ハイC：ゲノムの三次元構造を研究する方法。

Hi.Cは、ゲノムワイドに偏りのない形式で長距離のクロマチン相互作用を同定する方法です。まず、細胞をホルムアルデヒドで固定し、細胞を溶解させた後、制限酵素を用いてDNAを断片化します。次に、5'末端のオーバーハングを平滑末端化して充填する際にビオチン化残基を組み込み、架橋されたDNA断片間のライゲーションが優先される希釈条件下でライゲーションを行います。

ライブラリをせん断し、接合部をstrep haveinビーズでプルダウンします。精製された接合部は、その後ハイスループットシーケンサーを用いて解析することができ、相互作用する断片のカタログが得られます。これらの結果からクロマチンの折りたたみに関する知見が得られ、染色体領域の存在、ゲノムのオープンおよびクローズクロマチンへのコンパートメント化、およびメガベーススケールにおけるFractal Glo組織化の証拠が明らかになります。

こんにちは。マサチューセッツ大学医学部、遺伝子機能・発現プログラムのフィールド・デッカー研究室のNka Van Berghamです。こんにちは。ハーバード大学およびマサチューセッツ工科大学のブロード研究所、エリック・ランダー研究室のEz Lieberman Aidenです。ブロード研究所、分子生物学研究開発グループのLouis Williamsです。そして、マサチューセッツ工科大学のLen Muni研究室のMaxima Mackayです。

本日は、Hi-Cと呼ばれるゲノムワイドな染色体コンフォメーションキャプチャの手順をご紹介します。当研究室では、ヒトゲノムの構造を実験的に探索するためにこの手法を用いています。最初の手順はマサチューセッツ大学医学部で行い、後半の手順はプルデュー大学で行います。また、Hi-C実験の結果を用いて、MITでゲノムのダイナミクスをどのようにシミュレートしたかについても解説します。

それでは始めましょう。それでは、開始します。Hi-Cは、染色体コンフォメーションキャプチャーにおいて一般的な手法である、細胞の架橋から始まります。

まず、10⁷から2.5×10⁷個の哺乳類細胞を、接着培養または浮遊培養で調製し、細胞を架橋します。ホモジナイザーを用いて、550 µLの溶解バッファーで細胞を溶解させます。クロマチンを5,000 RPMで遠心分離し、ペレットを500 µLのNEBバッファー2で2回洗浄します。その後、番号を振った5本のチューブに分注し、最終容量が362 µLになるようにNEBバッファー2を加えます。

1%SDSミックス38 µLを慎重に添加し、65 °Cで10分間インキュベートします。直ちにチューブを氷上に置き、Triton X 100 44 µLとHindIII 400 unitsを慎重に混合して添加してSDSをクエンチし、回転させながら37 °Cで一晩インキュベートします。以降の手順はHi-C特異的な操作であり、ビオチンによるDNA末端の標識およびクロスリンクされた断片の平滑末端ライゲーションが含まれます。

このステップにより、後でライゲーション接合部を精製することが可能になります。1本のチューブについてはビオチン溶出ステップを行わず、代わりにこれをコントロールとして使用し、残りの4本のチューブにおいて、制限断片のオーバーハングを埋め、DNA末端にビオチンを標識するための消化およびライゲーション条件が最適であったかを確認します。チューブ2から5にdATP、dGTP、およびdTTPを添加します。

また、ビオチン標識DCTPとKlinoを添加します。注意深く混合し、37°Cで45分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを氷上に置き、すべてのチューブに10% SDSを86 µL添加して酵素を不活化させます。

チューブを65 °Cで正確に30分間インキュベートし、その後直ちに氷上に置きます。架橋断片間のライゲーションを促進させるため、ライゲーションは極めて希釈した条件下で行います。氷上で作業しながら、5本の15 mLチューブそれぞれに7.61 mLのライゲーションミックスを加えます。

次に、消化した各クロマチン混合物を対応するチューブに移します。チューブ1に10 µLのT4 DNA ligaseを加え、通常の3Cライゲーションを行います。続いて、チューブ2から5に50 µLのT4 DNA ligaseを加え、平滑末端High-Cライゲーションを行います。

チューブを転倒混和し、16 °Cで4時間インキュベートします。インキュベーション後、各チューブに50 µLのプロテイナーゼKを加え、65 °Cで一晩インキュベートして、タンパク質の分解およびCNA架橋の解除を行います。翌日、さらに各チューブに50 µLのプロテイナーゼKを加え、65 °Cでさらに2時間インキュベートします。

反応混合物を回収し、50 mLのコニカルチューブ5本に分注します。フェノール抽出を行い、これらのチューブ内のDNAを精製します。10 mLのフェノールを加え、2分間ボルテックスします。

チューブを3,500 RPMで10分間遠心分離し、水相をできるだけ慎重に新しい50 milliliterチューブに移します。フェノール・クロロホルムを用いて抽出を繰り返し、エタノールを用いてDNAを沈殿させます。エタノール沈殿後の遠心分離を経て、各DNAペレットを450 microlitersの1 XTEバッファーに溶解し、1.7 milliliter遠心チューブに移します。さらに、500 microlitersのフェノール・クロロホルムを用いてフェノール・クロロホルム抽出を2回行い、精製をもう1サイクル実施します。1分間ボルテックスした後、チューブを14,000 RPMで5分間遠心分離し、2回目の抽出後に水相を新しいチューブに移します。

DNAをエタノール沈殿させ、遠心分離でDNAを沈殿させた後、各DNAペレットを70%エタノールで1回洗浄し、25 µLの1XTバッファーに再懸濁します。チューブあたり1 µLのRNase Aを添加し、37 °Cで30分間インキュベートして、存在する可能性のあるRNAを分解します。チューブ1を3 Cコントロールとして別に保管したまま、チューブ2から5のハイC含量を回収します。

ここで、0.8% AASEゲルで分注サンプルを電気泳動し、ライブラリの量と質を確認します。Hi-Cのライ ligation効率は、PCRダイジェストアッセイで評価する必要があります。Hi-Cの手順で行われる平滑末端の作成とライゲーションにより、エンドヌクレアーゼNhe Iの制限部位が作成されます。3CおよびHi-Cライブラリから増幅されたフラグメントをHind IIIおよびNhe Iで消化することで、平滑末端がどの程度適切に作成され、どの程度のフラグメントがライゲーションされなかったかを判断できます。記述プロトコルに従い、T4 DNAポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を用いて、これらの未ライゲーション末端からビオチンを除去します。

フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を用いてDNAを再度精製し、DNAペレットを計100 µLの水に再懸濁します。サンプルが品質管理アッセイに合格した場合、プロトコルはバイオサンプル調製およびシーケンシングへと進みます。以上です。

ビオチン化DNAをハイスループットシーケンシングに適した状態にするため、Covaris S2装置を用いてDNAを300から500塩基対のサイズにせん断します。次に、10x ligation buffer、dNTPs、T4 DNA polymerase、T4 POLYNUCLEOTIDE kinase、CNase（DNA polymerase）、および水を添加して、DNAの末端修復を行います。サンプルを室温で30分間インキュベートします。インキュベーション後、メーカーの推奨に従ってQiagen MinEluteカラムを使用してDNAを精製します。DNAをカラムにロードして洗浄した後、1x TE buffer 50 µLで2回DNAを溶出させます。その後、10x NEB buffer、dATP、水、およびエキソヌクレアーゼ欠損型T4 DNAポリメラーゼ（Klenow fragment）を添加し、末端修復済みDNAの3'末端にdATPを付加します。

cile断片を不活性化させるため、反応液を37 °Cで30分間インキュベートします。その後、反応液を65 °Cで20分間インキュベートし、続いてSpeedVacを用いて氷上で反応液を濃縮し、液量を20 µLまで減少させます。次に、DNAを1X TAE含有1.5%アガロースゲルにロードし、80〜90Vで3.5時間電気泳動を行います。

300〜500 bpのDNA断片を切り出し、ゲルの重量に応じて2〜4本のカラムを用い、Qiagen gel extraction kitで精製します。QIAquickカラムから得られた溶出液をまとめ、1×TLEバッファーを用いて最終容量を300 µLに調整します。最後に、Qubitを用いたQU assayでDNA濃度を測定し、本プロトコル工程におけるDNAの総量を算出します。

ライゲーション接合部をDNAプールから精製することで、ペアエンドシーケンシングによる相互作用クロマチン断片の効率的な同定が可能になります。以降のすべての手順は、DNA低吸着チューブを用いて行ってください。ビオチン用のビーズを準備します。

再懸濁させた磁気ストレプトアビジンビーズ150 µLを、1x Tweenバッファー400 µLで2回洗浄し、プルダウンを行います。今後の洗浄は、ビーズにバッファーを添加し、混合物を新しいチューブに移し、室温で3分間回転させた後、磁気粒子濃縮器を用いてビーズを回収するという5つのステップで構成されます。

上清を除去します。2×no tween buffer 300 µLでビーズを洗浄し、high cDNA 300 µLと混合します。回転させながら室温で15分間インキュベートし、ビオチン標識されたhigh cDNAをstrep dinビーズに結合させます。

磁気粒子濃縮器を用いて、ビーズに結合したDNA結合strp Aを回収し、上清を除去します。ビーズを400 µLの1x no tween bufferで洗浄し、続いて100 µLの1x ligation bufferで洗浄します。ビーズを50 µLの1x ligation bufferに再懸濁し、混合物を新しいチューブに移します。

Illuminaペアエンドシーケンシング用のDNAを調製するには、まず、定量アッセイを用いて事前に算出したビオチンプルダウンに使用した全DNA入力量を確認し、それを20で除して、プルダウンされライゲーションに利用可能な高純度cDNA量を推定します。ライゲーション可能な高純度cDNA 1 µgあたり6 pmolのIlluminaペアエンドアダプターを添加します。次に、1,200 unitsのT4 DNAリガーゼを用いて、アダプターをDNAにライゲーションさせます。

室温で2時間インキュベートします。高濃度cDNA結合ビーズを回収し、1×Tweenバッファー400 µLで2回洗浄することで、ライゲーションされていないペアエンドアダプターを除去します。その後、1×Tweenフリーバッファー200 µLでビーズを洗浄し、続いて1×NEBバッファーを200 µL、次いで50 µL用いて洗浄します。

最後の洗浄を2回行った後、ビーズを50 µLのNEB buffer 2に再懸濁し、新しいチューブに移します。シーケンシングに十分な量のPCR産物を生成するために必要なサイクル数を決定します。

サイクル数を6、9、12、または15回とした4つのテストPCR反応をセットアップします。PCR反応産物を5%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、Cyber Greenで染色して最適なサイクル数を決定します。その際、非特異的なバンドが存在せず、アダプター結合後の共通産物の長さである400〜600 bpの間にスメアが確認されることを確認してください。最適化したPCRサイクル数を用いて、ビーズに保持された残りのhigh Cライブラリーラウンドストリップを大規模PCRで増幅します。個々のウェルからPCR産物を回収し、ビーズを回収します。

大規模PCR産物の1%をゲル電気泳動用に分けておき、残りのPCR産物を、メーカーの推奨に従って1.8倍量のPure beadsを用いて精製します。DNAを50 µLの1X TEバッファーで溶出させ、Pure beadで精製したPCR産物の1%と、元のPCR産物の1%分のアリコートを5%ポリアクリルアミドゲルで比較します。PCRプライマー配列が適切に除去されていることを確認した後、高CライブラリをIlluminaペアエンドシーケンシングにかけ、MACを用いて各末端を独立してアライメントし、相互作用するクロマチン断片を同定します。

high Cプロトコルが技術的に適切に実行された場合、以下の結果が得られることが期待され、これらは品質管理基準と見なされます。品質管理ステップでは、three Cライブラリとhigh Cライブラリの両方が、10 kilo bases以上のかなりタイトなバンドとして検出される必要があります。DNAのスミアが見られる場合は、ライゲーション効率が低いことを示しています。

通常、ライゲーション効率は3Cテンプレートと比較してHigh-Cライブラリの方がわずかに低くなります。High-Cのマーキングおよびライゲーション効率は、3C PCR産物を消化することで推定できます。3C接合部はHindi IIIによって切断されますが、NheIでは切断されません。

高C接合部についてはその逆が当てはまります。このPCRダイジェストアッセイは、高Cアンプリコンの70%がNHE Iによって切断され、Hin IIIによって切断されないことを示しています。3. ライゲーション接合部の効率的なマーキングを確認するため、シーケンスリードの解析を行い、青線と赤線で示される染色体内部および染色体間相互作用の両方からのリードが、緑色で示されるランダムに生成されたリードと比較して、Hin III制限部位に有意に近くアラインメントされることを確認してください。

実験が成功した場合、アライメント可能なリードペアの55%が染色体間相互作用を表します。15%は20 kilobases未満の距離にある断片間の染色体内相互作用を表し、30%は20 kilobasesより離れた染色体内リードペアとなります。この分布を、ハイスループットシーケンシング前の品質管理の一環としてサンプリングすることが可能です。

通常、100個程度のクローンのクローニングおよびサンガーシーケンシングで十分です。クロマチン相互作用は、x軸とy軸がゲノム上の位置を表し、各ピクセルがそれらの間で観察された相互作用の数を示すヒートマップとして可視化できます。一般的に、線状ゲノム上で互いに非常に近い位置にあるDNA断片は、頻繁に相互作用する傾向があります。

これは、染色体内ヒートマップにおいて顕著な対角線として観察されます。以下の結果は、ゲノムのさまざまな組織化レベルを明らかにするための異なるデータ解析手法を示しています。接触確率をゲノム距離に対してプロットすると、接触確率はゲノム距離の関数として減少し、最終的にすべての距離においてプラトーに達することがわかります。

実線で示された染色体内相互作用は、破線で示された染色体間相互作用に比べて濃縮されています。これは染色体領域の存在を直接的に示唆しています。すべての染色体ペア間における観察された染色体間コンタクト数と期待される数との比を算出すると、特定の染色体ペア間に優先的な会合があることが明らかになります。明るい赤色で示されているように、遺伝子密度の高い小さな染色体同士が優先的に相互作用しています。

個々の染色体を調べることも可能です。期待値ヒートマップを用いて生のヒートマップを調整することで、一対の遺伝子座間のゲノム距離を考慮した、「期待値に対する観測値」のヒートマップを作成できます。その後、この「期待値に対する観測値」ヒートマップの行と列を相関させることで、相関行列を算出できます。

相関解析を用いることで、ヒトゲノムが2つのコンパートメントに分画されることが示されました。これは格子状のパターンによって図示されています。high Cデータを用いた相関ヒートマップにより、メガベーススケールにおけるクロマチン折り畳みに関する新たな知見が得られました。

クロマチンのパッキングに関する通常のポリマーモデルでは、クロマチンは平衡状態のグロブール（GLO）にパッキングされることが示唆されます。接触確率を距離の関数としてプロットすると、接触確率はゲノム距離に対してべき乗則に従ってスケールし、その傾きはおよそマイナス1になります。これは平衡状態のグロブールの挙動とは一致しませんが、フラクタルグロブールとして知られる別の構造の予測とは一致します。ここでは、2つの球状構造が示されています。

配色は、一方の端点からの距離に対応しており、青からシアン、緑、黄色、オレンジ、そして赤へと変化します。また、平衡グロビュールと同様に、フラクタルグロビュールはフラクタル Glo 内に絡まりを持ちません。輪郭に沿って近接している遺伝子座は、3D空間上でも近接する傾向があり、その結果、単色的なブロックが出現します。

このようなブロックは平衡状態のGloには見られません。もつれが存在しないことは、グロビュールを拘束している力を取り除き、グロビュールを膨張させることで実証でき、フラクタルグロは急速に脱凝縮します。一方、平衡状態のGloは、あまりにも複雑に絡み合っているため、このような挙動を示しません。

以上で、ハイC解析用ライブラリの作製方法について説明しました。この手順を行う際は、効率的なハイCライゲーションと精製を確認するために、適切なコントロールを行うことが重要です。最終的なリード数は、相互作用マップの解像度を決定します。

私たちは約3,000万リードを用いて、約1メガベースの解像度でヒトゲノムの相互作用マップを作成しました。解像度をN倍にするには、リード数をnの2乗倍に増やす必要があります。ヒトゲノムの構造について学んでいただけることを願っております。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。