不安定な多タンパク質複合体の単離で in vivoで制御セルラー架橋及び免疫磁気アフィニティークロマトグラフィー

架橋の場合、続いて免疫沈降が行われます。密度80〜90%の手順細胞を1ミリモルの氷冷でインキュベートします。PBS、カルシウム、マグネシウム、またはDMSOのみのDSP。

車両制御。DSPは、ホモ二官能性膜透過性および還元性架橋剤であり、架橋がなく、互いに12オングストローム以内を意味します。続いて、架橋細胞を溶解し、標準コントロールを用いて免疫沈降を行います。

その後、タンパク質複合体は、SDSページを縮小し、薬剤の切断されたDSPを減少させることによって分離され、免疫ブロットによる個々のタンパク質の同定が可能になります。こんにちは、エモリー大学細胞生物学部のビクター・フォンド博士研究室のステファニー・イックです。そして、私はパール・ライダーで、同じくフォンデ研究室の

本日は、制御された架橋とそれに続く免疫磁気アフィニティークロマトグラフィーを使用してmyprotein複合体を単離する手順をご紹介します。私たちの研究室では、この手順を使用して、一過性の不安定なタンパク質相互作用を研究しています。それでは始めましょう。

まず、細胞プレートの底部にラベルを付けて、細胞の種類と特定の実験条件を示します。ここでの正の記号は、処理されるDSPに負のDMSOのみの車両制御が含まれていることを示します。プレートに培地を加えて、細胞播種プレート用に調製します。

HEK細胞を1〜5希釈で播種し、標準的なチューブ反応ごとに500μgのタンパク質を単離できるようにします。質量分析からの免疫ブロットにより、目的のタンパク質の推定結合パートナーを同定するには、1本のチューブで十分な場合があります。標準反応の数を少なくとも10倍増やします。

また、架橋実験で使用したほとんどの溶液の茎を調製します。これらには、0.1ミリモルの塩化カルシウムとPBSカルシウムマグネシウムと呼ばれる1ミリモルの塩化マグネシウムを補充したPBSが含まれます。カルシウムイオンとマグネシウムイオンの添加は、細胞の培養プレートへの接着に重要です。

実験の過程で、溶液を摂氏4度で保存します。その他のストックには、ペレットが溶解するまで20分ごとに渦を巻く架橋剤クエンチング溶液50 X完全プロテアーゼ阻害剤カクテルが含まれます。20%Tritan X 100は摂氏4度で保存され、1ヶ月以内に使用する必要があり、10 xおよび1 x Buffer a溶液。

添付の書面によるプロトコルに詳述されているように、すべての溶液を準備して保管します。最後に、1つのXバッファーで構成された溶解バッファーを調製します。0.5%TRITTON X 100と免疫磁気沈殿バッファーまたはIPバッファーを1つのXバッファーで構成。

めっきの2日後までプラス0.1%TRITTON X 101、細胞は80〜90%coの流暢さであり、架橋に最適です。高流暢性条件では、細胞は互いに積み重なる傾向があり、細胞透過性架橋剤のすべての細胞へのアクセス性が低下します。架橋の準備ができるまで、プレートをインキュベーターに戻します。

細胞に適用する直前にDSP Crosslinker溶液を調製します。DSPは疎水性が高いため、DMSOに100ミリモルの濃度まで溶解してから、PBSカルシウムマグネシウム緩衝液に希釈されます。PBSカルシウムマグネシウム緩衝液へのDSPの希釈をさらに強化するために、温めて適切な容量で、10マイクロリットルのDSPおよびDMSOストック溶液を追加します。

温かいPBSカルシウムマグネシウム1ミリリットルごとに、D-S-P-D-M-S-Oストック溶液を一滴ずつ加え、すべてのDSPが溶解するまで繰り返し混合します。また、PBSカルシウムマグネシウム1ミリリットルにつき10マイクロリットルのDMSOの車両制御溶液を準備します。DSPを希釈した後、すべてのPBSカルシウムマグネシウム溶液を氷水浴に10分以内

次に、実験で使用したすべてのプレートを保持する氷水浴を準備します。細胞を含む培養プレートを摂氏37度のインキュベーターから取り出し、すぐに氷水浴に入れます。氷冷PBSカルシウムマグネシウムで細胞を2回洗浄し、以前にクロスリンカーでインキュベーションするために調製したのと同じ容量を使用して6回、ウェルプレートはウェルあたり2ミリリットルを計算します。

2回目の洗浄後。ビヒクルコントロール(緩衝液に溶解したDMSOまたはDSP架橋緩衝液)を細胞に加え、氷上で2時間インキュベートし、約20分ごとにチェックして、すべての細胞が溶液で覆われていることを確認します。一部の細胞が露出した場合は、皿を傾けて回転させ、再び均等に覆うようにすると、少量のDSPが沈殿するのは正常です。

2時間のインキュベーションが終了する前に、細胞との2時間のインキュベーション中に、茎をPBSカルシウムマグネシウムに希釈して1つのXDSPクエンチング溶液を調製します。溶液を氷上に置いたままにして、反応していないDSPを不活性化することにより、架橋反応を停止するまで溶液を使用してください。2時間が経過したら、セルから車両制御溶液と架橋溶液を取り出します。

氷冷したDSPクエンチング溶液を加え、氷上で15分間インキュベートします。その間に、完全なプロテアーゼ阻害剤カクテルストックを細胞溶解バッファーに1〜50個希釈します。15分が経過したら、PBSカルシウムマグネシウムで細胞を2回洗浄します。

次に、プロテアーゼ阻害剤を含む溶解バッファーを細胞に加え、摂氏4度で30分間振とうします。細胞溶解を30分間行った後、セルスクレーパーを使用してプレートから細胞を回収します。プロテアーゼ活性を最小限に抑えるために、ライセートを氷上に保管してください。

15, 000 Gs.Pipetteの真捷液に上清を新しいチューブにピペットでベンチトップミニ遠心分離機で摂氏4度で4°Cで15分間細胞溶解物を回転させ、ペレットを廃棄します。Bradfordアッセイを使用してタンパク質レベルを分析し、免疫沈降を進めます。スクリュートップマイクロ遠心チューブで2時間の架橋反応を開始した直後に、免疫沈降の準備を開始します。

30マイクロリットルの抗IgG免疫磁気ビーズと500マイクロリットルのIPバッファーを組み合わせます。目的のターゲットに対する抗体を添加します。抗体の適切な量は、個々の抗原ごとに決定する必要があります。

予備実験では、ビーズのネガティブコントロールとして考えられるのは、抗体なし、ビーズ、およびIP抗体を磁気ビーズに結合するためのアイソタイプコントロール抗体ビーズです。エンドオーバーエンドロッカーで室温で2時間インキュベートします インキュベーションの終了時に、チューブをすばやく回転させ、磁気ホルダーにスライドさせます。ビーズは磁石の側面に集中します。

未結合の抗体を含む溶液を取り出し、ビーズが乾燥しないようにすぐにビーズを洗浄してください。2回の洗浄後、DSP陰性細胞またはDSP陽性細胞ライセート1ミリリットルあたり1マイクログラムの500マイクロリットルを適切なチューブに加えます。ペプチド競合ネガティブコントロールは、予備実験で決定された濃度の免疫原性ペプチドをライセートビーズミックスに添加することにより、この段階で調製することができる。

この段階で調製される別の可能なネガティブコントロールは、バッファーのみ、またはビーズのみに500マイクロリットルの溶解バッファーを添加して調製したライセートフリー反応です。実験反応と制御反応のためにビーズを静かに再懸濁します。ボルテックスを渦巻かないでください、ビーズが壊れ、4度でインキュベートし、端から端まで2時間回転します。

2時間経過後、マグネットホルダーを使用してライセートを除去します。ビーズを素早く回転させ、1ミリリットルのIPバッファーで合計6回洗浄します。各洗浄液を摂氏4度で5分間インキュベートします。

結合した複合体を回避するには、ビーズペレットのすぐ上のIPチューブに1つのxゲルサンプルバッファーを追加します。ビーズをチューブの底にプールするには、チューブの底を軽くたたいて、すべてのビーズをゲルサンプルバッファーに再懸濁します。あるいは、免疫親和性単離のために、30マイクロリットルの緩衝液aをビーズに添加して免疫原性ペプチドを添加する。

免疫原性ペプチドの必要濃度は、経験的に決定されます。10〜200マイクロモルの範囲をテストした後、ビーズを4度で2時間インキュベートし、30分ごとにチューブを軽くたたきます。磁気ホルダーを使用して、逃れた複合体を含む30マイクロリットルを取り外し、IPバッファーで清潔なチューブで保存し、ビーズを保存します。

1 x ゲルサンプルバッファーをビーズに加え、両方の溶出法で対応します。免疫磁気ビーズをゲルサンプルバッファーに再懸濁し、摂氏75度で5分間加熱し、さらにタンパク質を変性させます。このステップでは、DSP分子もクリープし、複合体の実行における個々のタンパク質を分離することを可能にします。

ウェスタンブロッティング用のSDSページゲル上のサンプル。空になった免疫磁気ビーズは、遠心分離によってはじき、ロード前に磁気ホルダーでサンプルから除去することができます。免疫親和性EUAがSDSページのタンパク質染色または免疫ブロットの両方でIgGを含まない場合、質量分析に適しています。

これは、架橋細胞ライセートおよび非架橋細胞ライセートからのウェスタンブロットと、APの3サブユニットに対するモノクローナル抗体を用いた免疫磁気沈殿の例です。デルタ架橋は、免疫磁気単離中に非架橋サンプルでは見られない相互作用タンパク質の検出を可能にします。ネガティブコントロールでは、非架橋サンプルと架橋サンプルの両方について、トランスフェリン受容体に対するIgGを用いた抗体フリーおよび抗体アイソタイプマッチコントロールを使用した特異的タンパク質のプルダウンは示されませんでした。

この例では、アフィニティーペプチド溶出を使用して、IP抗体に結合したタンパク質を回収しました。免疫抗体はスーパーナト画分には存在せず、ペプチド溶出中は拍動画分に留まることに注意してください。ここでは、化学架橋剤DSPを使用して不安定なMultiPro複合体を単離し、続いて免疫磁気親和性精製を行う方法を紹介しました。

この手順を行う際には、細胞溶液とライセートを冷やして、架橋中の不安定な相互作用を維持し、プロテアーゼ活性を最小限に抑えることが重要です。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。