Name: 電離放射線への応答でγH2AX病巣の定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-06T19:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: 学ぶγH2AX免疫蛍光法によるDNA二重鎖切断の定量解析。ヒト細胞を用いた放射線応答評価とDNA修復メカニズムの可視化手法を習得し、放射線治療開発への応用可能性を理解する。

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オーストラリア原子科学技術学会のサポートが認められています。 TCKはAINSE賞を受賞しました。エピ医学研究所は、国立保健オーストラリアの医学研究評議会（566559）でサポートされています。 LMは、メルボルン研究所（メルボルン大学）と医学のCRCの補助金によってサポートされています。モナッシュマイクロイメージング（博士スティーブンコーディとISKAカーマイケル）のサポートは、この仕事のための非常に貴重でした。

細胞の準備<ol><li> ℃、5％CO 2で37、上皮成長因子、ウシ下垂体抽出物と20μg/ mlのゲンタマイシンを補った、ヒトケラチノサイト（FEP - 1811）は、ケラチノサイト、無血清培地（Invitrogen社製K - SFM）で増殖させた。 </li><li>単一の細胞懸濁液をトリプシン- EDTA（0.05％v / v）で切り離すことによって調製した</li><li>細胞は8ウェルラボテックIIマイクロチャンバースライドに播種（10,000細胞/ウェル）とスライドは、37℃、5％CO 2で3日間インキュベートした。 </li></ol>照射<ol><li>細胞は、137 Csのソース（; Nordionインターナショナル、カナダ、ON、20.6秒/ GyをGammacell 1000年エリート照射器）を用いて、2 Gyで氷の上に照射された</li><li>非照射コントロールと2 Gyの照射された細胞は37℃、5％CO 2で1時間インキュベートした。 </li></ol>免疫蛍光染色<ol><li>メディアは、オフチップを渡したし、細胞をウェルあたりPBSの300μl（W / OのCa 2 +またはMg 2 +）で洗浄し、5分間オービタルミキサー上で回転であった。 </li><li>バッファはオフチップを渡したとパラホルムアルデヒドを各ウェルに添加し、スライドを室温で10分間インキュベートし、新たに調製した4％（v / v）を100μlのした。 すべてのインキュベーションは加湿染色トラフで実施された</li><li>次いで、細胞をPBS（W / OのCa 2 +またはMg 2 +）で洗浄した。スライドを5分間軌道ミキサーにコプリンジャーと回転に置かれた。この洗浄ステップは、さらに2回繰り返した。 </li><li>バッファはオフチップを渡したされ、過剰のPBSを穏やかにブロットした。 </li><li>細胞は100ミリリットルトリトンX - 100（0.1％v / v）のウェル当たり、室温で10分間のインキュベーションを用いて透過処理された。 </li><li>細胞をPBSで洗浄し（W / OのCa 2 +またはMg 2 +）として手順3および4で説明されている。 </li><li>非特異的タンパク質の結合は室温でウェルあたりBSAの100ミリリットル（1％v / v）を、20分間のインキュベーションでブロックした。 </li><li>過剰BSAは、オフチップを渡したされ、一次マウスモノクローナル抗リン酸化ヒストン- H2AX抗体（1％BSAで、1:500に希釈し、ミリポア）100μlのは、室温で1時間のインキュベーションのために各ウェルに添加した。 </li><li>細胞をPBSで洗浄し（W / OのCa 2 +またはMg 2 +）として、上記の手順3と4で説明されていると二次抗体液100μl（のAlexa Fluor ® 488ヤギ抗マウスIgGとインキュベートは1％BSAで、1:500に希釈、暗所で室温にて45分間、ウェルあたりInvitrogen社）。 （希薄化抗体は、プロシージャ全体に暗所で保管された） </li><li>細胞をPBSで洗浄し（W / O カルシウムイオン又はMg 2 +）として手順3および4で説明されている。しかし、光への曝露は、箔を用いて最小化した。 </li><li>核の対比は、100ミリリットルTOPRO3（1:500に希釈;インビトロジェン社）を用いて行ったウェルあたり、室温で10分間のインキュベーション</li><li>細胞は、上記の手順10で説明されているPBS（W / OのCa 2 +またはMg 2 +）で洗浄した。 </li><li>チャンバーを慎重にスライドから削除された、余分な水分を吸い取りされ、スライドを空気乾燥された。 </li><li> GOLD抗フェード液（Invitrogen）を褪色の一滴ごとによく添加し、スライドがマウントされた（22x50ミリメートルカバー）とスライドのエッジの周りに余分な液体をブロットした。 </li><li>スライドはマニキュアで密封する前に、さらに室温で30分間暗所に格納されていました。 </li><li>スライドは4℃で一晩保存した° C分析の前に暗闇の中で。 </li></ol>顕微鏡/分析<ol><li>ツァイスLSM510メタ焦点標準GFPを使って画像を取得するために使用されるMicroscpe（γH2AXのための - のAlexa Fluor ® 488ヤギ抗マウスIgG）と遠赤色レーザー（TOPRO - 3）。通常は、63 ×油浸対物レンズが使用されます。 画像は、0.5μmのステップサイズとZシリーズのパターンで取得されています。 0.5μmのステップサイズは、核内の別の面での焦点の現在の損失を最小限に抑えるために選ばれました。分析中に、個々の平面は巣（トップハットフィルタが適用された）の重複を最小限に抑えるために最大限の投影画像を生成するデコンボリューションと積層される。 </li><li> Metamorph（Molecular Devices社、米国）は、病巣の数を分析するために使用されました。 しきい値がバックグラウンドを排除するために適用された後のプログラムは、各セル内の病巣の数をquantitates。情報をさらに分析するためのMicrosoft Excelスプレッドシートに記録されます。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1957/1957fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図1"> 図1未治療のヒトケラチノサイトにおいて、2 Gyで照射し、37℃でさらに1時間インキュベートした細胞でγH2AX病巣（緑）の免疫蛍光可視化° C、5％CO 2。 DNAはTOPRO - 3（青）で染色した。画像は、ツァイスLSM 510メタ共焦点顕微鏡を用いて取得した。バー= 10μmの。 e_content"&gt; <img src="/files/ftp_upload/1957/1957fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図2"> 図2ヒトケラチノサイトにおいて、2 Gyで照射し、37℃でさらに1時間インキュベートした細胞でγH2AX病巣（緑）の免疫蛍光可視化° C、5％CO 2。画像は、巣が取得されたすべてを確実にするために、Z -セクショニング（1-9）は0.5μmを使用してツァイスLSM 510メタ共焦点顕微鏡を用いて取得した。画像はMetamorphを使用して定量化に積層した。 DNAはTOPRO - 3（青）で染色した。スタックγH2AXと青のイメージが可視化のために積層した。バー= 10μmの。

<ol><li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li>
<li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma+H2AX+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gamma H2AX and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li>
<li>Savic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+Dynamic+%5Bgamma%5D-H2AX+Domains+along+Broken+DNA+Strands+Is+Distinctly+Regulated+by+ATM+and+MDC1+and+Dependent+upon+H2AX+Densities+in+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Formation of Dynamic [gamma]-H2AX Domains along Broken DNA Strands Is Distinctly Regulated by ATM and MDC1 and Dependent upon H2AX Densities in Chromatin.</a> Molecular Cell. 34 (3), 298-310 (2009).</li>
<li>Downs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+chromatin-modifying+activities+to+phosphorylated+histone+H2A+at+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Binding of chromatin-modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites.</a> Mol Cell. 16 (6), 979-990 (2004).</li>
<li>Chowdhury, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5Bgamma%5D-H2AX+Dephosphorylation+by+Protein+Phosphatase+2A+Facilitates+DNA+Double-Strand+Break+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">[gamma]-H2AX Dephosphorylation by Protein Phosphatase 2A Facilitates DNA Double-Strand Break Repair.</a> Molecular Cell. 20 (5), 801-809 (2005).</li>
<li>Nakada, S., Chen, G., Gingras, A., Durocher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PP4+is+a+gamma+H2AX+phosphatase+required+for+recovery+from+the+DNA+damage+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">PP4 is a gamma H2AX phosphatase required for recovery from the DNA damage checkpoint.</a> EMBO Rep. 9 (10), 1019-1026 (2008).</li>
<li>Altaf, M., Auger, A., Covic, M., Côté, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connection+between+histone+H2A+variants+and+chromatin+remodeling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Connection between histone H2A variants and chromatin remodeling complexes.</a> Biochem Cell Biol. 87 (1), 35-50 (2009).</li>
<li>Kusch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+by+Tip60+Is+Required+for+Selective+Histone+Variant+Exchange+at+DNA+Lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acetylation by Tip60 Is Required for Selective Histone Variant Exchange at DNA Lesions.</a> Science. 306, 2084-2087 (2004).</li>
<li>Hurlin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+human+papillomavirus+type+18-immortalized+human+keratinocytes+to+a+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (2), 570-574 (1991).</li>
<li>Dickey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+functional+roles+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. , Forthcoming (2009).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

電離放射線（γ線）、急速にγH2AX巣の形と巣の番号への曝露後には30〜60分2との間で最大に達する。したがって、私たちの1時間照射後の時点では、初期のDSBの形成を反映している。我々は我々の実験に2 Gyの臨床的に関連する放射線量を使用している。しかし、方法は、初期のDSBの形成の検出を4 Gyに被曝線量のために、最大使用することができます。巣の大幅なオーバーラップは高用量では正確な定量を妨げる。 γH2AX巣を定量化数値で、その結果、修復するために失われているように高い放射線量は、より長い照射後のインキュベーション時間のために使用することができます。通常は、4時間、最大24時間照射後のインキュベーション時間は、DNA修復を監視するために使用されています。我々は共焦点顕微鏡の励起レーザーに制限があるため、DNA染色TOPRO - 3を使用している。より一般的に、4,6 - ジアミジノ-2 - フェニル二塩酸塩（DAPI）は核の対比染色に使用されます。我々は共焦点顕微鏡を使用しましたが、Z -セクショニング容量の落射蛍光顕微鏡が適しています。免疫蛍光法では、他の接着性癌と正常な細胞株に適しています。我々はヒト神経膠...

<table><tbody><tr><td>ケラチノサイト無血清培地 (K-SFM)</td><td>培地</td><td>Invitrogen</td><td>17005042</td><td>ヒト組み換え表皮成長因子 1-53 (EGF 1-53) および牛下垂体エキス (BPE) を添加したケラチノサイト用培地。</td></tr><tr><td>Lab Tek II チャンバースライド (8-well)</td><td>チャンバースライド</td><td>Nalge Nunc international</td><td>NUN154534</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス (22x50mm)</td><td>カバーガラス</td><td>Menzel-Glaser</td><td>CS2250100</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>非特異的な抗体結合をブロックするために BSA (1%) を使用する。一次抗体および二次抗体は BSA で希釈する。</td></tr><tr><td>PBS (Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;および Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;不含)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>0.5% Trypsin-EDTA x10</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td>培養フラスコから細胞を剥離させるために Trypsin-EDTA (0.05%) を使用する。</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>細胞を透過させるために Triton X-100 (0.1%) を使用する。</td></tr><tr><td>パラフォルムアルデヒド</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>細胞を固定するためにパラフォルムアルデヒド (4%) を使用する。</td></tr><tr><td>マウスモノクローナル抗リン酸化ヒストンH2AX抗体</td><td>一次抗体</td><td>EMD Millipore</td><td>16193</td><td>1% BSA 中での一次抗体の希釈倍率 (1:500)。</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウス IgG (H+L)</td><td>二次抗体</td><td>Invitrogen</td><td>11029</td><td>1% BSA 中での二次抗体の希釈倍率 (1:500)。</td></tr><tr><td>TOPRO3</td><td>DNA染色剤</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td>一般的に使用されるDNA染色剤：4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩 (DAPI)。適切な励起レーザーを備えた顕微鏡でのみ使用可能。</td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>退色防止剤</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>20&amp;#x00B0;C における屈折率は 1.42。</td></tr><tr><td>組織培養フラスコ、ベントキャップ</td><td>培養フラスコ</td><td>BD Biosciences</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>組織培養ディッシュ (150x25mm)</td><td>シャーレ</td><td>BD Biosciences</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>コプリンジャー、ガラス製</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>1771-OG</td><td></td></tr><tr><td>染色槽</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>V1991.99</td><td></td></tr><tr><td>Gammacell 1000 Elite Irradiator</td><td>ガンマ線照射装置</td><td>Nordion International Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 Meta 共焦点顕微鏡</td><td>共焦点顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>画像解析ソフト</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

電離放射線への応答でγh2ax病巣の定量化

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

内因性の代謝プロセスによって、または外因性の要因によって誘発されるDNA二重鎖切断（DSB）は、ゲノムの完全性の生存と保全に関して、最も重要なDNA損傷の一つです。 DSBが誘導に早期の反応はγH2AXを形成し、高度に保存されたC末端SQEYモチーフに、セリン- 139残基において、H2Aヒストンバリアント、H2AXのリン酸化です。<sup&gt; 1</sup&gt;。 DSBの誘導後、H2AXは急速にホスファチジル- inosito 3 - キナーゼ（PIKK）タンパク質のファミリー、毛細血管拡張性運動失調変異（ATM）、DNA -プロテインキナーゼ触媒サブユニットとATMとRAD3関連によってリン酸化される（ATR）<sup&gt; 2</sup&gt;。通常は、わずか数塩基対（bp）はDNA損傷のシグナル伝達と修復におけるクロマチン修飾の重要性に鑑み、しかし、重要な信号増幅があると、DSBに関与している。 H2AXのリン酸化はDSBごとの全細胞H2AXの約0.03％に影響を与える、クロマチンの隣接区域にATMスプレッドによって主に仲介<sup&gt; 2,3</sup&gt;。これは簡単に可視化し、免疫蛍光顕微鏡法で定量することができる離散γH2AX病巣の形成にDSBと結果のサイトを取り巻くクロマチンの〜2 MBP領域にまたがる約2000 H2AX分子のリン酸化に対応<sup&gt; 2</sup&gt;。 DSBでγH2AXの損失が修理を反映して、しかし、DSBが完全な修復を定義するものとして、いくつかの論争がある、それはDNAの両鎖の再結合は、それがものそれが再instatement示唆されている、しかし十分であることが提案されている圧縮のオリジナルのクロマチンの状態が必要です。<sup&gt; 4月8日</sup&gt;。 γH2AXのdisappearenceは、少なくとも部分的に含む、ホスファターゼ、ホスファターゼ2Aおよびホスファターゼ4Cによって脱リン酸化<sup&gt; 5,6</sup&gt;。さらに、H2A.Zとヒストン交換を含む再分配によってγH2AXの除去が関与している<sup&gt; 7,8</sup&gt;。重要なのは、γH2AX病巣の定量分析は、医療、原子力研究の幅広い用途につながっている。ここで、我々は、γ線照射接着ヒトケラチノサイトにおけるγH2AX巣の検出および定量することによって、初期DNA損傷の評価のための最も一般的に使用される蛍光抗体法を示す<sup&gt; 9</sup&gt;。

分子マーカーとしてγH2AX形成を用いてDNA二本鎖縞の定量化は、放射線生物学における非常に貴重なツールとなっています。ここでは、放射線に対する細胞の曝露後のγH2AX病巣の定量化のための免疫蛍光アッセイの使用方法を示しています。

電離放射線への応答でγH2AX病巣の定量化

内因性の代謝プロセスまたは外因性の要因によって誘発されるDNA二本鎖切断（DSB）は、最も深刻なDNA損傷の一つであり、...

こんにちは。私はBaker Eye, DI Heart and Diabetes InstituteのTom Caris博士が率いるエピゲノム医学研究室のIan Maです。私は現在、博士課程に在籍しており、二重鎖切断の分子マーカーであるγ-H2AXに対する放射線の影響に重点を置いて研究を行っています。本日は、ヒト細胞におけるガンマ線照射に応答したγ-H2AXの定量実験について実演します。この免疫染色プロトコルは、初期のDNA損傷とDNA修復の両方をモニターするために使用できます。また、この方法は放射線修飾化合物の潜在的な有効性を評価するためにも有用です。例えば、DNA損傷を増加させると予想される放射線増感剤は、より多くの$\gamma$H2AXフォーカスをもたらしますが、放射線防護剤はDNA二重鎖切断を減少させるため、検出されるフォーカス数が少なくなるといった逆の効果を示します。それでは、実験を開始します。本実験で使用する細胞はヒトサイトサイトであり、各ウェルに10,000個の細胞を播種したチャンバースライドで調製します。スライドは照射前の3日間、37 °C、5% 二酸化炭素条件下でインキュベートします。トランスポーター2D照射装置を氷上でスライスし、2 grayで照射します。一方、対照スライドは未照射のままにします。照射後、スライドを1時間インキュベーターに戻します。このインキュベーション期間により、初期のDNA損傷を観察することが可能になります。次に、染色を行います。まず、ウェルを慎重に形成し、チャンバー内に300 µLの塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムフリーPBSを添加します。細胞を洗浄するため、プレートシェーカー上で5分間静置した後、PBSをゆっくりと傾けて除去します。次に、100 µLの4%パラアルデヒドで細胞を固定し、室温で10分間静置した後、PBSを満たしたコットン瓶に入れ、プレートシェーカーで5分間振盪します。この洗浄ステップを繰り返し、計3回、各5分間の洗浄を行います。洗浄後、スライドを吸収紙の上でそっと乾燥させます。余分なPBSを除去した後、細胞に100 µLの0.1% Triton X-100を加え、室温で10分間置きます。10分後、前述と同様に、PBSで3回、各5分間スライドを洗浄します。次に、非特異的結合を阻止するため、1%BSAを100 µL各ウェルに添加し、20分間静置します。ブロッキング後、BSAを振り落とし、500倍に希釈した抗 phospho-γH2AX 抗体100 µLを各ウェルに添加します。スライドを室温で1時間静置した後、PBSで5分間の洗浄を3回行います。余分なPBSを振り落とし、Alexa fluor 488 goat anti mouse IgGを500倍に希釈した二次抗体100 µLを各ウェルに加え、暗所

quantification-of-h2ax-foci-in-response-to-ionising-radiation

Research

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Biology

生物学

γH2AX巣に基づいてDNA二本鎖切断の定量は、組織の放射線感受性と放射線修正する化合物の作用の評価に、特に放射線の生物学では、非常に貴重なツールとなっています。ここでは、組織サンプルにおけるγH2AX病巣の定量のための免疫蛍光アッセイの使用方法を示しています。...

組織サンプルのγH2AX病巣の定量

DNA二本鎖切断に対する応答のSer -...

電離放射線は、次のγH2AXの空間分布の評価

マウス脾臓リンパ球への慢性的なin vivo低線量照射によって誘発される可能性のあるDNA損傷レベルとDNA修復能力の変化を評価するためのプロトコルが、フローサイトメトリーを使用してDNA二本鎖切断のマーカーであるリン酸化ヒストンH2AXを測定することによって提示されます。...

慢性後のマウス脾細胞におけるDNA損傷と修復の測定<em&gt;インビボ</em&gt;β-およびγ-放射線の非常に低い用量への暴露

この原稿は、γH2AX、53BP1 の蛍光顕微鏡による DNA...

ΓH2AX、53BP1 形成と DNA 二重鎖切断の修復を分析するための蛍光顕微鏡観察

蛍光顕微鏡を用いた過渡的長期的な二本鎖 DNA 切断の DNA 修復プロセスの特性

提示された方法は、DNA二本鎖切断(DSB)、細胞周期分布およびアポトーシスの定量分析を組み合わせて、DSB誘導および修復の細胞周期特異的評価と修復失敗の結果を可能にする。...

フローサイトメトリーによる無毒ストレス後のγH2AXとアポトーシスの細胞周期特異的測定

ホウ素中性子捕捉療法(BNCT)に用いられる中性子混合ビームによる放射線誘発DNA損傷応答は完全には確立されていない。このプロトコルは、中性子混合ビームを照射した後のヒト大腸癌細胞株における免疫蛍光染色による修復タンパク質の放射線誘発病巣(RIF)を検出するためのステップバイステップの手順を提供する。...

ヒト大腸癌細胞におけるDNA損傷および修復病巣の免疫蛍光イメージング

DNA損傷の後、ヒト細胞はゲノムの完全性を回復するために不可欠な修復経路を活性化する。ここでは、DNA修復タンパク質を検出し、その空間的および時間的なリクルートメントを分析し、DNA損傷部位におけるタンパク質とタンパク質相互作用を問い合わせた手段として、間接的な免疫蛍光の方法を説明する。...

免疫蛍光によるDNA修復タンパク質相互作用の可視化

このプロトコルは、末梢血リンパ球に対するγ-H2AX病巣アッセイのスライド調製および自動スコアリングを提示する。アッセイの方法および感度を例示するために、単離リンパ球を インビトロで照射した。DNA...

ヒト末梢血リンパ球におけるγ-H2AX Fociアッセイの自動微視的スコアリング法

このプロトコルは、ブレオマイシン処理されたヒト末梢リンパ球の間期核におけるγH2AXおよび53BP1病巣の同時検出を通じて、DNA二本鎖切断の形成および修復を評価する方法を提示する。...

ヒト末梢リンパ球におけるγH2AXと53BP1の二重免疫蛍光法

ここでは、DNA損傷部位でのタンパク質相互作用を検出するためのシンプルで迅速なプロトコールを紹介します。...

DNA損傷部位におけるタンパク質の局在化のための近接リガンドアッセイ

学ぶγH2AX免疫蛍光法によるDNA二重鎖切断の定量解析。ヒト細胞を用いた放射線応答評価とDNA修復メカニズムの可視化手法を習得し、放射線治療開発への応用可能性を理解する。

電離放射線への応答でγH2AX病巣の定量化

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