ナマルバ細胞におけるIL - 4依存性遺伝子発現のsiRNAのノックダウン：遺伝子発現研究を簡素化する自動化セルカウンターの使い方

本手順の全体的な目的は、エレクトロポレーションを用いて導入困難な細胞にsiRNAを導入し、遺伝子発現を解析することです。まず、TC 10 自動細胞計数装置を用いて必要な細胞懸濁液の量を決定し、次に細胞懸濁液にsiRNAを添加して、細胞をエレクトロポレーションします。

MXLエレクトロポレーションシステムを用いて、エレクトロポレーション後24時間細胞をインキュベートします。次に、実験群の細胞にIL-4を添加し、遺伝子転写を誘導します。最後に、RNAを抽出し、リアルタイムPCRを用いて遺伝子発現レベルを測定します。

最終的に、特定のsiRNAが遺伝子発現経路に及ぼす影響を示す結果を得ることができます。こんにちは。Bio Rad Laboratoriesの遺伝子発現部門でシニアサイエンティストを務めているAdam McCoyです。本日は、エレクトロポレーションを用いて、トランスフェクションが困難な細胞株にRNAを導入し、その後の遺伝子発現への影響を調べる手順をご紹介します。

当研究室では、単一遺伝子の発現解析や、ある遺伝子をノックアウトして下流への影響を調べることによる遺伝子パスウェイの研究に本手順を用いています。それでは、始めていきましょう。細胞培養用フード内で、培養フラスコから細胞を回収します。

本プロトコルで使用する細胞は浮遊細胞です。接着細胞を使用する場合は、回収前にトリプシン処理を行う必要があります。細胞を遠心分離してペレット化してください。

細胞を遠心分離した後、上清を除去し、PBSで細胞を再懸濁します。生存細胞数を決定するために、細胞懸濁液のアリコートを採取し、死細胞を染色するためにトリパンブルー染色液を1:1の比率で加えます。生存細胞と死細胞の評価にはトリパンブルーが必要ですが、総細胞数のカウントには必要ありません。

混合液を使い捨て計数スライドの開口部にピペットで滴下し、TC 10自動細胞カウンターに挿入します。TC 10は、まずオートフォーカスを行い、最も正確な計数を確認した後、細胞の計数を開始します。サンプル1mLあたりの生存細胞数および総細胞数が表示されます。

「view image」を選択し、ビュー画面に細胞を表示させます。次に、上または下矢印を使用して、必要に応じてズームインまたはズームアウトを行い、実験に必要な細胞懸濁液の量を算出するために「dilution calculator」を選択してください。

この実験で必要となる目標濃度と最終容量の値を入力してください。各処理について重複サンプル（デュプリケート）を含め、合計16サンプルを調製します。したがって、5 × 10⁶ cells/mLの懸濁液が合計3.6 milliliters必要になります。

次に、細胞カウンターが生細胞数と入力した目標値に基づいて、必要な細胞懸濁液の量を算出します。TRIAM blueを使用した場合は、カウンターが1対1希釈分を自動的に調整します。ここで、クリーンベンチ内で、算出された量の細胞懸濁液を新しいチューブに分注します。

次に、細胞混合液を遠心分離して細胞をペレット化します。細胞の遠心分離中に、各マイクロ遠心チューブにSIR Aを添加し、エレクトロポレーションの準備を行います。本実験では、1つのコントロールsiRNA、2つのstat6特異的siRNA、および未処理コントロールを調製します。遠心分離後、PBSを除去し、3.6 mLのGene Pulserエレクトロポレーションバッファーで細胞を再懸濁させます。適切なsiRNAを含むチューブに800 µLずつ分注し、静かに混合します。

これで細胞の準備が整い、すべてのサンプルを同時にエレクトロポレーションすることが可能です。MXLエレクトロポレーションシステムを用い、各細胞懸濁液150 µLを96ウェルエレクトロポレーションプレートの適切なウェルに分注します。次に、プレートをMXLエレクトロポレーションシステムのプレートチャンバーに設置し、蓋を閉じます。

目的のエレクトロポレーションプロトコルを選択し、パルスボタンを押して細胞に電気穿孔を行います。エレクトロポレーションの完了後、プレートを装置から取り出し、あらかじめ温めておいた培地を入れた新しい組織培養プレートに細胞を移します。次に、各サンプルにつき150 µLの非処理コントロール細胞を新しいディッシュに移します。その後、細胞を37 °C、5% CO2の条件下で一晩培養します。

24時間後、一方の細胞群にはIL fourを加えて遺伝子転写を誘導し、もう一方の細胞群には培地のみを添加します。細胞にIL fourを1つ添加します。計48時間の培養後、37°C、5% CO2条件下でさらに24時間インキュベートします。

実験的処理が細胞分裂に影響を与える場合、細胞密度に大きな差が生じることがあります。そのため、TC 10自動細胞カウンターを使用して、細胞数を迅速に再計測することをお勧めします。各ウェルから1アリコート分をRNA抽出用のマイクロ遠心チューブに移し、凍結保存します。

ウェスタンブロッティングまたはその他のタンパク質分析用の2回目の分注量。本日はRNAワークフローのみを提示します。サンプルを遠心分離し、細胞をペレット化します。

次に、各チューブから上清を取り除き、廃棄します。orum total RNA kitを用いてRNA抽出を行います。RNAを抽出したら、サンプルを氷上に保持したまま、直ちに分析に進んでください。

RNAの品質と量を一度に検証するため、Experian自動電気泳動装置を使用します。サンプルとExperian RNAラダーを熱変性させ、氷上に置きます。あらかじめ調製したゲルと染料の混合液をプライミングウェルに添加し、プライミングステーションでプライミングコードを設定します。

チップを自動プライミングステーションに設置し、スタートボタンを押します。プライミングステーションからチップを取り出し、ロードを行います。チップをボルテックスし、サンプルとローディングバッファーを混合させます。

チップを電気泳動ステーションにセットし、ランを開始します。Experianソフトウェアにより、エレクトロフェログラム、RNA濃度、リボソーム比、RNA品質指標（RQI）数値を表示する結果テーブル、および従来のRNAゲルに似た仮想ゲル形式で結果が自動的に表示されます。高品質な全RNAサンプルでは、通常、RQIが8から10になります。

RNAの品質を確認した後、ここでcDNA合成反応を準備します。cDNA合成とリアルタイムPCRを統合するため、IS script ONEstep RT-PCRミックスを使用します。1つの反応につき、各プライマーセットに対するRNAテンプレート以外のすべての反応成分を含むマスターミックスを作成してください。

次に、混合液をPCRプレートのウェルに分注します。RNAを一定の濃度に希釈した後、サンプルを適切なウェルに3連（トリプリケート）で加えます。プレートを密閉してリアルタイムPCR装置にセットし、適切なプロトコルを選択してランを開始します。ランが完了したら、リアルタイムトレースを用いて発現レベルを決定します。

このソフトウェアは、処理細胞および対照細胞における実験遺伝子と参照遺伝子の相対発現に基づき、データから正規化された遺伝子発現量を算出します。この図は、IL-4シグナル伝達経路の概要を示しており、IL-4がその受容体に結合します。これによりSTAT6の二量体化と活性化が誘導され、活性化したSTAT6が核内に移行して標的遺伝子の転写を活性化します。

CCL 17などの遺伝子において、IL-4による誘導がない場合、STAT6遺伝子をsiRNAでサイレンシングした後、CCL 17の転写は低い構成的レベルに留まります。IL-4による処理を行っても、CCL 17の発現はほとんど、あるいは全く増加しないはずです。IL-4によるCCL 17の誘導を、定量リアルタイムPCRを用いて異なる条件下で測定しました。

IL-4を添加せずに培養したPCRサンプルでは、構成的な発現レベルが低くなっていました。siRNAの有無にかかわらず、緑色と青色で示されるコントロールサンプルはIL-4処理に対して正常に反応し、CCL17が8〜10倍に誘導されました。しかし、赤色と桃色で示されるSTAT6を標的としたsiRNAを導入した細胞では、IL-4に対するCCL17の発現反応が減衰しており、STAT6がIL-4誘導性のCCL17発現に関与しているという考えを支持する結果となりました。

以上で、 transfection が困難な浮遊細胞株への siRNA の導入方法と、それらの細胞における遺伝子発現の追跡方法について説明しました。この手順を行う際は、すべてのサンプル間で条件を可能な限り一定に保つことが重要です。以上で終了です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。