Name: マウス生物発光肝腫瘤モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 23 s
Description: 学ぼうマウスにおける生体発光肝腫瘍誘導法。脾臓分割と腫瘍細胞移植により肝転移モデルを作製し、非侵襲的な発光イメージングで腫瘍成長をリアルタイムに可視化・定量化する技術です。

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この作品は、コーク南診療所ビクトリア大学病院乳ファンド、アイルランド癌協会（CRI07TAN）とコークがん研究センターで賄われていた。安定的にルシフェラーゼを発現するルイス肺癌細胞株は、セルジェネシス社、サンフランシスコ、アメリカ、ヨースカリン博士から親切な贈り物だった。

はじめ肝臓は多くの場合、転移性疾患の最初のサイトであり、先進的な疾患を有する患者のように多くの40 30％程度の広がりの唯一のサイトかもしれません。しかし、転移性肝腫瘍を治療するためのオプションは、切除するのに適した少数の患者にはいくつかあり、化学療法への唯一の23％が主要なレスポンダー。この分野の臨床研究は、分離された肝疾患を研究するために適切なマウスモデルの不在によって制限されています。我々は確実に均一な、びまん性肝転移を確立するために使用することができる分割脾臓のアプローチを説明します。脾臓のこの半分の切除は、脾腫瘍の増殖の影響を回避し、脾臓の残りの半分は、脾臓の免疫保護特性を維持するためにそのままのポータル循環に戻されます。我々が説明するモデルは、実行するために非常に簡単ですし、単一の切開を通じて迅速に行うことができます。腫瘍細胞株の生物発光特性は、動物の犠牲なしに、治療に対する反応の正確な定量が可能になります。 プロトコル I.細胞の調製<ol><li>ルイス肺癌細胞を37℃、10％ウシ胎児血清を添加したダルベッコ改変必須培地° C、5％CO 2を成長させ、トリプシン処理するときにサブコンフルエントによって収穫されています。 </li><li>細胞は無血清培地で調製したNucleocounter（ケモmetec、デンマーク）と200μlの1 × 10 6細胞の単一の細胞懸濁液を用いてカウントした。 </li></ol> II。マウスの準備注：すべての手順は、コーク大学の倫理委員会によって承認された。私たちのラボでは、マウスを麻酔注射麻酔薬を使用して、別の方法として、同じ効果を達成するために吸入麻酔薬を使用することができます。我々が使用するマウス系統は、ハーランラボラトリーズ（オックスフォード、英国）から得られた無毛のMF1 NU / NU株である。 16〜22グラムと年齢の6-8週の重量を量るメスMF1 nu / nuマウスは、この実験に含まれていました。このようなC57およびBALB / cのような他の株は、適当な腫瘍細胞株で使用できます。 <ol><li>麻酔は1.5 mgのケタミンと300 UGのキシラジンの100ulの腹腔内注射によって送達された。 </li><li>麻酔の深さはつま先のピンチを利用して評価されます。つま先のピンチでは撤退の反射はないはずです。 </li><li>麻酔マウスが正しく配置し、加熱パッドを介してテープで固定されています。 </li><li>腹部は10％betadine液で整形処理されています。 </li><li>腹部と手術部位を無菌的に覆われている。 </li></ol> III。腹部切開<ol><li>小さな肋骨下の切開は、皮膚で作られています。 </li><li>切開は2〜3 cmに拡張されます。 </li><li>腹壁の筋肉組織が分けられ、腹腔が入力されました。 </li></ol> IV。曝露と脾臓の課<ol><li>脾臓を動員し、優しくプレカット滅菌ガーゼで体外される。 </li><li>二つの4から0 vicryl合字は、脾臓の半ばに体の周りに関連付けられています。 </li><li>脾臓は、2つの半脾臓を作成する2つの合字の間に分かれています。 </li></ol> V.ヘミ-脾臓への細胞の注入<ol><li> 27 Gは、1つの半球脾臓に細胞を100μLの量を注入するために使用されます。 </li><li>腫瘍細胞は注入された細胞の大部分が肝臓に到達するのに十分な時間を提供する10分のために肝臓への排出を許可されます。 </li></ol> VI。ヘミ - 脾臓、腹部閉鎖およびリカバリの切除<ol><li>注入された半脾臓を摘出されています。 </li><li>他の半脾臓は腹腔内に返されます。 </li><li>筋層は、単純なランニングステッチを使用して4から0までのPDS縫合糸で閉じられます。 </li><li>腹部の皮膚が中断ステッチを使用して4から0 Proleneで閉じられます。 </li><li>流体のボーラスが投与され、手術後の鎮痛、Carpofen（5 mg / kg）を24時間の手術後のためにIP注射によって投与される。 </li><li>マウスは、麻酔から回復するために許可されています</li></ol> VII。 IVIS全身生物発光イメージング<ol><li>マウスは注射麻酔薬を使用して麻酔です。 </li><li>ルシフェリン基質は、10分イメージを作成する前に腹腔内注射で与えられる。 </li><li>マウスがステージ上に配置され、IVIS全身イメージングシステムを用いて3分間撮像する</li><li>肝臓からの発光は、関心のツールの領域を使用して測定することができます。 </li></ol> VIII。マウスの肝臓の暴露<ol><li>マウスは注射麻酔薬を使用して麻酔です。 </li><li>屋上腹部切開は、 生体内のびまん性肝転移の可視化が可能になります。 </li><li>マウスを頚椎脱臼により安楽死され、肝臓は、さらなる分析のために摘出されることがあります。 </li></ol>_upload/1977/1977fig1.jpg"altが="図1"/&gt; 図1：新鮮なマウス未処理および腫瘍浸潤肝臓を摘出。 <img src="/files/ftp_upload/1977/1977fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。IVIS全身イメージングによって証明されるように肝腫瘍の成長の速度論。

<ol><li>Kasuya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+subcutaneous+spleen+reservoir+for+multiple+portal+venous+injections+to+treat+liver+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Mouse models of subcutaneous spleen reservoir for multiple portal venous injections to treat liver malignancies.</a> Cancer Res. 65, 3823-3827 (2005).</li>
<li>Liu, Q. Z., Tuo, C. W., Wang, B., Wu, B. Q., Zhang, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+metastasis+models+of+human+colorectal+carcinoma+established+in+nude+mice+by+orthotopic+transplantation+and+their+biologic+characteristic%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Liver metastasis models of human colorectal carcinoma established in nude mice by orthotopic transplantation and their biologic characteristic.</a> World J Gastroenterol. 4, 409-411 (1998).</li>
<li>Li, Z. Y., Ni, S., Yang, X., Kiviat, N., Lieber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenograft+models+for+liver+metastasis%3A+Relationship+between+tumor+morphology+and+adenovirus+vector+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Xenograft models for liver metastasis: Relationship between tumor morphology and adenovirus vector transduction.</a> Mol Ther. 9, 650-657 (2004).</li>
<li>Cashman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+gene+therapy+as+a+neoadjuvant+to+surgical+excision+to+control+metastatic+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Immune gene therapy as a neoadjuvant to surgical excision to control metastatic cancers.</a> Cancer Lett. , (2008).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

肝転移の研究のためのin vivoモデル信頼性の発展は新たな治療戦略の出現により、重要な増加になってきています。新たな戦略の正確な研究のために、動物モデルでは、実行することは比較的容易である転移のかなりの数を形成して、転移カスケードのすべてのステップを含んでおり、転移性細胞の限られた数の検出及び計数を可能にするレポーターシステムを持つ必要があります。前述のように分割脾臓のアプローチは、単一の操作を伴いますし、癌腫症と門脈血栓症1の非常に低リスクで均一なびまん性肝転移を確立するために学ぶのは比較的簡単な手法です。 two半脾臓に脾臓の一部門一半脾臓に腫瘍細胞の注入を可能にする。腫瘍細胞は転移カスケードの最初のステップを模倣、肝臓の門脈循環や旅行を入力してください。注入された半脾臓の切除は、脾腫瘍の成長を回避し、他の半脾臓のリターンは、動物が前の手順に持っていた脾臓の免疫学的特性の保持を確実に..このモデルは、腫瘍の様々なタイプのに利用することができる。ルイス肺癌のルシフェラーゼの細胞株は、時間の経過とともに肝疾患の生物発光定量化することができます。生物発光システムの強化された感度は、転移性細胞の数が...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>V&amp;eacute;toquinol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>V&amp;eacute;toquinol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カロプロフェン</td><td>V&amp;eacute;toquinol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Videne</td><td>Ecolab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 4-0 縫合糸</td><td>Ethicon Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDS 4-0 縫合糸</td><td>Ethicon Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prolene 4-0 縫合糸</td><td>Ethicon Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Firefly ルシフェリン</td><td>Biosynth International, Inc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウス生物発光肝腫瘤モデル

Murine Bioluminescent Hepatic Tumour Model

このビデオはその後、生物発光イメージングによって解析することができるマウスモデルにおける肝転移の成立を説明します。腫瘍細胞は、脾臓の各半分の茎をそのまま血管を残して、二つに脾臓及び分割の動員を経由して、ローカライズされた肝腫瘍を誘発する肝臓に特異的に投与されています。構成的にホタルルシフェラーゼ遺伝子（luc1）を発現ルイス肺癌細胞は、その後10分後に切除されているものヘミ脾臓に接種されています。他の半脾臓はそのままにして腹部に返されます。肝臓の腫瘍の成長は、IVIS全身イメージングシステムを用いて生物発光イメージングによって監視することができます。 IVISを用いて腫瘍の成長の定量的なイメージングが可能な腫瘍細胞の正確な定量を提供します。薬物治療による腫瘍細胞死と壊死を​​早期に生物発光信号の減少によって示されます。このマウスモデルは、転移性腫瘍細胞の生存と成長のメカニズムを調査することができますし、肝転移の治療薬の評価に使用することができます。

この記事では、マウスで同所生物発光性肝腫瘍の誘発、およびライブ全身の発光イメージングを使用して肝臓に限局する腫瘍の成長のその後の分析のための手順を説明します。

このビデオでは、後で生物発光イメージングによる解析が可能な、マウスモデルにおける肝転移の作製について説明します。腫瘍細胞は…

皆さん、こんにちは。私はサイモン・レゲンロンです。アイルランドの癌研究センターで外科レジストラを務めています。本日は、肝転移を誘発する外科的手法について説明します。腫瘍モデルにおいて、肝臓は転移が起こりやすい部位であり、癌に関連する死亡の主要な原因となっています。進行した肝疾患を持つ患者の中で、外科的切除に適している方はごくわずかです。したがって、この疾患の治療には新しい治療薬が必要です。肝転移の動物モデルの多くは、臨床状況に類似した疾患を再現できていません。本日ご紹介するモデルは臨床的に意義のあるモデルであり、習得が比較的容易で、非常に高い成功率が得られます。このモデルでは、脾臓を2つの半脾臓に分割します。一方の半脾臓に腫瘍細胞を接種します。これらの腫瘍細胞は門脈循環を経由して肝臓へと移動します。もう一方の半脾臓は、免疫学的特性を維持するため、そのままの状態にしておきます。使用している細胞株はルシフェラーゼを安定的に発現しているため、生体内で腫瘍増殖のバイオルミネッセンス解析が可能です。したがって、このモデルを用いることで、肝疾患治療法の非侵襲的なモニタリングが可能となります。それでは、本日の手順を開始しましょう。必要な器具は、解剖用鋏、持針器、小型鉗子2本、10番メス、皮膚閉鎖用の5-0 Prolene縫合糸、腹膜層閉鎖用の4-0 PDS縫合糸、脾臓結紮用の3-0 Vicrylタイ、生理食塩水、麻酔薬注入用の29Gインスリン針、腫瘍細胞懸濁液注入用の26Gインスリン針、無血清培地中の腫瘍細胞懸濁液、注射用麻酔薬、皮膚マーカー、および滅菌済みガーゼ綿です。本日使用するマウスモデルは、Athymic MF1ヌードマウスです。適切な腫瘍細胞株を用いて、C 57やBCなどの他のモデルを使用することも可能です。実験室では、加熱パッドと注射による全身麻酔剤が使用されます。麻酔の深さは、足指へのピンチテスト（toe pinch）を用いて評価します。足指を挟んだ際に、足指の逃避反射が見られないことを確認します。マウス（Knee size）を適切に配置して固定し、腹部をベタジンで消毒後、滅菌的にドレーピングします。肋下切開を行い、腹腔内に進入し、脾臓を同定して体外に露出させます。あらかじめカットした滅菌ガーゼを用いて、マウスから脾臓を分離します。2本の血管茎の間に2本の垂直な結紮糸を通し、緩やかに結びます。脾臓を等分に2つの半脾臓に分割します。腫瘍細胞の接種には、片側の脾臓（hemi spleen）を使用します。漏出を防ぐため、腫瘍細胞を脾臓へゆっくりと注入します。腫瘍細胞は門脈循環を通じて移動し、肝臓に到達します。10分間のインキュベーション後、注入した側の脾臓半分を摘出し、もう一方の脾臓半分を腹腔内に戻します。腹腔の閉鎖には吸収性縫合糸を用いて連続縫合を行い、皮膚の閉鎖には非吸収性の5-0プロリン縫合糸を使用します。回復はルーチンに従って行います。2D ivusイメージングを用いることで、肝疾患の発症を経時的に評価できます。マウスを前述と同様に麻酔し、ルシフェリン基質を腹腔内に投与します。その後、マウスを37°Cのチャンバー内にあるステージ上に配置します。イメージングを3分間行い、発光が検出されたマウスの重ね合わせ画像を生成します。治療の3週間後、腹部を開いて広範な肝疾患が認められます。結論として、本手法により肝臓に局在した転移性腫瘍細胞の増殖を誘導することができ、さらに発光イメージングによって腫瘍増殖の可視化と定量化、および治療反応の評価への適用が可能となります。

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