Name: ナマルバ細胞におけるIL - 4依存性遺伝子発現のsiRNAのノックダウン：遺伝子発現研究を簡素化する自動化セルカウンターの使い方 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: 学ぶ 電気穿孔法によるsiRNA導入とリアルタイムPCRを用いた遺伝子発現解析の自動化ワークフロー。難トランスフェクション細胞におけるSTAT6ノックダウンとIL-4誘導経路の定量評価手法を習得できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1。ナマルバ細胞を準備してカウント<ol><li>培養フラスコから細胞を除去し、ペレットに細胞を遠心してください。 PBSの既知の量で上清と再懸セルを削除します。このプロトコルで使用されている細胞は浮遊細胞です。あなたが接着細胞を使用している場合には、収集する前にトリプシンする必要があります。 </li><li> 、生細胞の数を決定するカウントスライド上に混合物の0.4％トリパンブルー溶液をピペットを10μlとそれを1:1に混合して細胞懸濁液の一部を染色し、TC10自動化されたセルにスライドを挿入するにはカウンター（バイオラッドラボラトリーズ株式会社）。 </li><li> TC10セルカウンターは、意志オートフォーカスは、カウントを続行して最も正確なカウントを保証する、とする。それは自動的にサンプル中の生細胞と全細胞の密度が決まります。 </li><li>ビュースクリーン上のセルを表示する画像を表示する]を選択します。その後、自動的に必要とされる細胞の混合物の量を計算TC10セルカウンタを持つように希釈電卓]を選択します。 </li><li>この実験は、3種類のsiRNAの合計を使用しています：あるコントロールsiRNAとSTAT6遺伝子、プラストランスフェクトされていないコントロールをターゲットに二つの異なるsiRNAを。これは、1mlあたり5 × 10 6細胞の最終濃度で3.6ミリリットルを必要とします。 </li><li>希釈計算機に所望の濃度と最終的な音量の値を入力し、それは細胞懸濁液の体積は、そのサンプルの生細胞数に基づいて、必要に応じて計算します。また、手動で計算を実行します。次に、新しいチューブにこれらの実験のために細胞の混合物の必要量を転送する。 </li><li>細胞をペレット化する細胞の混合物をスピンし、すべてのPBSを取り除く。ジーンパルサーエレクトロポレーションバッファー（バイオラッド社）の3.6 mlで再懸濁します。適切なsiRNAを含むチューブに800μlのアリコートを移し、穏やかに混合する。セルはエレクトロポレーションのための準備が整いました。 </li></ol> 2。 96ウェルプレートに細胞をElectroporating <ol><li> 96ウェルエレクトロプレートが一緒にエレクトロポレーションするすべての4つの治療のために複製することができます。 </li><li> 96ウェルエレクトロプレートの適切なウェルに細胞懸濁液150μlを移す。 </li><li> MXcellのエレクトロポレーションプレートをチャンバー内にプレートを挿入し、蓋を閉じます。 </li><li>使用されている細胞株とバッファ用に最適化された設定を使用してエレクトロ。これらの細胞は、指数関数的な減衰の250 Vの機器の設定と波、350μF、および1000Ωの抵抗を使用して電気穿孔されています。 </li><li>エレクトロポレーションが完了した後、混合し、その後、予め温めておいた培地を含む組織培養プレートに細胞を転送するために各ウェルに優しく上下にピペッティングし。ナマルバ細胞を7.5％FCS、1％ピルビン酸を添加したRPMI（ライフテクノロジーズ）で栽培されています。 </li><li>エレクトロされて​​いないコントロールサンプルは、残りの細胞懸濁液から採取し、同じようにエレクトロポレーションした細胞に予め温めておいた培養液の培養皿に追加されます。 </li><li> 37℃で一晩培養する° C、5％のCO 2。 </li><li> 24時間後、細胞の一組は、10 ng / mlの最終濃度が組換えIL - 4（R＆Dシステムズ）を誘導した。コントロール細胞の2番目のセットは、追加のメディアを受け取ります。すべての細胞は37℃、5％CO 2でさらに24時間インキュベートする。 </li></ol> 3。 RNAを抽出し、確認してください<ol><li>成長の48時間の合計した後、各ウェルの細胞をカウントし、RNA抽出のためのマイクロチューブに各ウェルから一アリコートを転送し、ウェスタンブロット法または他のタンパク質分析のための第2のアリコートを凍結する。 </li><li>細胞をペレット化するためにサンプルを遠心分離し、各チューブから上清を除去し捨てる。 </li><li> RNAの抽出を続行します。我々は一般的に含まれているプロトコルに従ってAurumトータルRNAキット（Bio - Rad）を使用してください。 </li><li>分解したRNAは、誤解を招くような結果を与えるので、siRNAを介した遺伝子ノックダウンを監視する場合には、RNAの品質を検証するために特に重要です。 280分の260の比はRNAの完全性を示すものではありませんしたがって、それは、RNAが分解されていないことを確認するためにゲルやマイクロ流体デバイス上でサンプルを実行することが重要です。 </li><li>ワンステップの質と量の両方を評価するために、これらのサンプルはExperion自動電気泳動システム（Bio - Rad）を用いて分析されます。 </li><li>最初に、熱のサンプル。その後、プライム、負荷、および渦Experion RNAチップ。 Experion電気ステーションにチップを挿入し、実行を開始します。 </li><li>実行が完了したら、Experionソフトウェア（従来のRNAに似たれるエレクトロ、結果表の形式（RNAの濃度、リボソーム比、およびRNAの品質指標番号を表示する）、および仮想ゲルに自動的に結果が表示されます。ゲル）。高品質のトータルRNAサンプルは、通常、8〜10のRQIを持つことになります。 </li> 4。リアルタイムPCR <ol><li> RNAの品質を確認した後、cDNAを反応に進んでください。この実験は、1回の反応でcDNAを合成し、リアルタイムPCRを組み合わせることiScriptワンステップRT - PCRミックス（Bio - Rad）を使用。 </li><li>各プライマーセットのRNAテンプレート以外のすべての反応成分を含むマスターミックスを作成し、PCRプレートに、それらを配布する。 </li><li>均一な濃度にRNAを希釈した後、適切なウェルにRNAサンプルを追加。各反応は三重に設定されています。 </li><li>プレートをシールし、CFX384リアルタイムPCRシステム（Bio - Rad社）に配置します。適切なプロトコルを選択して、実行を開始します。 </li><li>実行が完了すると、遺伝子発現は、コントロールsiRNAをエレクトロポレーションした細胞の同正常化への実験的siRNAをエレクトロポレーションした細胞のリファレンス遺伝子に正規化された目的の遺伝子の遺伝子発現を比較することによって決定されます。 </li></ol> 5。 siRNAのノックダウンの解析<ol><li> CCL17の発現は、CCL17のIL - 4依存的誘導に転写活性化因子STAT6の役割を調べるために定量的リアルタイムPCRを用いてモニターした。この実験では、GAPDHは、参照遺伝子として使用した。代替のリファレンス遺伝子または複数のリファレンス遺伝子は同じ方法で使用することができます。 </li><li> CFXマネージャーソフトウェアを自動的に同じサンプルから参照遺伝子の発現にCCL17の発現を正常化し、自動的に単に"基準"と対照治療としてGAPDHを選択することにより治療を制御するために、結果として得られる正規化された値を比較した（IL​​ - 4誘導することなくコントロールsiRNA）としてCFXマネージャーソフトウェアの実験の設定ウィンドウの"コントロール"。 </li><li> IL - 4誘導することなく、CCL17の転写は、対照治療に匹敵する低い、構成的な水準で推移。 </li><li> IL - 4で誘導され、通常のSTAT6経路（すなわち、コントロールsiRNAまたはトランスフェクトされていないコントロールトリートメント）保持する細胞はCCL17発現の8-10倍の誘導を示した。 </li><li> IL - 4ではなくSTAT6式のいずれかSTAT6 siRNAの導入により阻害と誘導された細胞はCCL17のIL - 4誘導発現におけるSTAT6の役割を確認する非誘導細胞よりも約2倍高いCCL17の発現を示した。 </li></ol> 6。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/1904/1904fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。 IL - 4シグナル伝達経路の概要。 その受容体へのIL - 4の）結合は、STAT6の二量体化と活性化につながる。核に移行しSTAT6を活性化し、そのようなCC17として、その標的遺伝子の転写を活性化する。 B）IL - 4誘導がなければ、CCL17の転写は低く、構成的なレベルで維持されます。 C）STAT6遺伝子のsiRNAによるサイレンシングの後、IL4による治療は、CCL17発現のほとんど、あるいは全く増加につながるはずだ。 <img src="/files/ftp_upload/1904/1904fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。 IL4により、CCL17の誘導は、定量的リアルタイムPCRによって異なる条件で測定。 A）IL - 4なし栽培のサンプルは関係なく、遺伝子発現の発現の低い構成的レベルを持っていた。 B）緑と青で示すように、対照試料には、IL - 4による処理に通常対応し、CCL17の8-10倍の誘導を。しかし、赤やピンクに示すようにSTAT6をターゲットにしたsiRNAでトランスフェクトされた細胞は、STAT6演劇CCL17のIL - 4誘導発現における役割その考えを支持する、IL - 4に対応してCCL17の発現を減少していた。 </ol>

著者はこの記事で使用する試薬や器具を生産するバイオラッドラボラトリーズによって採用されている。

この記事では、サスペンションの細胞株をトランスフェクトすると、これらの細胞で遺伝子発現を追跡する方法が困難にsiRNAをエレクトロポする方法について説明しました。この手順を行う際には、すべてのサンプルで可能な限り一貫性のある物事を保つために覚えておくことが重要S。

ナマルバ細胞におけるil - 4依存性遺伝子発現のsirnaのノックダウン：遺伝子発現研究を簡素化する自動化セルカウンターの使い方

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

siRNAを介した遺伝子ノックダウンの使用は、遺伝子発現の研究​​において重要なツールであることを続けている。 siRNAの研究は、単一の遺伝子をダウンレギュレートの効果を研究するだけでなく、シグナル伝達経路やその他の複雑な相互作用ネットワークを調べるためだけでなく、実施されています。これらの経路の分析は、関連する細胞モデルの使用および細胞生理に少ない摂動を引き起こすメソッドの両方が必要です。エレクトロポレーションは、ますます調査中のシグナル伝達経路を変更することなく、細胞株および初代培養細胞をトランスフェクトすることが困難にsiRNAや他の核酸を導入するための効果的な方法として使用されている。成功のsiRNA実験に複数の重要なステップがあります、といくつかの実験的な段階でデータの品質を向上させながら作業を簡素化する方法があります。あなたがあなたのsiRNAを介した遺伝子ノックダウンのプロジェクトで始めるための、我々は、トランスフェクション後のリアルタイムPCR遺伝子発現解析を通してエレクトロポレーションする前に細胞を収集し、カウントから完全な経路の調査を実行する方法を説明します。以下の研究では、バーキットリンパ腫細胞株（ナマルバ）におけるCCL17のIL - 4依存性遺伝子発現における転写活性化因子STAT6の役割を調査する。実証技術は、接着および浮遊細胞の両方に対するsiRNAベースの実験の広い範囲のために有用である。我々はまた、どのように同時にMXcellのエレクトロポレーションシステムを使用して複数のサンプルをエレクトロにTC10自動細胞計数器で計数セル、、そしてどのように同時にExperion自動電気泳動システムを持つRNAの質と量を評価することを合理化する方法を示します。

この手順では、細胞株をトランスフェクトし、リアルタイムPCRによる遺伝子発現を追跡することが困難にsiRNAを導入し、迅速かつ簡単なワークフローを説明します。自動細胞計数器の使用、マルチウェルエレクトロプレート、および自動化された電気泳動の駅は、高価なロボット処理を必要とせず、迅速かつ信頼性の高い結果を提供する。

ナマルバ細胞におけるIL - 4依存性遺伝子発現のsiRNAのノックダウン：遺伝子発現研究を簡素化する自動化セルカウンターの使い方

siRNAによる遺伝子ノックダウンの利用は、遺伝子発現の研究における重要なツールであり続けています。siRNAを用いた研究は、……だけでなく、……においても実施されています。

using-an-automated-cell-counter-to-simplify-gene-expression-studies

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ここでは、細胞分裂に関与する遺伝子のハイスループットスクリーニングに人間esiRNAライブラリを使用してください。我々は、セットアップとesiRNA画面だけでなく、どのように結果を分析し、検証するために実施する方法を示します。...

哺乳動物細胞におけるRNAiスクリーニングのためのミッションesiRNA

小胞体は、タンパク質の生合成とカルシウムの恒常性において重要な役割を果たしている。私たちは、私たちはCa2 +のリークチャネルの役割に対処し、それらの推定調節機構を特徴づけることを可能にする実験系を確立しています。このシステムは、siRNAを介した遺伝子サイレンシングと生細胞のCa2...

siRNAを介した遺伝子サイレンシングと組み合わせることで生細胞のカルシウムイメージングでは、CAを識別 2 + ER膜のリークチャネルとその調節機序

E4orf4誘導細胞死へのACFのクロマチンリモデリング因子の寄与を測定した。プロトコルはドキシサイクリン治療がACFユニットAcf1とSNF2hの条件付きノックダウンを誘導し、誘導細胞株でE4orf4誘導される細胞死を測定するためのDAPIアッセイを使用した細胞クローンの選択が含まれています。...

遺伝子発現とE4orf4誘発細胞死にノックダウン効果の測定のための条件付きノックダウン細胞株の作製

このプロトコルでは、Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle...

マウスマクロファージにおける先天性免疫応答を調査するために、RNA干渉を使用

蛍光標識された細胞の多重化された画像ベースの分析を可能に柔軟インフォマティクスワークフローがある発表。ワークフローは、核と細胞質のマーカーを定量化し、これらの区画の間のマーカー座を計算します。手順は、96ウェルフォーマットで、間接免疫蛍光法によってマーカーを検出するためのsiRNAで信頼性の高い方法論を用いた細胞の摂動のために提供される。...

高コンテンツ、オープンソースソフトウェアでサポートされているユニバーサル顕微鏡データからの蛍光マーカー、個々の細胞定量のワークフロー

私たちは、単一の哺乳類細胞を選別し、各細胞における最大96の標的遺伝子の発現を定量化する方法を説明しています。この方法には、絶対転写産物数の推定を可能にするための内部qPCR標準の使用が含まれます。...

内部標準でFACSおよび定量PCRを用いた単一細胞遺伝子発現プロファイリング

このプロトコルは、単球/マクロファージにおける腫瘍微小環境の募集に腫瘍細胞由来タンパク質の役割を研究するため特に癌細胞とその後続の使用で機能するテトにシステムを設定するためのスキームとして機能します。...

単球/マクロファージにおける腫瘍微小環境の採用を検討する癌細胞株における遺伝子発現の条件付きのノックダウン

このプロトコルは、そのまま神経回路内で選択的な遺伝子の発現低下と特にシナプス研究を刺激するために光遺伝学と人工のマイクロ Rna を介した RNA...

オプトジェネティクスを組み合わせてそのまま神経回路内でのシナプス前機能に関する遺伝子ノックダウンの効果を特徴付ける人工マイクロ Rna

ここでは、 Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/結合) を使用してプライマリまたは拡張された人間の自然なキラー (NK) 細胞を遺伝的に変更するためのプロトコルを提案する.このプロトコルを使用して、我々 はヒト NK 細胞 (TGFBR2) -b の成長因子受容体 2 の変換のし、ヒポキサンチン phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1)...

Cas9 Ribonucleoproteins を使用してノックアウト プライマリおよび拡張された人間の NK 細胞の生成

この実験プロトコルは、lncRNAのノックダウンとコロニー形成アッセイを組み合わせ、lncRNAが骨肉腫細胞増殖に与える影響を定量化する、安定的でコスト効率が高く効率的な方法を提供します。...

LncRNAノックダウン骨肉腫細胞の増殖能力を検出するコロニー形成アッセイ

学ぶ 電気穿孔法によるsiRNA導入とリアルタイムPCRを用いた遺伝子発現解析の自動化ワークフロー。難トランスフェクション細胞におけるSTAT6ノックダウンとIL-4誘導経路の定量評価手法を習得できます。

ナマルバ細胞におけるIL - 4依存性遺伝子発現のsiRNAのノックダウン：遺伝子発現研究を簡素化する自動化セルカウンターの使い方

さらに動画を探す