。この手順を用いて、Bacillus subtilisの生細胞内におけるDNAミスマッチ修復タンパク質とリボソームタンパク質の相互作用を解析します。それでは、始めていきましょう。まず、可視化したい翻訳融合タンパク質を発現するB. subtilis株を、必要に応じていくつかの株分準備します。イメージングの1日前から開始することで十分です。例えば、MU LGFPのように、GFPと目的遺伝子の翻訳融合が遺伝子の内在性遺伝子座に組み込まれた際に良好に増殖する菌株などがこれに該当します。イメージングの1日前に開始する場合は、無菌状態で滅菌スティックを用い、選択性LBアグロ培地プレートに細菌を塗布してください。単一コロニーを形成させるため、30 °Cで一晩インキュベートします。翌日、これらのコロニーをスターター接種源として使用します。一部のB subtilis株では、高品質な画像を得るための顕微鏡観察に先立ち、2日間の培養が必要です。2日間の培養を必要とする特定の株は、rec A GFPなどの翻訳融合により増殖が不十分なものです。初日に、選択的LB AED培地に細菌をストリークし、一晩インキュベートします。2日目に、段階希釈を行います。まず、単一のコロニーをピックアップして100 µLの0.85%生理食塩水に接種し、次に10倍段階希釈を4回行います。各希釈液、および開始時のコロニーと生理食塩水を100 µLずつ、選択性抗生物質を含むLB寒天培地に塗布します。通常30 °Cで一晩インキュベートします。2回目のオーバーナイト培養後、細胞が軽くコンフルエントに増殖している希釈プレートを選択してください。これにより、健康で対数増殖期のスターター接種源が得られ、優れたイメージング結果を得られる可能性があります。これは、膜染色の最高品質のイメージングにおいて特に有用です。FM 4 64を用いたイメージングの当日の朝に、125 milliliterの滅菌フラスコに10 millilitersのS seven 50培地を分注します。これにより、空気と培地の比率を少なくとも10倍に維持します。単一コロニーまたは同程度のコンフルエンスの細胞を含むlpplから、最大2 mLのS seven 50培地で細胞を再懸濁し、接種液を調製します。10 mLのS seven 50培地を含むエルレンマイヤーフラスコに、培養液の初期OD 600が約0.08〜0.1になるように、十分な量のS seven 50培地細胞接種液を加えます。次に、イメージングを行うBサブリスト株に適した温度で各培養物を増殖させます。回転数は150から200 rpmに設定した振とう恒温槽の使用が推奨されます。OD 600が約0.5から0.8に達するまで、培養を継続します。DNA損傷剤またはミスマッチ誘導剤で処理する培養系では、DNA変異剤によるインキュベーション期間の終了が、目標とするOD 600に達するタイミングと一致するように処理を計画してください。例えば、ゲノムに取り込まれるとミスマッチ塩基を模倣するDNAベースのアナログである2-アミノプリンは、1時間のインキュベーションが必要であり、mut LGFPなどのミスマッチ修復タンパク質のフォーカス形成を誘導します。一方で、REC A GFPのフォーカス形成には、二本鎖DNA切断を誘導するために、マイトマイシンCまたはその他のDNA損傷試薬による1時間のインキュベーションが必要です。これらは、2-アミノプリンおよびマイトマイシンCの両方が添加されます。培養液のOD 600が約0.3から0.4に達し、いずれかの処理で規定の1時間の増殖を経た後、培養液のOD 600はおそらく0.5から0.8に達しており、イメージングが可能な状態になります。まず、300 µLの培養細胞を1.5 mLマイクロ遠心チューブにピペットで分注します。細胞膜のイメージングを行う場合は、各サンプルに1 mg/mLのFM 4 64膜染色試薬を1:1000の希釈倍率で添加しますが、目的の蛍光信号を得るためにFM 4 64のタイトレーションが必要になる場合があります。一般的なタイトレーション範囲は、1対100、1対1,000、または1対10,000です。スライドの準備が整うまで、あるいは最大10分間、サンプルを静置してください。細胞濃度の測定が必要な場合は、真空装置を用いて0.2 µmフィルターで細胞をろ過してください。次に、細胞サンプルのインキュベーション中に、適切なバッファーまたは培地でフィルターから細胞を静かに洗い流します。FM 4 64を用いて、10 x ZENストック5 mLを蒸留水45 mLに加え、さらに0.5 gのアガローズを加えて電子レンジで加熱・溶解させ、1%アガローズの1 x ZEN溶液を調製します。アガロースの温度をウォーターバスで約65 °Cに調整し、1%の融解アガロースを20 µLピペットチップに吸い取ります。アガロースが高温すぎるとピペッティングが困難になり、低温すぎると凝固してピペットチップに入らなくなります。次に、Multitest 15ウェルスライドを使用し、各ウェルにアガロース溶液を約1〜2 µLずつ1滴ずつピペットで分注します。浅いアガロースパッドを形成させます。アガロースは即座に凝固します。脱水によるスライドの使用不能を防ぐため、スライドの準備は細胞の播種直前に行います。arosパッドは各ウェルの中心に配置し、ウェルを満たすようにしますが、カバーガラスを乱さないよう高さは最小限に抑えてください。液滴が高すぎる場合や気泡状になった場合、あるいはサンプルがウェルの境界を超えて広がった場合は、キムワイプでウェルをきれいに拭き取り、新しいarosパッドを適用してください。スライドの準備が整ったら、マイクロ遠心チューブに分けておいた300 µLのサンプル全量をスライドに滴下し、各aerosパッドの上にサンプルを分散させます。この細胞量で、スライド上の各ウェルを十分にカバーできるはずです。細胞をロードしたスライドを、室温で約10分間静置します。この工程により、細胞がagrosパッド上に沈降して固定され、10分間のインキュベーション終了時にイメージング可能な状態になります。パッド自体をen取り除かないように注意しながら、各ウェルから余分な培地を吸引して除去します。カバーガラスをスライドガラスに載せ、スライド全体の領域にわたって、しっかりと均一に、かつ優しく押し当てます。この際、カバーガラスがスライドガラスに密着し、浮き上がっていないかを確認してください。多くの異なる蛍光顕微鏡で適切にイメージングを行うことができます。100倍の油浸レンズを使用することが極めて重要です。Simmons研究室では、全反射照明、蛍光顕微鏡法、またはTIRFMに適した開口数1.45の100倍油浸対物レンズを備えたOlympus BX 61顕微鏡を使用しています。この顕微鏡には、冷却CCDカメラとLU 200アーチメタル光源も備わっています。まず、白色光を用いて細胞に焦点を合わせます。各蛍光標識に応じて適切なフィルターを使用してください。GFPの検出にはフィルター4を使用します。FM 4-64の検出には、励起フィルター510〜560、および蛍光フィルター510〜560を使用してください。励起フィルター510〜560、および蛍光フィルター572〜648を使用します。各層に適したフィルターを用いて画像をキャプチャします。スライドブック4.2ソフトウェアを使用して4枚撮影します。以下は、GFPと翻訳融合させたDNAミスマッチ修復タンパク質MU Lをイメージングした代表的な結果です。MU LGFPの未処理コントロール培養では、フォーカスは最小限であり、ほとんどの細胞でmut LGFP融合タンパク質が細胞質レベルでしか検出されません。しかし、ゲノムに組み込まれた際にミスマッチ塩基を模倣する2-アミノプリン存在下で培養した細胞の大部分では、GFPフォーカスが観察されます。これは、mutal GFPタンパク質がミスマッチDNA塩基の認識と修復に関与していることを示しています。DNA損傷誘導剤であるマイトマイシンC存在下で培養したrec A GFP株においても、同様の結果が得られます。ここでは、マイトマイシンC処理により、大部分の細胞にrec A GFPのフォーカスが認められ、rec A GFPがDNA損傷に反応して修復プロセスを開始したことが示されています。なお、マイトマイシンC未処理ではpho IRは見られません。以上で、生きた細胞内における修復タンパク質の可視化方法について説明しました。この手順を行う際は、時間をかけて、細胞を適切にフォーカスさせることが重要であり、これには実際に練習が必要な場合があります。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験がうまくいくことを願っております。

imaging-mismatch-repair-cellular-responses-to-dna-damage-bacillus

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、2次元アガロースゲル分析は、UV照射後に発生する複製の中間体の構造を識別するために使用できるようにするための手順を示します。...

のUV -誘発複製中間体の可視化 E.大腸菌二次元アガロースゲル分析を用いた

電子分光イメージングは、ナノメートルの分解能で核酸とタンパク質を画像化し、区別することができます。miniSOGシステムと組み合わせることで、透過型電子顕微鏡サンプル中のタグ付きタンパク質を特異的に標識することができます。これらの技術の使用を例として、二本鎖断線修復病巣を使用して説明します。...

電子分光イメージングと組み合わせたminiSOGタグ付きのDNA修復タンパク質の可視化（ESI）

このプロトコルの目標はレーザー microirradiation を使用してさまざまな種類の比較的単純な鎖切断と被害サイト体内に DNA 損傷シグナル伝達と修復因子アセンブリを勉強する、複雑な損傷を含む DNA の損傷を誘発する方法を記述することです。.

生体内で単純および複雑な DNA 損傷に対する細胞応答を研究するレーザー Microirradiation

DNA 損傷を誘発するおよび選択したサブ核領域の DNA 修理蛋白質の応答を監視するための共焦点レーザー蛍光顕微鏡とレーザ...

マイクロ レーザーの単一の試験と哺乳類細胞における二重鎖切断修復のためのアプリケーション

蛍光顕微鏡を用いた過渡的長期的な二本鎖 DNA 切断の DNA 修復プロセスの特性

ホウ素中性子捕捉療法(BNCT)に用いられる中性子混合ビームによる放射線誘発DNA損傷応答は完全には確立されていない。このプロトコルは、中性子混合ビームを照射した後のヒト大腸癌細胞株における免疫蛍光染色による修復タンパク質の放射線誘発病巣(RIF)を検出するためのステップバイステップの手順を提供する。...

ヒト大腸癌細胞におけるDNA損傷および修復病巣の免疫蛍光イメージング

DNA損傷の後、ヒト細胞はゲノムの完全性を回復するために不可欠な修復経路を活性化する。ここでは、DNA修復タンパク質を検出し、その空間的および時間的なリクルートメントを分析し、DNA損傷部位におけるタンパク質とタンパク質相互作用を問い合わせた手段として、間接的な免疫蛍光の方法を説明する。...

免疫蛍光によるDNA修復タンパク質相互作用の可視化

この記事では免疫染色とクロマチン免疫沈降の重要なステップを紹介します。これらのプロトコルは、DNA損傷関連の細胞プロセスを研究し、DNA修復に関与するタンパク質の採用を視覚化し、定量化するために一般的に使用されます。...

エンドヌクレアーゼベースの部位特異的DNA損傷の可視化と定量化

このプロトコルは、DNA損傷だけでなく、有糸分裂時にその局在化に応答して活性化されたDNA二重鎖切断シグナル伝達タンパク質を可視化するための方法を説明します。...

DNA損傷応答タンパク質の2次元および3次元生細胞イメージング

レシオメトリック二分子ビーコン（RBMBs）は、生細胞内の画像の単一操作されたRNA転写物に使用することができる。ここでは、マイクロポリアルタイムで単一のRNA転写物の蛍光イメージングによる細胞内へのRBMBsの配信、RBMBsの調製および精製を記載している。...

レシオメトリック二分子ビーコンを使用して、生細胞における単エンジニアのRNA転写物のリアルタイムイメージング

学ぶ、Bacillus subtilisを用いたDNAミスマッチ修復タンパク質のGFP融合によるリアルタイムイメージング法。この手法は生細胞内のDNA損傷応答メカニズムの動態解析に有用である。

イメージングのミスマッチ修復とのDNA損傷に対する細胞応答枯草菌

さらに動画を探す