不安定な多タンパク質複合体の単離で in vivoで制御セルラー架橋及び免疫磁気アフィニティークロマトグラフィー

架橋およびそれに続く免疫沈降について。密度80〜90%の細胞を、PBS、カルシウム、マグネシウム、またはDMSOのみを含む1 mMの氷冷DSPとともにインキュベートします。

ビークルコントロール。DSPは、12 Å（オングストローム）以内に存在する遊離または膜結合タンパク質を架橋する、還元可能なホモ二機能性膜透過性架橋剤である。架橋後、細胞を溶解し、標準的なコントロールを用いて免疫沈降を行う。

その後、還元剤によってDSPが切断され、還元SDS-PAGEでタンパク質複合体を分離することで、イムノブロットによる個々のタンパク質の同定が可能になります。こんにちは、エモリー大学細胞生物学科のVictor Fonde博士の研究室のStephanie Ickです。そして、同じくFonde研究室のPearl Ryderです。

本日は、制御された架橋反応とそれに続く免疫磁気アフィニティークロマトグラフィーを用いた、タンパク質複合体の単離手順について解説します。当研究室では、一過性の不安定なタンパク質間相互作用を研究するためにこの手順を用いています。それでは始めましょう。

まず、細胞種と具体的な実験条件を示すために、細胞プレートの底面にラベルを貼ります。ここでは、DSP処理ありを示すプラス記号と、DMSOのみのネガティブコントロール（ビークルコントロール）を記載します。細胞播種に向けて、プレートに培地を加えます。

標準的なチューブ反応あたり500 µgのタンパク質を単離できるよう、HEK細胞を1/5に希釈して播種します。質量分析の結果から免疫ブロットによって目的タンパク質の推定結合パートナーを同定する場合、1本のチューブで十分な場合があります。標準的な反応数を少なくとも10倍に増やしてください。

また、架橋実験で使用するほとんどの溶液を準備します。これには、0.1 millimolar 塩化カルシウムと 1 millimolar 塩化マグネシウムを添加した PBS（PBS calcium magnesium と称する）が含まれます。カルシウムイオンとマグネシウムイオンの添加は、細胞を培養プレートに接着させるために不可欠です。

実験期間中、溶液は4°Cで保存してください。その他のストックには、架橋剤クエンチ溶液、50X完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（ペレットが溶解するまで20分ごとにボルテックス処理を行う）が含まれます。また、4°Cで保存し1か月以内に使用すべき20% Triton X 100、ならびに10xおよび1x Buffer A溶液を用意します。

付属の書面プロトコルに従い、すべての溶液を調製し保存します。最後に、1Xバッファーに0.5% Triton X-100を加えた溶解バッファーと、1Xバッファーで構成される免疫磁気沈降バッファー（IPバッファー）を調製します。

0.1% Triton X 101を添加し、播種から2日後、細胞が80〜90%の合流度に達した状態が架橋に最適です。合流度が高すぎると、細胞が重なり合う傾向があり、細胞透過性架橋剤がすべての細胞に到達しにくくなります。架橋の準備が整うまで、プレートをインキュベーターに戻しておきます。

DSP架橋剤溶液は、細胞に適用する直前に調製してください。DSPは非常に疎水性が高いため、PBSカルシウムマグネシウムバッファーで希釈する前に、まずDMSOに溶解させて100 millimolarの濃度にします。PBSカルシウムマグネシウムバッファーへのDSPの希釈をさらに促進するため、適切な量の中和溶液を温め、そこにDSPおよびDMSOストック溶液を10 microliters添加します。

温めたPBS calcium magnesium 1 mLにつき、DSPのストック溶液を、すべて溶解するまで繰り返し混ぜながら、1滴ずつ加えます。また、PBS calcium magnesium 1 mLにつき10 µLのDMSOを含む溶媒コントロール溶液を準備します。DSPを希釈した後、すべてのPBS calcium magnesium溶液を氷水浴に置き、10分以内に使用してください。

次に、実験で使用するすべてのプレートが入る氷水バスを準備します。37 °Cのインキュベーターから細胞を含む培養プレートを取り出し、直ちに氷水バスに入れます。氷冷したPBS calcium magnesiumを用いて細胞を2回洗浄します。使用する液量は、以前にクロスリンカーでのインキュベーション用に準備したものと同様とし、6ウェルプレートの場合は1ウェルあたり2 mLとして計算してください。

2回目の洗浄後、溶媒コントロール（バッファーに溶解したDMSO）またはDSP架橋バッファー溶液のいずれかを細胞に添加し、氷上で2時間インキュベートします。その際、約20分ごとに、すべての細胞が溶液に浸っているかを確認してください。一部の細胞が露出している場合は、ディッシュを傾けて回転させ、再び均一に覆われるようにします。少量のDSPが沈殿することは正常です。

細胞との2時間のインキュベーション中、その2時間が経過する前に、ストック溶液をPBS calcium magnesiumで希釈して1X DSPクエンチ液を調製します。未反応のDSPを不活性化して架橋反応を停止させるまで、この溶液を氷上で保持してください。2時間が経過したら、細胞からビークルコントロールおよび架橋溶液を除去します。

氷冷したDSPクエンチ溶液を加え、氷上で15分間インキュベートします。その間に、完全プロテアーゼ阻害剤カクテルのストック溶液を細胞溶解バッファーで1:50に希釈します。15分が経過したら、細胞をPBS calcium magnesiumで2回洗浄します。

次に、プロテアーゼ阻害剤を含む溶解バッファーを細胞に加え、4 °Cで30分間ロッキングミキサーで撹拌します。30分間の細胞溶解後、セルスクレイパーを用いてプレートから細胞を回収します。プロテアーゼ活性を最小限に抑えるため、溶解物は必ず氷上で保持してください。

ベンチトップ型ミニ遠心機を用い、最高速度の 15,000 Gs、4 °C で細胞溶解液を 15 分間遠心分離します。上清を新しいチューブに分注し、ペレットを廃棄します。Bradford 法を用いてタンパク質濃度を分析し、免疫沈降に進みます。スクリューキャップ付きマイクロ遠心チューブで 2 時間の架橋反応を開始させた直後に、免疫沈降の準備を開始してください。

30 µLのanti IgG免疫磁気ビーズと500 µLのIPバッファーを混合します。目的のターゲットに対する抗体を加えます。抗体の適切な量は、個々の抗原ごとに決定してください。

予備実験において、ビーズの陰性コントロールとしては、抗体なし、ビーズのみ、およびIP抗体を磁気ビーズに結合させるためのアイソタイプコントロール抗体ビーズなどが考えられます。エンドオーバーエンドミキサーを用いて、室温で2時間インキュベートします。インキュベーション終了後、チューブをクイックスピンし、マグネットホルダーに挿入します。これにより、ビーズが磁石の側面に集まります。

未結合の抗体を含む溶液を除去し、ビーズの乾燥を防ぐために直ちに洗浄します。2回の洗浄後、DSP陰性またはDSP陽性細胞溶解液（1 µg/mL）を500 µL、適切なチューブに加えます。この段階で、予備実験で決定した濃度の免疫原性ペプチドを溶解液とビーズの混合物に加えることにより、ペプチド競合陰性コントロールを調製できます。

この段階で準備可能なもう一つの陰性対照として、ビーズに500 µLの溶解バッファーのみを添加した、バッファーのみまたはライセートフリーの反応液があります。実験群および対照群の反応液のビーズを穏やかに再懸濁させてください。ビーズが破壊されるため、ボルテックスミキサーは使用しないでください。4 °Cで2時間、エンドオーバーエンド回転させてインキュベートします。

2時間後、マグネットホルダーを用いて溶解液を除去します。短時間遠心分離を行い、IPバッファー1 mLで計6回ビーズを洗浄します。各洗浄において、4 °Cで5分間インキュベートします。

結合した複合体を溶出させるため、ビーズペレットの直上のIPチューブに1xゲルサンプルバッファーを加えます。チューブ底部のビーズを集めるため、チューブの底を軽く叩き、すべてのビーズをゲルサンプルバッファーに再懸濁させます。あるいは、免疫親和性単離を行う場合は、免疫原性ペプチドを添加したバッファー30 µLをビーズに加えます。

免疫原性ペプチドの必要濃度は経験的に決定します。10から200 µMの範囲でテストした後、ビーズを4°Cで2時間インキュベートし、30分ごとにチューブをタッピングします。マグネットホルダーを用いて、溶出した複合体を含む30 µLを回収して清潔なチューブに保存し、IPバッファーで洗浄した後にビーズを保存します。

両方の溶出法において、ビーズに1xゲルサンプルバッファーを添加します。ゲルサンプルバッファーに再懸濁した免疫磁気ビーズを75 °Cで5分間加熱し、タンパク質を変性させます。このステップによりDSP分子が切断され、複合体中の個々のタンパク質を分離して解析することが可能になります。

ウェスタンブロッティング用のSDS-PAGEゲルのサンプル。空になった免疫磁気ビーズは、遠心分離によって反発させ、ロード前にマグネットホルダーを用いてサンプルから除去することができる。SDS-PAGEのタンパク質染色または免疫ブロットの両方で、免疫親和性EUAにIgGが含まれていないことが確認できれば、質量分析に適している。

以下は、架橋および非架橋の細胞溶解物を用い、AP-3サブユニットに対するモノクローナル抗体を用いて免疫磁気沈降を行った後のウェスタンブロットの例です。架橋を行うことで、免疫磁気分離における非架橋サンプルでは検出されなかった相互作用タンパク質の検出が可能になります。陰性対照では、非架橋および架橋サンプルの両方において、抗体不使用およびトランスフェリン受容体に対するIgGを用いた抗体アイソタイプ一致対照を用いて、特異的なタンパク質のプルダウンは見られませんでした。

この例では、IP抗体に結合したタンパク質を回収するために、アフィニティーペプチド溶出を用いました。ペプチド溶出の間、免疫抗体は上清画分には存在せず、ビーズ画分に留まっていることに注目してください。以上で、化学架橋剤DSPを用いて不安定なMultiPro複合体を固定し、その後に免疫磁気アフィニティー精製を行うことで、これらを単離する方法を説明しました。

この手順を行う際は、架橋中の不安定な相互作用を維持し、プロテアーゼ活性を最小限に抑えるために、細胞溶液およびライセートを冷却状態に保つことが重要です。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。