マイクロパターン化表面でのタンパク質間相互作用の in vivo検出

細胞の代謝と機能を調節するメカニズムを理解するためには、生細胞内における分子間の相互作用ネットワークを解明することが極めて重要です。定性的および定量的な情報を提供する手法が数多く登場しており、それが細胞機能の全体像を把握するための原動力となっています。Co ip、TAP tag、または光架橋法などのアッセイを用いることで、in vitroでプレ分子の精製が可能になります。

さらに、生細胞内におけるタンパク質相互作用を解析するために、いくつかの手法が設計されました。これには、蛍光タンパク質を用いた2種類のハイブリッドスクリーニングまたは相補性アッセイが含まれます。また、この課題に対処するために、FRETやFCSなどの分光学的アプローチや、非分光学的な手法も確立されています。

前述の手法は、大規模な細胞集団を記録するために開発されましたが、かなり間接的な手法であるため、定量性に欠けるという課題があります。対照的に、いくつかの高度な定量的アプローチが導入されました。しかし、ハイスループット性能と定量的な情報の抽出可能性を両立させつつ、さらにスループットを向上させることは困難です。

私たちは最近、タンパク質間相互作用を同定するための新しいコンセプトを開発しました。ここでのマイクロパターニング技術は、BSA Sci 5のマイクロパターニングSAグリッドの模式図であり、機能化されたガラスカバースリップ上にプリントされ、その間隙がストレプトアビジン、次いでビオチン化リガンドで充填されています。ほとんどの場合、膜に対する抗体が使用されます。

このようなマイクロバイオームチップ上で培養された細胞におけるタンパク質ベイト。ベイトは抗体のマイクロパターンに従って細胞膜に配置されます。蛍光標識された2つ目のタンパク質プレイとの相互作用は、共パターンの程度を測定することで調べられます。特徴的なサイズと深さを持つ正方形の配列を備えたシリコンマスターPDMSスタンプを使用します。

3 µmのスタンプをゲルから作製し、切り出します。スタンプを100% ethanolおよび二重蒸留水で洗浄し、あらかじめ窒素で乾燥させます。その後、0.67 mg/mLのsci-fiとともにインキュベートします。

室温で30分間、ラベル付きBSA溶液でインキュベートします。エポキシ修飾ガラスカバースリップも同様の方法で洗浄します。インキング後、スタンプをPBSと水で同様に洗浄します。BSA sci five Transfer用。

スタンプを窒素で乾燥させ、その後すぐにガラスカバースリップの下に自重で密着させ、30 Minutes放置します。マイクロパターンの領域の位置をカバースリップの裏面にマークします。スタンプを取り外した後、カバースリップを接着剤付きシリコンマスクで封印します。

チャンバーに50 µg/mLのストレプトアビジン溶液を注入して1時間インキュベートし、その後1 mLのPBSで洗浄します。続いて、ストレプトアビジンパターンを10 µg/mLのビオチン化抗体で1時間インキュベートし、PBSで洗浄した後にチャンバーへ細胞を注入します。細胞が表面に接着すれば、サンプルの測定準備は完了です。

読み取りに必要な唯一の要件は、全反射構成でサンプルを照明できる蛍光顕微鏡です。このようなシステムはさまざまなサプライヤーから市販されており、ここ数年でユーザーにとって扱いやすくなっています。本研究の検出システムは、エピ蛍光顕微鏡上に構築されています。

使用した蛍光色素サンプルの選択的な蛍光励起には、アルゴンおよびクリプトンイオンレーザーを使用します。サンプルは、100倍の高NA油浸対物レンズを用いた対物レンズベースの全内部反射構成で照射されます。標準的なフィルターセットを用いて適切にフィルタリングした後、蛍光を裏面照射型CCDカメラで結像させます。読み出しは時間遅延積分（TDI）モードで実行され、これにより広範囲のサンプル領域のスキャンが可能になります。そのため、カメラのラインシフトに同期した電動XYステージを用いてサンプルを移動させます。

後方反射されたレーザービームを2セグメントフォトダイオードで結像させ、その差分信号を用いてZピエゾを制御し、高速な再フォーカスを行います。リーダーには、スキャンプロセス中に動作する自動フォーカス保持システムが搭載されており、1回目のスキャンはGFPを選択的に励起させるために488 nanometerで、2回目のスキャンはPS Fiveを選択的に励起させるために647 nanometerで行われます。データ解析には、捕捉された抗体領域の内側と外側の蛍光強度に基づき、MATLABで作成したコントラスト計算プログラムを使用します。

多数の細胞を迅速に解析するため、コントラストレベル、およびそれによるタンパク質相互作用の程度を分析します。また、市販の自動解析ソフトウェアを使用することも可能です。例えば、Olympus社が提供するscan Rイメージングソフトウェアは、マイクロパターニング実験のコントラスト評価において有効であることが確認されています。

ここでは、初期T細胞シグナリングにおけるCD4とLCKというタンパク質のよく知られた相互作用を解析します。蛍光標識したLCKが、CD4抗体でコーティングされた領域に明確に再分布しています。これら2つのタンパク質の主要な相互作用部位である亜鉛クラスプ構造を、亜鉛キレート剤の添加によって破壊すると、その後のLCKマイクロパターンのコントラストが低下します。

要約すると、マイクロパターニング技術の主な利点は以下の通りです。局所的に空間分解されたタンパク質相互作用の定量化。さらに、生存細胞の細胞膜における弱い相互作用の検出、調節されたベイト・プレイ相互作用の検出、静止状態の解析、および本アプローチの高スループットへの適用可能性が挙げられます。