DNAベースの魚種の識別プロトコル

魚種同定システムは、特定のサンプルに存在する魚種を同定するための、シンプルで高速かつ正確なDNAベースの方法です。魚のサンプルをプロテイナーゼKで処理し、核酸を溶液中に放出します。次に、魚のゲノムDNAを単離し、すべての魚のゲノムに見られる配列に結合するプライマーを使用してPCRを増幅します。

次に、PCR産物を3つの異なる制限酵素で消化し、Agilent 2100バイオアナライザーで分離します。消化反応で生成されたフラグメント長は、制限フラグメント長多型、またはRFLPパターンマッチングソフトウェアを使用して魚種を決定するために使用できます。こんにちは、Agilent TechnologiesのRachel Formosaです。

今日は、DNAベースの魚種同定の手順をご紹介します。この手順は、新鮮、冷凍、ミンチ、調理済み、乾燥、またはその他の処理済みサンプルに存在する魚種を識別できるスクリーニング方法です。そして、これは1営業日未満で達成できます。

私たちはこの手順を使用して、水産物の真正性を研究していますが、これは水産業界にとって非常に重要であり、代替品や不当表示は経済的、環境的、食品安全に大きな影響を与える可能性があります。さらに、視覚的な識別やその他の従来の方法で魚種を特定することは特に難しい場合があります。魚が処理されると、DNA検査ははるかに正確で信頼性の高い結果を提供します。

それでは始めましょう。DNA抽出用のサンプルの準備を開始するには、生または調理した魚組織サンプルを1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブにそれぞれ10〜1000ミリグラムずつ入れます。調製したばかりのプロテイナーゼケース溶液220マイクロリットルでサンプルを採取し、ピペットで上下します。

インキュベーション遠心分離機に続いて10分間、65°Cでチューブをインキュベートし、14, 000Gで3〜5分間、未消化の組織をペレット化します。次に、各上清の150マイクロリットルを新鮮な1.5ミリリットルのチューブに慎重に移し、下部に未消化の物質、上部に油性物質が存在するのを避けます。上清は今後、ゲノムDNA抽出に使用されます。

ゲノムDNAの抽出を開始するには、各サンプルに500マイクロリットルの核酸結合バッファーを添加します。これにより、サンプルの総量は650マイクロリットルになります。均質化されるまでサンプルをボルテックスします。

次に、キットに付属の2ミリリットルのレセプタクルチューブのいずれかに装着されたDNA結合スピンカップに各サンプルを移します。チューブのキャップをスピンカップの上部にはめ込みます。サンプルを 14, 000 G で 1 分間回転させ、DNA をスピンカップマトリックスにロードします。

遠心分離後、スピンカップを取り外し、濾液を廃棄し、カップをレセプタクルチューブに戻します。500マイクロリットルの1×高塩洗浄バッファーを追加します。チューブにキャップをし、遠心分離後に再度遠心分離します。

ろ液を廃棄し、再度、スピンカップをレセプタクルチューブに戻します。次に、500マイクロリットルの80%エタノールを追加します。チューブにキャップをし、14, 000 Gで1分間回転させます。

80%エタノールで3回目の洗浄を再度行った後、エタノール洗浄をさらに2回繰り返し、濾液を廃棄します。レセプタクルチューブのスピンカップを交換し、今度は2分間回転させてファイバーマトリックスを乾燥させます。次に、スピンカップを1.5ミリリットルのコレクションチューブに移します。

100マイクロリットルのエボリューションバッファーを各スピンカップに直接追加し、カップ内のファイバーマトリックス上に直接追加します。次に、収集チューブのキャップをスピンカップにはめ込み、室温で1分間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを最大速度で1分間回転させます。

次に、スピンカップを捨て、チューブにキャップをします。DNA濃度を測定すると、マイクロリットルあたり5ナノグラムからマイクロリットルあたり500ナノグラムの範囲の濃度が予想されます。DNAは、長期保存のために最大1ヶ月間摂氏4度で保存することができ、DNAを摂氏マイナス20度またはマイナス80度に置くことができます。

P-C-R-R-F-L-P試薬キットに付属のプライマーと試薬を使用してPCRを行います。添付の書面によるプロトコルに従って、PCRの実行中に、陽性のアンチテンプレートなしコントロールを含む各サンプルを重複して実行することをお勧めします。DTE、E、1、HAE、3、およびNL 3で、1.5マイクロリットルの滅菌蒸留水、0.5マイクロリットルの10 x酵素バッファー、および0.5マイクロリットルの10 x酵素を順番に組み合わせて、消化用の制限酵素マスターミックスを調製します。

すべてのサンプルと1つの反応量、余分なfourex 3試薬混合物に十分な量を準備します。次に、サンプルと酵素名でラベル付けされた各反応チューブに2.5マイクロリットルを分配します。PCRが完了したら、サーマルサイクラーからサンプルを取り出し、氷の上に置きます。

各PCR産物の2.5マイクロリットルを、その反応のための3つの制限消化チューブのそれぞれに加えます。DDE 1 HAE 3、NLA 3。次の渦。

短時間遠心分離し、消化液を摂氏37度で2時間インキュベートします。より便利な場合は、消化物を一晩インキュベートすることもできます。消化後、反応液を摂氏65度で15分間インキュベートします。

次に、各チューブに1マイクロリットルの60ミリモルEDTAを追加して、反応とボルテックスを終了します。Agilentバイオアナライザー試薬キットを使用して、キットガイドに従って制限消化物を調製し、A DNAチップのウェルにロードします。各サンプルについて、3つのダイジェストすべてを同じチップにロードする必要があります。

次に、チップをボルテックスしてマシンにロードします。ランが終了したら、アッセイコンテキストに移動し、チップサマリータブを選択します。[サンプル名]フィールドに、チップの12ウェルすべてのサンプル名を入力して、テストDNAサンプルの魚種を識別します。

ファイルをクリックして、RFLPデコーダープログラムを起動します。次に、XADファイルを開きます。開いているダイアログボックスが開きます。

次に、使用するDNAチップのXADファイルを選択します。[開く]をクリックすると、チップにロードされたサンプルのリストが表示されます。最初のDNAサンプルに対応する3つの消化物を選択します。

[enzyme] カラムの下に、[min peak height as percent of lower marker] とラベル付けされたフィールドで使用された制限酵素を指定します。デフォルト値は 10% です (必要な場合)。この値は、見逃された小さなピークを特定するために下げたり、エレクトロフェログラムの非特異的ノイズから生じるピークを破棄するために上昇

最小ピーク高さの値を調整した後、[reintegrate]をクリックします。次に、ダイアログボックスの下部にある[計算]をクリックします。バイオアナライザーの実行から得られたフラグメント長データは、ソフトウェアフィールドに入力されます。

次に、画面の左上隅にあるスコアドロップダウンリストで、サイコロを選択します。魚のサンプルが単一の魚種または混合物で構成されている場合、サンプルが混合物で構成されている可能性がある場合は、画面下部の表に「複合スコアリスト」というラベルが付けられます。3つの消化反応すべての結果に基づいて、最適な種が一致します。

スコアが 1 の完全一致は緑色で強調表示されます。近くの試合は、画面上部に黄色で強調表示されます。下限のカットオフ値は、解析で使用される最小フラグメントサイズを指定し、一致許容値によって、フラグメントが予測フラグメントにどの程度近い必要があるかが一致と見なされます。

表示されている値はデフォルト設定であり、調整される場合があります。これらの手順を繰り返して、チップに残っているDNAサンプルを分析します。4つの異なる魚種からのDNAサンプルを、このビデオで説明されている方法を使用して単離、増幅、消化しました。

Agilent Bioanalyzer と RFLP デコーダーを使用した制限消化サンプルを示すバイオアナライザーゲルをここに示します。ここでは、ソフトウェアの曲げパターンを使用して魚を識別します。最初のサンプルはマス、2番目はマグロ、3番目は岩土として正しく識別されます。

そして、最後のサンプルは特定のタラとして。今回は、agilentのP-C-R-R-F-L-P法を使用してDNAベースの魚種同定を行う方法を紹介しました。この手順を実行するときは、この方法が非常に敏感であるため、サンプルの相互汚染を避けることが重要です。

というわけで、これだけです。これで、サンプルに存在する魚種を迅速、簡単、正確に同定する方法がわかりました。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。