Name: 不安定な多タンパク質複合体の単離で in vivoで制御セルラー架橋及び免疫磁気アフィニティークロマトグラフィー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-09T17:05:05.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 学ぶDSPを用いたin vivo架橋法で不安定なタンパク質複合体を単離する手法。免疫磁気アフィニティークロマトグラフィーにより、一過的な相互作用を安定化し、細胞生物学研究に活用できます。

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この作品は、VFに国立衛生研究所（NS42599とGM077569）からの補助金によって支えられて。

1。架橋の準備<ol><li>あなたは、標準のチューブの反応あたりタンパク質500μgの単離を可能にするためにプレートに細胞の十分な数が必要になります。単管は十分な免疫ブロットによって目的のタンパク質の推定上のインターアクターの識別のためかもしれません。この場合、ビーズ結合した物質は、SDS - PAGEサンプルバッファー（免疫沈降）で溶出することができます。質量分析のために、標準的な反応の数は少なくとも10倍に増加する必要があるとタンパク質の複合体は、（免疫アフィニティークロマトグラフィー）に使用する抗体によって認識されるペプチド抗原と外の競争によって溶出されるべきである。この戦略は、免疫グロブリンの自由なタンパク質複合体の分離が可能になります。 </li><li>架橋のための最適な細胞密度は75％とコンフルエント90％の間です。高コンフルエントな条件で、細胞はすべての細胞への細胞透過性の架橋剤へのアクセシビリティを低下させる、お互いに山積みする傾向がある。 </li><li>細胞の種類や実験条件はセルプレートの底部にラベルする必要があります。我々は日常的に一人で車を持つコントロールが含まれています。 </li><li>前の架橋へのDSPソリューションを除き、すべてのソリューションを準備します。 <ol><li>のCaCl 2 0.1mMの及びCaCl 2実験を開始する前に、1mMの（PBS /カルシウム/マグネシウム）でリン酸緩衝生理食塩水バッファの株式を準備します。カルシウムとマグネシウムイオンの添加は、実験の過程で培養プレートに細胞の接着のための非常に重要です。 4℃で保存します。 </li><li> 50X完全プロテアーゼインヒビターカクテル - 1mLのMilli - Q水に溶解した1錠。 -20℃で保存</li><li> 20％トリトンX - 100 10グラムトリトンX -100を秤量および50 ml Milli - Q水の合計量に希釈する。 4℃ロック4℃一晩と店舗℃で使用するまで。 1カ月以上保存しないでください。以下に説明する溶解およびIPバッファを準備するには、この20％の株式の希釈液を使用してください。 </li><li> pHは7.4〜50倍のDSP焼入れソリューション1Mトリス。室温で保管してください。 </li><li> 10 ×バッファーの溶液を調製します。 10Xバッファー： <ul><li> 50 mLの1 M HEPES </li><li> 150 mLの5 M NaClを</li><li> 10 mLの0.5 M EGTA </li><li> 250μL2 MのMgCl 2 </li><li> 7.4にpHを調整する</li><li> 500mLに、最終容量をもたらす</li></ul> 10X Bufferは解決策は、必要に応じて1Xバッファーに希釈される。 1X Bufferは溶解液と免疫磁気降水量のバッファでも使用されます。 1Xをバッファリング <ul><li> 10mMのHEPES </li><li> 150mMのNaCl </li><li> 1mMのEGTA </li><li> 0.1mMのMgCl 2の </li><li> pH7.4の</li></ul></li><li>溶解バッファー1 ×バッファー+ 0.5％トリトンX - 100。 </li><li>免疫磁気降水バッファ（IPバッファ）1 ×緩衝液、0.1％トリトンX - 100。 </li></ol></li></ol> 2。架橋ソリューションの準備<ol><li>セルに適用する前に、すぐにDSPソリューションを準備。 DSPは、高度に疎水性であり、PBS /カルシウム/マグネシウムバッファに希釈する前に、DMSOに溶解してください。 DMSO 1mL中にDSPの40mgを溶解する。これは、DSP（DSPの分子量は404.42グラム/モルである）の100 mM溶液になります。 </li><li> ° C PBSにDSP / DMSOの希釈を促進するために、37〜PBS /カルシウム/マグネシウムの適切な量を温める。 各種プレートサイズに必要なボリューム： ウェルあたり6ウェルプレート2 mLの プレート当たり10cmの板を10mL プレート当たり15cmの板を20mL </li><li>温かいPBS /カルシウム/マグネシウムの各1 mLの場合、DSP / DMSOストック溶液の10μLを追加。すべてのDSPが溶解するまで繰り返す混合しながら降下することにより、DSP / DMSOストック溶液のドロップを追加。 PBS /カルシウム/マグネシウムの各1 mLに追加10μLのDMSOの制御ソリューションとなります。 </li><li> 10分よりもはや氷水浴中ですべてのPBS /カルシウム/マグネシウムソリューションを置きます。 </li></ol> 3。架橋のためにセルを準備します。 <ol><li>架橋や車両制御のインキュベーションのためのすべてのプレートに適合します氷水浴を準備する。 </li><li> 37℃のインキュベータからプレートを取り出し、氷水浴中にすぐにそれらを置きます。 </li><li>氷冷PBS /カルシウム/マグネシウムで細胞を2回洗浄する。あなたが（セクション2.2を参照）架橋剤インキュベーションに使用するのと同じボリュームを使用してください。 </li><li>回目の洗浄を削除し、車両制御やDSP架橋緩衝液のいずれかを追加。 </li><li> 2時間氷上でインキュベートする。あなたはすべてのセルがソリューションでカバーされていることを確認するには、約プレート20分ごとに確認する必要があります。あなたは、DSPの少量の溶液から沈殿することがあります。これは正常です。 </li></ol> 4。 DSPの反応の不活性化<ol><li> PBS /カルシウム/マグネシウム（PBS /カルシウム/マグネシウムの各1 mLの1 MトリスpH7.4の20μL）の20mMトリスpH7.4の1XのDSP焼入れ溶液を調製します。 </li><li>車両制御との架橋ソリューションを削除します。 </li><li>氷冷不活化ソリューションを追加し、15分間氷上でインキュベートする。 </li></ol> 5。細胞溶解<ol><li> DSPの消光のインキュベーションの間に、完全なプ​​ロテアーゼ阻害剤カクテルでバッファにトリトンX - 100 0.5％の細胞溶解バッファーを準備します。各1 mLの溶解バッファーのために完了の20μL50Xストック溶液を追加。 </li><li> 15分DSPの急冷インキュベーション後、PBS /カルシウム/マグネシウムで細胞を2回洗浄する。 </li><li>溶解バッファーを追加する+ 4で細胞や岩石への完全な℃で30分間。いくつかは、各種プレートのサイズについては、溶解バッファーの量を提案した。 <ul><li>ウェルあたり6ウェルプレートを0.5mL </li><li>プレート当たり10cmのプレートを1 mL </li><li>プレート当たり15cmのプレートを1 mL </li></ul></li><li>溶解後、プレートから細胞を収集するために、セルスクレーパーを使用してください。プロテアーゼ活性を最小限に抑えるために氷上でライセートを保つようにしてください</li><li> 4℃で15分間細胞ライセートをスピン·トップスピードで、ベンチトップのミニ遠心（15.000 × g）でのCを。 </li><li>新しいチューブに上清をピペットで。ペレットを捨てる。 </li><li>タンパク質レベルを分析し、免疫沈降に進んでください。 </li></ol> 6。免疫磁気降水ビーズの準備 注：この手順は、通常2時間の架橋インキュベーションを開始した後に直接起動される。 <ol><li> 、DYNAL免疫磁気ビーズを30μLを組み合わせるIPバッファー（1 ×緩衝液、0.1％トリトンX - 100）とscrewtopマイクロ遠心チューブに抗原特異的抗体の適切な量の500μL。ネガティブコントロールの抗体フリーと非特異的抗体管準備。抗体の適切な量は別々の実験中に個々の抗原に基づいて決定されるべきである。すべてのIPチューブにラベルを付けます。 </li><li> IPチューブを2時間室温でエンドオーバーエンドロッカーでインキュベートすることができます。また、架橋前に4 °日で一晩抗体でIPチューブをインキュベートする。 </li><li>インキュベーション後、チューブの底にビーズを収集するために迅速に10秒間のミニ遠心分離を行います。 </li><li>離れてチューブの底から磁気ビーズを引っ張ってくる磁気ホルダー、中にチューブをスライドさせて。安全に道のビーズを使用すると、簡単にすべての非結合抗体を洗い流すことができる。 </li><li>このようなゲルローディングチップ、またはインキュベーションバッファーと未結合の抗体を除去するためにP200チップとして小口径アスピレーターチップを使用してください。インキュベーションのボリュームが削除されるとすぐにIPバッファー1 mLに加える。 </li><li>静かに再サスペンドビーズ、チューブにフタをし、エンドオーバーエンド回転で5分間、室温でのすべてのIPチューブをインキュベートする。 </li><li> IPバッファの新鮮ミリリットルで一回より5分の洗浄ステップを（6.6を介してステップ6.3）繰り返します。 </li><li>架橋ライセートがビーズに追加する準備ができるまでIPチューブは最後の洗浄のインキュベーションに残すことができます。 </li></ol> 7。免疫磁気ビーズとの架橋ライセートをインキュベート<ol><li>最後の洗浄のスピン免疫磁気ビーズの後、ダウンして10秒間のミニ遠心インチその後、磁気ホルダーにチューブをスリップに進んでください。 </li><li>再び、小口径の吸引チップを使用して、チューブからインキュベーションのボリュームを削除します。すぐに免疫磁気ビーズを含むチューブに架橋した細胞溶解液の500μL（1μg/ mlで溶解液を仮定して）追加します。あなたがネガティブコントロールとしてペプチド競争を使用する場合、ペプチドの適切な量は、この時点で含まれるべきである。以前の実験は、適切なペプチドの競争条件を決定するために実行されるべきです。代わりに、ネガティブコントロールとしてライセート無料免疫磁気ビーズを持たせることができます。この場合は、すぐに免疫磁気ビーズへ+完全なライセートバッファー（1 ×バッファー+ 0.5％トリトンX - 100）の500μLを加える。 </li><li>優しくビーズを再懸濁します。再懸濁したビーズで2時間転倒回転で4℃でインキュベートしてください。 </li></ol> 8。ビーズからバインドされていない可溶化物を洗う<ol><li>かつてライセートが十分なインキュベーション時間を持っていた、ミニ遠心機で素早く10秒間のスピンを行います。その後、磁気ホルダーにチューブをスライドさせます。マグネットホルダーは、実験の残りを氷浴中で維持する必要があります。 </li><li>小口径アスピレーターチップを使用して、すべてのバインドされていないライセートを削除します。すべてのバインドされていないライセートが削除された直後にIPバッファー1 mLを加える。 </li><li>チューブにフタをし、静かにビーズを懸濁します。 </li><li>一度ビーズをビーズペレット化のステップ（8.1）を繰り返して再懸濁する。 </li><li>再びインキュベーションのボリュームのすべてをオフに吸引し、すぐにIPバッファー1 mLを加え、その後チューブをキャップ。 </li><li>優しくIPバッファーでビーズを再懸濁します。エンドオーバーエンドロッキングと4℃で5分間再懸濁したビーズをインキュベートする。 </li><li>ビーズの洗浄工程を（8.6経由で8.4）4回以上繰り返します。 </li></ol> 9。サンプルを変性し、ビーズから収集<ol><li>に免疫磁気降水管のすべてが洗浄された後、再堆積物ビーズ（8.1）とスライド管磁気ホルダー。 </li><li>免疫磁気ビーズに結合したタンパク質は変性条件下で除去される。最後のIPバッファの洗浄をオフに吸引し、磁気ホルダーからIPチューブを取り外します。 </li><li>再びチューブの下部にビーズプールにちょうどビーズペレット上にIPチューブに1 ×ゲルサンプルバッファーを追加します。サンプルバッファーの量は、使用するゲルのウェルサイズによって異なります。あなたが穏やかにゲルサンプルバッファーで再懸ビーズのすべてを取得するにはチューブの底をタップする必要がある場合があります。 </li><li>各IPチューブ用変性プロセス（9.3経由で9.2）を繰り返します。 </li><li>ゲルサンプルバッファーで再懸濁し、免疫磁気ビーズは、その後75℃に加熱されています°変性プロセスを完了するまで5分間。 </li><li>一度サンプルが変性されているそれは、ウェスタンブロッティングのためにSDS - PAGEゲル上で実行することができます。空に免疫磁気ビーズを遠心分離により、再ペレット化し、磁気ホルダー付きサンプルから削除することができます。 </li></ol> 10。抗原ペプチド（免疫アフィニティークロマトグラフィー）による架橋錯体の溶出。 <ol><li>免疫磁気免疫沈降管のすべての後にビーズ（8.1）とスライド管は、磁気ホルダーに再沈殿、洗浄されています。上清を吸引除去し、タンパク質複合体のimmunoisolationのために用いられる抗体が認識する抗原ペプチドを添加した緩衝液の10μlを加える。あなたは、効率的な溶出のための10から200μMからの範囲の濃度をテストする必要があります。 </li><li> 4℃で2時間ビーズをインキュベート℃を</li><li>マグネチックスタンドでビーズを入れて、慎重に溶出した物質の10 mLを回復する。この上清を保存します。 </li><li>すぐにバッファーでビーズを洗浄し、洗浄して廃棄する。ビーズを保存します。 </li><li> 1Xの濃度に保存された上清とビーズにゲルサンプルバッファーを追加します。 ℃で5分間75℃これらのチューブをインキュベートします。 </li><li> SDS - PAGEによりビーズとペプチドの溶出液を分析する。溶出液は、両方のSDS - PAGEの染色タンパク質または免疫ブロット（図1B）によるIgGの自由であるべきです。 IgGの自由なこの材料は、質量分析に適しています。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1855/1855fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。 AP - 3相互作用するタンパク質複合体や膜タンパク質の分離。HEK293細胞（）またはPC12細胞は、（B）車両の制御の有無（DMSO、奇数レーン図1A）またはDSP（偶数レーン図1Aまたはすべてのどちらかで処理した図1Bのレーン）。図、明確に抽出物を単独でビーズ（図1A、レーン3-4）、トランスフェリン受容体抗体（図1A、レーン5-6）、またはAP - 3δ抗体（図1A、レーン70から10のいずれかでインキュベートし、図1B、レーン1-10）。免疫複合体はSDS - PAGEサンプルバッファー（図1A）で溶出された、単独でのバッファまたは（図1B、レーン1-2）、またはアミノ酸680 710に対応するδの抗原ペプチドの濃度の増加を補充してバッファ（図1B、レーン3-10）：;：人間δ-アダプチン（1923266 GI AAD03777 NCBI）の。このペプチドは、δ抗体を結合する。ペプチド溶出した後、上清（S）とビーズ（B）は、免疫ブロット（図1B）によって分析した。 ;だけでなく、クラスリン重鎖（CHC）、BLOC - 1サブユニットのpallidin、、ホップ、複雑なサブユニットのvps33b：δ、β3、およびσ3サブユニットに対する抗体で検出されたAP - 3は、、以下の可溶性因子とcoprecipitates膜タンパク質のホスファチジルイノシトール4 - キナーゼII型α（PI4KIIα）と亜鉛トランスポーター3（ZnT3）。図中のペプチド溶出した上清中のIgGマウス重鎖が存在しないことに注意してください。 1B。

<ol><li>Salazar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hermansky-Pudlak+syndrome+protein+complexes+associate+with+phosphatidylinositol+4-kinase+type+II+alpha+in+neuronal+and+non-neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Hermansky-Pudlak syndrome protein complexes associate with phosphatidylinositol 4-kinase type II alpha in neuronal and non-neuronal cells.</a> J Biol Chem. 284, 1790-1802 (2009).</li>
<li>Lomant, A. J., Fairbanks, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+probes+of+extended+biological+structures%3A+synthesis+and+properties+of+the+cleavable+protein+cross-linking+reagent+%5B35S%5Ddithiobis%28succinimidyl+propionate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate.</a> J Mol Biol. 104, 243-261 (1976).</li>
<li>Xiang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+DSP%2C+a+reversible+cross-linker%2C+to+fix+tissue+sections+for+immunostaining%2C+microdissection+and+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Using DSP, a reversible cross-linker, to fix tissue sections for immunostaining, microdissection and expression profiling.</a> Nucleic Acids Res. 32, e185-e185 (2004).</li>
<li>Craige, B., Salazar, G., Faundez, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol-4-Kinase+Type+II+Alpha+Contains+an+AP-3+Sorting+Motif+and+a+Kinase+Domain+that+are+both+Required+for+Endosome+Traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol-4-Kinase Type II Alpha Contains an AP-3 Sorting Motif and a Kinase Domain that are both Required for Endosome Traffic.</a> Mol Biol Cell. 19, 1415-1426 (2008).</li>
<li>Newell-Litwa, K., Seong, E., Burmeister, M., Faundez, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+and+non-neuronal+functions+of+the+AP-3+sorting+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Neuronal and non-neuronal functions of the AP-3 sorting machinery.</a> J Cell Sci. 120, 531-541 (2007).</li>
<li>Salazar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zinc+Transporter+ZnT3+interacts+with+AP-3+and+it+is+Targeted+to+a+Distinct+Synaptic+Vesicle+Subpopulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The Zinc Transporter ZnT3 interacts with AP-3 and it is Targeted to a Distinct Synaptic Vesicle Subpopulation.</a> Mol Biol Cell. 15, 575-587 (2004).</li>
<li>Trinkle-Mulcahy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+specific+protein+interaction+partners+using+quantitative+mass+spectrometry+and+bead+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes.</a> J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).</li>
</ol>

DSPは、12Åのスペーサーアームを持つ膜透過性、化学的に還元性架橋剤は、一時的なタンパク質相互作用1,2,3,4を安定させるために使用されます。ここでは、アダプタ複合体AP - 3 5をエンドソームから小胞への膜タンパク質を認識し、ソートする可溶性タンパク質複合体でこの戦略を例示する。 AP - 3は、選択的に亜鉛トランスポーターZnT3と脂質キナーゼ、ホスファチジルイノシトール4 -キナーゼII型アルファはなく、トランスフェリン受容体1,4,6に結合する。我々は質量分析法1による膜タンパク質と細胞質因子のAP - 3タンパク質相互作用ネットワークの識別にこれらの観察結果を拡大。低バックグラウンド免疫磁気降水量は、相互作用するタンパク質を同定するために架橋に従います。また、非選択的に磁気ビーズに結合するタンパク質の発表されたカタログには質量分析法7による非特異的なタンパク質の分離と同定の最初のパスを除去することができます。 DSPは、リジンやタンパク質のアミノ酸末端として第一級アミンをリンクするためにアミン反応性エステル基を...

<table><tbody><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>P4417</td><td>1錠を200 mLの水に溶解し、MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;を最終濃度1 mMに、CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;を最終濃度0.1 mMになるように添加する</td></tr><tr><td>ジチオビス(コハク酸イミドプロピオネート) (DSP)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>22585</td><td>吸湿性あり、密封容器にて4&amp;#x00B0;Cで保存</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO) Hybri-Max</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100, SigmaUltra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads, Sheep anti-Mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>110.31</td><td>ビーズはsheep anti-rabbitとしても入手可能</td></tr><tr><td>Dyna-Mag-2 マグネット</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr></tbody></table>

不安定な多タンパク質複合体の単離で in vivoで制御セルラー架橋及び免疫磁気アフィニティークロマトグラフィー

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

携帯電話機械の動的な性質は、しばしば一過性および/または弱いタンパク質の関連付けに基づいて構築されています。これらの低親和性相互作用は、目的のタンパク質の周りにタンパク質ネットワークの分離と同定のための厳格な方法を排除する。化学架橋剤の使用は、精製のために生化学的な制限をバイパスして、不安定な相互作用の選択的安定化することができます。ここで私たちは12 Å、ジチオビス - （proprionateスクシンイミジル）（DSP）のスペーサーアームでホモ二官能性架橋剤を使用して培養中の細胞のための従順プロトコルを提示する。 DSPは、分子中に存在するジスルフィド結合の還元によって切断される。磁気ビーズによる目的タンパク質のイムノアフィニティークロマトグラフィーを組み合わせた架橋は、特に精製に耐えられないというタンパク質複合体の分離が可能になります。このプロトコルは、通常のウェスタンブロットの技法と互換性があり、それは質量分析法1によってタンパク質の同定のためにスケールアップすることができます。 ステファニーA. ZlaticとパールV.ライダーは、この作品にも同様に貢献した。

細胞透過性架橋剤DSP [ジチオビス - （スクシンイミジルプロピオネート）]安定一過性と不安定な相互作用<em&gt; in vivoで</em厳格なタンパク質複合体精製技術を用いてそれらの分離を可能にする&gt;、。ここでは、免疫沈降によるタンパク質複合体の分離に続いて培養で増殖架橋のセルのテクニックを紹介。

細胞装置の動的な性質は、多くの場合、一過性および／または弱いたんぱく質相互作用に基づいています。これらの低親和性相互作用は、...を妨げます。

架橋およびそれに続く免疫沈降について。密度80〜90%の細胞を、PBS、カルシウム、マグネシウム、またはDMSOのみを含む1 mMの氷冷DSPとともにインキュベートします。ビークルコントロール。DSPは、12 Å（オングストローム）以内に存在する遊離または膜結合タンパク質を架橋する、還元可能なホモ二機能性膜透過性架橋剤である。架橋後、細胞を溶解し、標準的なコントロールを用いて免疫沈降を行う。その後、還元剤によってDSPが切断され、還元SDS-PAGEでタンパク質複合体を分離することで、イムノブロットによる個々のタンパク質の同定が可能になります。こんにちは、エモリー大学細胞生物学科のVictor Fonde博士の研究室のStephanie Ickです。そして、同じくFonde研究室のPearl Ryderです。本日は、制御された架橋反応とそれに続く免疫磁気アフィニティークロマトグラフィーを用いた、タンパク質複合体の単離手順について解説します。当研究室では、一過性の不安定なタンパク質間相互作用を研究するためにこの手順を用いています。それでは始めましょう。まず、細胞種と具体的な実験条件を示すために、細胞プレートの底面にラベルを貼ります。ここでは、DSP処理ありを示すプラス記号と、DMSOのみのネガティブコントロール（ビークルコントロール）を記載します。細胞播種に向けて、プレートに培地を加えます。標準的なチューブ反応あたり500 µgのタンパク質を単離できるよう、HEK細胞を1/5に希釈して播種します。質量分析の結果から免疫ブロットによって目的タンパク質の推定結合パートナーを同定する場合、1本のチューブで十分な場合があります。標準的な反応数を少なくとも10倍に増やしてください。また、架橋実験で使用するほとんどの溶液を準備します。これには、0.1 millimolar 塩化カルシウムと 1 millimolar 塩化マグネシウムを添加した PBS（PBS calcium magnesium と称する）が含まれます。カルシウムイオンとマグネシウムイオンの添加は、細胞を培養プレートに接着させるために不可欠です。実験期間中、溶液は4°Cで保存してください。その他のストックには、架橋剤クエンチ溶液、50X完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（ペレットが溶解するまで20分ごとにボルテックス処理を行う）が含まれます。また、4°Cで保存し1か月以内に使用すべき20% Triton X 100、ならびに10xおよび1x Buffer A溶液を用意します。付属の書面プロトコルに従い、すべての溶液を調製し保存します。最後に、1Xバッファーに0.5% Triton X-100を加えた溶解バッファーと、1Xバッファーで構成される免疫磁気沈降バッファー（IPバッファー）を調製します。0.1% Triton X 101を添加し、播種から2日後、細胞が80〜90%の合流度に達した状態が架橋に最適です。合流度が高すぎると、細胞が重なり合う傾向があり、細胞透過性架橋剤がすべての細胞に到達しにくくなります。架橋の準備が整うまで、プレートをインキュベーターに戻しておきます。DSP架橋剤溶液は、細胞に適用する直前に調製してください。DSPは非常に疎水性が高いため、PBSカルシウムマグネシウムバッファーで希釈する前に、まずDMSOに溶解させて100 millimolarの濃度にします。PBSカルシウムマグネシウムバッファーへのDSPの希釈をさらに促進するため、適切な量の中和溶液を温め、そこにDSPおよびDMSOストック溶液を10 microliters添加します。温めたPBS calcium magnesium 1 mLにつき、DSPのストック溶液を、すべて溶解するまで繰り返し混ぜながら、1滴ずつ加えます。また、PBS calcium magnesium 1 mLにつき10 µLのDMSOを含む溶媒コントロール溶液を準備します。DSPを希釈した後、すべてのPBS calcium magnesium溶液を氷水浴に置き、10分以内に使用してください。次に、実験で使用するすべてのプレートが入る氷水バスを準備します。37 °Cのインキュベーターから細胞を含む培養プレートを取り出し、直ちに氷水バスに入れます。氷冷したPBS calcium magnesiumを用いて細胞を2回洗浄します。使用する液量は、以前にクロスリンカーでのインキュベーション用に準備したものと同様とし、6ウェルプレートの場合は1ウェルあたり2 mLとして計算してください。2回目の洗浄後、溶媒コントロール（バッファーに溶解したDMSO）またはDSP架橋バッファー溶液のいずれかを細胞に添加し、氷上で2時間インキュベートします。その際、約20分ごとに、すべての細胞が溶液に浸っているかを確認してください。一部の細胞が露出している場合は、ディッシュを傾けて回転させ、再び均一に覆われるようにします。少量のDSPが沈殿することは正常です。細胞との2時間のインキュベーション中、その2時間が経過する前に、ストック溶液をPBS calcium magnesiumで希釈して1X DSPクエンチ液を調製します。未反応のDSPを不活性化して架橋反応を停止させるまで、この溶液を氷上で保持してください。2時間が経過したら、細胞からビークルコントロールおよび架橋溶液を除去します。氷冷したDSPクエンチ溶液を加え、氷上で15分間インキュベートします。その間に、完全プロテアーゼ阻害剤カクテルのストック溶液を細胞溶解バッファーで1:50に希釈します。15分が経過したら、細胞をPBS calcium magnesiumで2回洗浄します。次に、プロテアーゼ阻害剤を含む溶解バッファーを細胞に加え、4 °Cで30分間ロッキングミキサーで撹拌します。30分間の細胞溶解後、セルスクレイパーを用いてプレートから細胞を回収します。プロテアーゼ活性を最小限に抑えるため、溶解物は必ず氷上で保持してください。ベンチトップ型ミニ遠心機を用い、最高速度の 15,000 Gs、4 °C で細胞溶解液を 15 分間遠心分離します。上清を新しいチューブに分注し、ペレットを廃棄します。Bradford 法を用いてタンパク質濃度を分析し、免疫沈降に進みます。スクリューキャップ付きマイクロ遠心チューブで 2 時間の架橋反応を開始させた直後に、免疫沈降の準備を開始してください。30 µLのanti IgG免疫磁気ビーズと500 µLのIPバッファーを混合します。目的のターゲットに対する抗体を加えます。抗体の適切な量は、個々の抗原ごとに決定してください。予備実験において、ビーズの陰性コントロールとしては、抗体なし、ビーズのみ、およびIP抗体を磁気ビーズに結合させるためのアイソタイプコントロール抗体ビーズなどが考えられます。エンドオーバーエンドミキサーを用いて、室温で2時間インキュベートします。インキュベーション終了後、チューブをクイックスピンし、マグネットホルダーに挿入します。これにより、ビーズが磁石の側面に集まります。未結合の抗体を含む溶液を除去し、ビーズの乾燥を防ぐために直ちに洗浄します。2回の洗浄後、DSP陰性またはDSP陽性細胞溶解液（1 µg/mL）を500 µL、適切なチューブに加えます。この段階で、予備実験で決定した濃度の免疫原性ペプチドを溶解液とビーズの混合物に加えることにより、ペプチド競合陰性コントロールを調製できます。この段階で準備可能なもう一つの陰性対照として、ビーズに500 µLの溶解バッファーのみを添加した、バッファーのみまたはライセートフリーの反応液があります。実験群および対照群の反応液のビーズを穏やかに再懸濁させてください。ビーズが破壊されるため、ボルテックスミキサーは使用しないでください。4 °Cで2時間、エンドオーバーエンド回転させてインキュベートします。2時間後、マグネットホルダーを用いて溶解液を除去します。短時間遠心分離を行い、IPバッファー1 mLで計6回ビーズを洗浄します。各洗浄において、4 °Cで5分間インキュベートします。結合した複合体を溶出させるため、ビーズペレットの直上のIPチューブに1xゲルサンプルバッファーを加えます。チューブ底部のビーズを集めるため、チューブの底を軽く叩き、すべてのビーズをゲルサンプルバッファーに再懸濁させます。あるいは、免疫親和性単離を行う場合は、免疫原性ペプチドを添加したバッファー30 µLをビーズに加えます。免疫原性ペプチドの必要濃度は経験的に決定します。10から200 µMの範囲でテストした後、ビーズを4°Cで2時間インキュベートし、30分ごとにチューブをタッピングします。マグネットホルダーを用いて、溶出した複合体を含む30 µLを回収して清潔なチューブに保存し、IPバッファーで洗浄した後にビーズを保存します。両方の溶出法において、ビーズに1xゲルサンプルバッファーを添加します。ゲルサンプルバッファーに再懸濁した免疫磁気ビーズを75 °Cで5分間加熱し、タンパク質を変性させます。このステップによりDSP分子が切断され、複合体中の個々のタンパク質を分離して解析することが可能になります。ウェスタンブロッティング用のSDS-PAGEゲルのサンプル。空になった免疫磁気ビーズは、遠心分離によって反発させ、ロード前にマグネットホルダーを用いてサンプルから除去することができる。SDS-PAGEのタンパク質染色または免疫ブロットの両方で、免疫親和性EUAにIgGが含まれていないことが確認できれば、質量分析に適している。以下は、架橋および非架橋の細胞溶解物を用い、AP-3サブユニットに対するモノクローナル抗体を用いて免疫磁気沈降を行った後のウェスタンブロットの例です。架橋を行うことで、免疫磁気分離における非架橋サンプルでは検出されなかった相互作用タンパク質の検出が可能になります。陰性対照では、非架橋および架橋サンプルの両方において、抗体不使用およびトランスフェリン受容体に対するIgGを用いた抗体アイソタイプ一致対照を用いて、特異的なタンパク質のプルダウンは見られませんでした。この例では、IP抗体に結合したタンパク質を回収するために、アフィニティーペプチド溶出を用いました。ペプチド溶出の間、免疫抗体は上清画分には存在せず、ビーズ画分に留まっていることに注目してください。以上で、化学架橋剤DSPを用いて不安定なMultiPro複合体を固定し、その後に免疫磁気アフィニティー精製を行うことで、これらを単離する方法を説明しました。この手順を行う際は、架橋中の不安定な相互作用を維持し、プロテアーゼ活性を最小限に抑えるために、細胞溶液およびライセートを冷却状態に保つことが重要です。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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不安定な多タンパク質複合体の単離で in vivoで制御セルラー架橋及び免疫磁気アフィニティークロマトグラフィー

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