Name: 哺乳動物細胞におけるRNAiスクリーニングのためのミッションesiRNA (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-12T17:45:00.000+00:00
Duration: 15 min 31 s
Description: 学ぶ哺乳動物細胞におけるesiRNAスクリーニング法で細胞周期関連遺伝子を同定する方法。高スループットトランスフェクションと統計解析により、RNAiを用いたロスオブファンクションスクリーニングの最適化手法を解説する。

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我々は議論のためブッフホルツ研究所とシグマアルドリッチのRNAi -チームのメンバーに感謝したい。私たちは、マックスプランク協会とBundesministeriumこだわりBildungウントForschungグランプリ[0315105]サポート情報 - バイオに感謝します。 MISSION ®はSigma - AldrichはバイオテクノロジーLPの登録商標です。

1。高品質のミッションesiRNAライブラリ<ol><li>興味のあるすべての遺伝子のためにRNAiの影響を最も受けやすいと特定のターゲット領域はDEQORアルゴリズム（http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html）を利用して選択されます。すべての4 DEQORスコアサイレンシングの可能性ターゲットmRNAの可能性が21ヌクレオチドの長siRNAは、最先端の設計の制約より4。さらに、それぞれの潜在的なsiRNAは、研究の生物のトランスクリプトームに対するBLAST検索を実行することによって、他の遺伝子との交差反応性可能性について分析する。プログラムは、それによって全体的な品質と潜在的なesiRNA（300〜600 bpの長さ）のクロスサイレンシング能力の分析を提供します。 </li><li> cDNAをターゲット遺伝子の選択した領域は、バクテリオファージRNA -ポリメラーゼプロモーター配列に隣接する遺伝子特異的プライマーを用いたPCRによって増幅される。 </li><li>ミッションesiRNAの生産に使用されるすべてのPCR産物は、キャリパーLabchip解析により配列決定によって同一性および純度のための検証されます。 </li><li>長い二本鎖RNAが転写された鎖のアニーリングに続く、RNAポリメラーゼによってPCR産物から転写される。 </li><li> esiRNAsは、Q -セファロースのスピンカラムを利用した陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製してRNaseIIIを使用して、長い二本鎖RNAの制限酵素消化によって調製される。 </li><li> esiRNAsが析出し、TE緩衝液に再懸濁する。収率は、UV -吸収測定によって測定され、濃度は、TEバッファーの適切な量に溶解して調整されます。最終製品の全体的な品質は、キャリパーLabchip分析により確認された。 </li></ol> 2。細胞株を選択し、スクリーニングのためにトランスフェクションを最適化<ol><li> esiRNA（ポジティブおよびネガティブコントロールとして、ウミシイタケルシフェラーゼとして使用Eg5）と384ウェルプレートでトランスフェクション試薬の量を増加させるの滴の量は、48時間細胞をインキュベートを追加。 Eg5は双極紡錘​​体集合と枯渇のために必要なキネシンのモータータンパク質が有糸分裂停止につながるです。異なるトランスフェクション試薬と細胞株について、この手順を繰り返します。ここで、我々は、トランスフェクション試薬として標準的な手順とオリゴフェクトアミン（Invitrogen社）に続く培養したHeLa細胞を使用してください。 </li><li>最適なトランスフェクション条件を選択するための有糸分裂停止（丸形）と光学顕微鏡によるウミシイタケルシフェラーゼ（RLUC）esiRNAをトランスフェクションした細胞の総数を表示Eg5 esiRNAsでトランスフェクトされた細胞を数える。 RLUCには、少なくとも毒性とEg5のための最も顕著な表現型との条件を選択してください。 トランスフェクション条件を最適化するための代替方法は、恒常的活性プロモーターの制御下にEG​​FPを（または他の適当なレポーター遺伝子）を発現する安定細胞株を含む。 EGFP（または別のレポーター遺伝子）とRLUC（または別の適切な陰性対照esiRNA）などの蛍光アシストセルソーティング（FACS）により測定ノックダウン効果と毒性に対するesiRNAのトランスフェクション後。 EGFPのために使用esiRNAは、ターゲットmRNAに完全に相補的であることを確認してください。 </li></ol> 3。プライマリ画面5,6の設定<ol><li>自動化されたピペッティングステーション（例えばアクエリアス、テカンとWellMate、マトリックス）上のすべての使用されるコンポーネントのためのピペッティングの精度を最適化する。ピペッティングのパラメータは、ソリューション、ボリュームとプレート型のタイプに応じて変化するため、この最適化は個別にすべてのステップのために反復する必要があります。可能であれば、ピペッティングステーションは、汚染を避けるために、層流フードの下に配置する必要があります。すべての使用されるコンポーネントは、該当する場合はオートクレーブして、75％エタノールを噴霧してどちらかの使用前に消毒されるべきである。ウェルからのクロスコンタミネーションがうまく除外されるように洗って、プロトコルを最適化する。自動化されたピペッティングの最適化の詳細は、スペースの制約を与えるためのものと利用ピペッティングステーションに大きく依存することはできません。詳細については、プロトコルを製造するために参照してください。 </li><li> Eg5とRLUC用esiRNAsで上から最適化された条件を用いて384ウェルフォーマットでのトランスフェクション細胞。プレート全体をカバーするEg5とRLUC esiRNAのための交互のパターンを使用してください。 </li><li> 48時間のインキュベーションが冷たい100％エタノールで細胞を固定した後、1μg/ mlのDAPIおよび100μg/ mlのRNase Aを（Qiagen）を含むPBSで25分間染色、15分間PBSで再水和する。最後に4℃でPBSと店舗で洗浄℃に</li><li>オリンパスScanRシステム上で顕微鏡などによるDAPI蛍光の測定強度。細胞数に対してDAPI強度をプロットすることにより、ヒストグラムを生成し、G1期のためにDNA -コンテンツの2Nと細胞の割合を計算することによって、細胞周期の分布を評価する。&lt;2N&gt; S相の4N、G2/M-phase用4Nと異数性/倍数性のための&gt; 4N。 </li><li>プレート上の結果の均質性を評価する。結果は、位置のEFFEを除外するために大幅に異なる場合は、さらに最適化が必要ですCTS。マルチウェルプレートを使用して一般的な問題は、インキュベーション時間の間にエッジの井戸で強化された蒸発です。これは多くの場合、板の位置特異的な効果に変換する別の井戸の異なる実験条件、につながる。このような理由から、我々は、画面の空のすべてのエッジの井戸を残すことをお勧めします。さらに蒸発を最小限に抑えるためには、インキュベーターが高湿度に保たれていることを確認します。我々はまた、日常的にこのような蒸発をブロックコーニング通気性のシールテープなどの蒸発障壁を採用しています。また、位置効果のための他のリソースは考慮、例えば、技術的な読み出しシステムの変化（顕微鏡、プレートリーダー、など）や液体ハンドリング（勾配、ソリューションの不均一性、等）のばらつき考慮する必要があります。 </li><li>陽性および陰性対照との間に統計学的な違いは、雇用検定の重要性の尺度を提供しています。ネガティブコントロール（またはバックグラウンドノイズ、モックコントロール）の間に大きな違いは、サンプルでは、​​実際のスクリーニングを開始する前に確立する必要があります。統計的有意性のための良好な尺度は、Z -因子である。 Z -係数は次式以下の式で計算されます。 Z = 1 - （3 SD [サンプル] + 3 SD [モック]）*（| AV [サンプル] - AV [モック] |）-1; SD付：標準偏差、AV：平均。 1のZ因子&gt; Z&gt; 0.5は、ポジティブコントロール7から陰性コントロールの統計的に有意な分離（およびノイズ）を示します。 </li></ol> 4。主な画面<ol><li>上記の最適化条件を利用esiRNAsのトランスフェクションのために384ウェル組織培養プレートを準備します。ここでは、ウェルあたり5μlのTE緩衝液に溶解15ng esiRNAを使用してください。プレート当たり少なくとも8つの制御位置は、研究対象の生物学的プロセスに適したポジティブコントロールとネガティブコントロール（：Eg5とRLUCここ）でロードする必要があります。エッジの井戸のみ5μlのTE bufferでロードされる位置の影響を避けるために。 </li><li>ウェルあたり0.2μlオリゴフェクトアミンを含む5μlのOPTIMEMを（Invitrogen）を追加し、混合し、室温で20分間インキュベートする。 </li><li>トランスフェクション混合物の上に細胞懸濁液（ここで25細胞/μlの濃度でHeLa細胞の細胞懸濁液の40μlの、ウェル当たり1000個の細胞に相当）を追加し、72時間インキュベートします。 </li><li>自動顕微鏡（オリンパスScanR、上記参照）でDNA含量を測定する。ヒットの選択のためのZ -スコアの統計情報を使用して評価する：Z -スコアは、基準として負の制御用信号を使用して、すべてのサンプルesiRNAsに対して計算されます。 （注）、Z -スコアは、Z -ファクターと同じではありません。 Z -スコアは、（モック）対照と比較して、サンプル値の有意性のための統計的尺度を提供しています。それは、方程式は、次の式で計算されます。 Z =（値[サンプル] -平均[モック]）*標準偏差[モック] -1。 ヒットの選択のしきい値は適用する必要があります。通常は、重要性の基準が好き：2 &lt;Z &lt;-2を使用するが、データセットの品質に応じて、生物学的プロセスまたは単に画面の範囲を検討され、別のしきい値が必要となる場合があります。かなり簡単なZ -スコアの統計情報の横にも、より精巧な数学的評価手法は、（スクリーニングデータの統計的評価の幅広い分野への最初の内部にはマロらで見つけることができます。8）使用することができます。 </li></ol> 5。二次スクリーンとヒットの検証<ol><li>二次の画面では、実験誤差やオフターゲット効果による偽陽性を排除するために、主画面に従います。選択されたヒットの場合、主画面で使用したのと同じ手順では、より良い統計的評価を可能にするために複製の大きい番号（3-5）を繰り返す必要があります。 </li><li>検証されたヒットの場合、初期画面で識別された目標に対する二次の非オーバーラップesiRNAは（または他の非オーバーラップサイレンのトリガ）を使用する必要があります。同じアッセイおよび読み出しは、一次スクリーニング用として適用する必要があります。 </li><li>最終的に選択された遺伝子は、異種間のRNAiレスキュー9によって検証することができます。それによって遺伝子のマウスのオルソログなど細菌人工染色体（BAC）のエンコーディングを安定的に細胞にトランスフェクトされる。 BAC -コンストラクトは、そのゲノムの文脈で遺伝子を保持し、ほぼ生理的な発現を可能にする。内因性のヒト遺伝子に対するRNAiは、RNAi表現型を救出変更されず、マウスの導入遺伝子の発現を残す。 RNAiによる救助は、これまでに利用可能なRNAiの表現型の検証のためのゴールドスタンダードを提供します。 </li><li>最後に、検証済みの候補者は最終的には機構的理解を得るために、より詳細に研究されています。多くの場合、RNAiは二次、より精巧なアッセイでは、例えば、これらの実験で使用することができます。 </li></ol>

<ol><li>Ghildiyal, M., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+silencing+RNAs%3A+an+expanding+universe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Small silencing RNAs: an expanding universe.</a> Nat Rev Genet. 10, 94-108 (2009).</li>
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<li>Echeverri, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+the+risk+of+reporting+false+positives+in+large-scale+RNAi+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Minimizing the risk of reporting false positives in large-scale RNAi screens.</a> Nat Methods. 3, 777-779 (2006).</li>
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</ol>

著者は、提出された仕事に関心を持っている可能性が商業的実体との財政関係を宣言する。

RNA干渉は、機能喪失型の表現型を研究するために標準的な技術となっている。 RNAiは、メディエーターの大規模なコレクションは、別の業者から入手可能であり、遺伝子サイレンシングのための簡単​​で、費用対効果が高く迅速な方法を提供しています。これは、異なる種や細胞タイプの広い範囲でのゲノム規模の視点を可能にする多くの生物学的プロセスにおけるキープレーヤーのための体系的なスクリーニングのためのゲートを開けた。 高い偽陽性と偽陰性率は、RNAiスクリーニングにおける共通の課題です。この問題を解決するために、かなりの努力が効果を向上させるために投資し、特にサイレンシングの特異性は、トリガされています。重要な発見は、同じ転写産物をターゲットに異なるsiRNAのプールは非常に標的特異性を高めることだった。異なるsiRNAの非常に複雑なプールがエンドリボヌクレアーゼによって生成されているため、esiRNAsはRNAiスクリーニングの偽陽性率を減少させる、高い標的特異性のトリガーです。 esiRNAsはまたも偽陰性率を低減する、効率的なノックダウンを達成するために示されている。 RNAiスクリーニングの技術的な要求されているため、彼らはおそらくしばらくの間、定期的に実行するために挑戦的なままになります。試薬と器具をより良く、より多くの研究室が自分の専門知識を共有し得るようにしかし、現代生物学におけるRNAiスクリーニングの使用は今後も増加するものとみなされます。

<table><tbody><tr><td>MISSION esiRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>詳細については、rnai@sial.comまでお問い合わせください</td></tr><tr><td>Wellmate</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>通気性シーリングテープ</td><td>Corning</td><td>Breathable Sealing Tape, Sterile (製品番号 #3345)</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=E7023%7CSIAL&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">エタノール&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof (絶対)、分子生物学用</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=P5493%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12347">リン酸緩衝生理食塩水&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td>BioReagent, 10x 濃縮, 細胞培養に適した, 分子生物学用</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=D8417%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12348">4&amp;#8242;,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール ジヒドロクロライド&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td>粉末, BioReagent, 細胞培養に適した, &amp;gt;98% (HPLC および TLC)</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=R6513%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12349">ウシ膵臓由来リボヌクレアーゼ A&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>分子生物学用, &amp;#8805;70 Kunitz units/mg protein, 凍結乾燥粉末</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=T9285%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12350">Tris-EDTA 緩衝液&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>100 x, 分子生物学用</td></tr></tbody></table>

哺乳動物細胞におけるrnaiスクリーニングのためのミッションesirna

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA干渉（RNAi）は遺伝子発現の制御のための基本的な細胞メカニズムです。 RNAiはまた、低分子干渉RNA（siRNA）として知られている短い二本鎖RNAによって誘導される。短い二本鎖RNAはDicerによって、エンドヌクレアーゼのRNase IIIファミリーのタンパク質の活性によって長い二本鎖の前駆体に由来する。得られた断片は、同種の標的mRNAにそれを指示、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）のコンポーネントです。 RISCは、それによってコードされるタンパク質1,2,3の発現を減少させる標的mRNAを切断する。 RNAiは、低分子干渉RNAを利用した哺乳動物細胞における遺伝子機能の研究の損失のための強力で広く使用されている実験的な方法となっている。 現在、2つの主な方法は低分子干渉RNAの生産のための利用可能です。別の方法は in vitro でのRNase IIIによってターゲット固有の長い二本鎖RNAのエンドヌクレアーゼ的切断を採用したのに対し、一つの方法は、化学合成を含む。これにより、siRNA様オリゴヌクレオチドの多様なプールは、エンドリボヌクレアーゼに準備したsiRNAまたはesiRNAとして知られて生成されます。化学的に誘導されたsiRNAとesiRNAsの有効性の比較は、両方のトリガーは、標的遺伝子のサイレンシングに強力であることを示しています。特異性を比較するときの違いは、しかし、見ることができます。 esiRNAsに内 ​​在する複雑な混合物はより具体的なノックダウン10につながる一方、多くの単一の化学的に合成されたsiRNAは、著名なオフターゲット効果を生み出す。 本研究では、我々は、ゲノム規模のミッションesiRNAライブラリと細胞周期の進行に関与する遺伝子の同定のためのDNA -コンテンツの画面に代表されるRNAiスクリーニングのためのその活用のデザインを提示。我々は、トランスフェクションプロトコルと高スループットのスクリーニングのためのアッセイを最適化する方法を示します。我々はまた、統計的に評価できる方法大規模なデータセットを示し、主要なヒットを検証する方法を提示する。最後に、我々は検証のヒット、さらに機能的特性評価のための潜在的な出発点を与える。

ここでは、細胞分裂に関与する遺伝子のハイスループットスクリーニングに人間esiRNAライブラリを使用してください。我々は、セットアップとesiRNA画面だけでなく、どのように結果を分析し、検証するために実施する方法を示します。

哺乳動物細胞におけるRNAiスクリーニングのためのミッションesiRNA

RNA干渉（RNAi）は、遺伝子発現を制御するための基本的な細胞メカニズムである。RNAiは、...としても知られる短い二本鎖RNAによって誘導される。

RNAiによる細胞周期関連遺伝子のスクリーニングは、適切なノックダウン技術の選択から始まります。Sigma Aldridge社のsiRNAライブラリは、エンドリボヌクレアーゼによって調製されたsiRNAの高い効率性と特異性を利用しています。siRNAプールは、標的mRNAに相補的な長い二本鎖RNAを酵素消化して調製された、個々のsiRNAの複雑な混合物です。同一の転写物を標的とするsiRNAをプールすることで特異性が向上し、効率的かつ特異的な個々のsiRNAを探索する手間を省くことができます。これにより、easy RNAは大規模および中規模の機能喪失スクリーンに特に適したものとなります。ここでは、ハイスループット transfectionのセットアップから適切なアッセイの開発に至るまで、大規模なRNAアイ・スクリーニングの実施に必要な手順を示します。具体例として、哺乳類細胞の細胞周期進行に関与する遺伝子のスクリーニングの構築について解説します。まず、最適化された門脈細胞のトランスフェクション方法を示し、続いてアッセイ品質の統計的評価を行います。最後に、標的遺伝子のノックダウン後の細胞周期分布を測定するゲノムスケールのスクリーニングを実施します。ヒット候補はzco統計量を用いて選出され、独立した二次的なeasy RNAを用いて検証されます。さらに、RNA眼スクリーン後のフォローアップに使用できる潜在的な実験手順について概説します。こんにちは、マックス・プランク分子細胞生物学・遺伝学研究所のTyです。そしてTristanです。私はドレスデンのマックス・プランク研究所のFrank Alです。本日は、Sigma Aldridge社のMission Easy RNAを用いて、哺乳類細胞における機能喪失スクリーニングを構築する手順をご紹介します。RNAiスクリーニングを用いて、遺伝子がどのように生物学的プロセスに関連付けられるかを示す例として、組織培養細胞集団における細胞周期分布を測定するアッセイを使用します。それでは、始めていきましょう。すべてのRNAiスクリーニングプロジェクトは、サイレンシングトリガーの選択から始まります。ここで使用されるエンドリボヌクレアーゼ調製siRNA（略称：esiRNA）は、RNase 3を用いて長い二本鎖RNAを限定的に酵素消化することで生成されます。すべてのesiRNAは、シーケンシングによって同一性が、またCaliper LabChip分析によって純度が検証されています。同じ転写物を標的とする個々のsiRNAをプーリングすると、プールのすべてのsiRNAが同一のオンターゲットを共有する一方で、オフターゲット効果は希釈されるため、特異性が向上します。したがって、easy RNAは優れたサイレンシング効率と高い標的特異性を持ち、オフターゲット効果を回避できます。ゲノムスケールのeasy。RNAライブラリーはSigma Aldrich社より提供されています。384ウェルプレートの外周ウェルは空の状態です。さらに、コントロール用にプレート中央の8箇所も空けてあります。easy RNAのサブライブラリーは、すべてのウェルが充填された96ウェルプレートで提供されます。プレート内でのeasy RNAの配置については、お客様で決定いただけます。個別のeasy RNAはシングルチューブで提供されます。easy RNAのトランスフェクションには、使用するトランスフェクション試薬や細胞株に応じた最適化が必要です。標準的な手順に従って培養した細胞を使用し、トランスフェクション試薬としてoligoを用います。バイポーラ紡錘体の形成に必要なキネシンモータータンパク質であるEEG five E-Z-R-N-A-Aをポジティブコントロールとして、ran luciferase easy RNAをネガティブコントロールとして使用します。384ウェルプレートを用いて、easy RNAの量を例えば1 ngから56 ngまで5 ng刻みで滴定し、同時にトランスフェクション試薬の量を0.1 µLから0.9 µLまで0.05 µL刻みで増加させて検討します。RNAとトランスフェクション試薬を混合した後、細胞を加え、48時間インキュベートします。インキュベーション期間が終了したら、光学顕微鏡で細胞を確認してください。eegがトランスフェクションされた細胞数を計測します。有糸分裂を示す円形を呈する5つの容易なRNA。また、ネガティブコントロールをトランスフェクションした細胞の総数も計数します。グラン・バニラ・ルシフェラーゼ容易RNA。最適化されたトランスフェクション条件では、vanilla luciferaseに対する毒性が最小限に抑えられ、EEG fiveにおいて最も顕著な表現型が示されます。トランスフェクションパラメータの最適化が完了したため、セットアップおよび一次スクリーニングに進みます。一次スクリーニングの準備に使用するMatrix WellmateやTecan Aquariusなどの自動分注機は、コンタミネーションを避けるため、層流クリーンベンチ内に設置してください。使用するすべてのコンポーネントは、使用前にオートクレーブ処理（可能な場合）または75% ethanolの噴霧による消毒を行う必要があります。これらの器具は、メーカーのプロトコルに従って最適化してください。溶液の量やプレートの種類によってピペッティングのパラメータが変動するため、自動ピペッティングステーションで使用するすべてのコンポーネントについて、ピペッティング精度の最適化を行ってください。この最適化を、各ステップごとに個別に繰り返す必要があります。さらに、自動ピペッティングステーションの使用準備が整った段階で、ウェル間のクロスコンタミネーションが排除されるよう、洗浄プロトコルを最適化してください。位置による影響（ポジションエフェクト）が見られないことを確認するため、あらかじめ決定した最適条件を用いて、384ウェル形式で細胞にトランスフェクションを行います。EEG 5用のeasy RNAsとバニラルシフェラーゼを使用し、プレート全体をカバーするように交互のパターンで配置します。マルチウェルプレートを使用する際の一般的な問題として、インキュベーション中に外周のウェルで蒸発が促進されることがあるため、すべての外周ウェルは空けておいてください。これにより、ウェルごとに実験条件が異なり、プレートの位置効果として現れることがよくあります。蒸発をさらに最小限に抑えるために、Corning社の通気性シーリングテープなどの蒸発防止バリアを使用してください。また、インキュベーター内が高湿度に保たれていることを確認してください。ただし、分注操作のばらつきや、プレートリーダーなどの読み取りシステムによるポジションエフェクトが発生する可能性があることに留意してください。48時間インキュベートした後、氷冷した100% ethanolで細胞を2時間固定し、次いでPBSで15分間再水和させます。DPI 1 µg/mLおよびRNAs 100 µg/mLを含むPBSを用いて、固定した細胞を25分間染色します。最後にPBSで3回洗浄し、4 °Cで保存します。次に、顕微鏡を用いてDPI蛍光強度を測定します。ここでは、それぞれにOlympusスキャナーシステムを使用します。細胞を観察し、DPI強度の相対値を決定します。ヒストグラムに基づき、DPI強度を細胞数に対してプロットしてヒストグラムを作成します。DNA含有量が2Nの細胞をG1/G0期、2Nから4Nの間をS期、4NをG2/M期、4Nより大きいものを異数体または多倍体として、それぞれの細胞の割合を算出することで細胞周期分布を評価します。プレート全体における結果の均一性を評価するため、EEG5およびルシフェラーゼのトランスフェクションにおけるG2/M期の細胞の割合を比較し、異なるウェル間での細胞周期分布を比較します。プレート内で結果に有意な差がある場合は、位置効果を排除するためにさらなる最適化が必要です。結果の整合性に納得できたら、陽性対照と陰性対照の間の統計的差異を算出します。ここに示すZファクターの式を用いて、結果の統計的有意性を判定します。SDは標準偏差を、AVは平均値を表します。Zファクターが0.5から1の間であれば、陰性対照およびノイズが陽性対照から統計的に有意に分離していることを示します。このような統計的な差が確認された場合は、一次スクリーニングに進むことができます。あらかじめ最適化された条件を用いて、siRNAをトランスフェクションするための384ウェル組織培養プレートを準備します。1ウェルあたり15 nanogramsのeasy RNAを5 µLのTE bufferに溶解させます。プレートあたり少なくとも8箇所のコントロールポジションに、生物学的プロセスに適した陽性および陰性コントロールをロードします。本研究では、EEG fiveおよびranil luciferaseを使用します。ポジションエフェクトを回避するために、Easy RNAsを使用します。外周のウェルには、5 µLのTEバッファーのみを分注します。次に、0.2 µLのオリゴを含む5 µLのOpti-MEMを各ウェルに加え、室温で20分間インキュベートします。RNAをトランスフェクション試薬と混合した後、ここに細胞懸濁液を加えます。1 µLあたり25細胞の濃度のHeR細胞懸濁液を40 µL添加し、1ウェルあたり1000細胞となるようにして72時間インキュベートします。72時間のインキュベーション後。既報の通り、Olympus scan Rなどの自動顕微鏡を用いてDNA含有量を測定します。ヒット選択のため、ライブラリーのすべてのプレートに対してこの手順を繰り返します。Zスコア統計を用いてDNA含有量の値を評価します。ZスコアはZ因子（Z-factor）のZスコアとは異なることに注意してください。これは、ネガティブコントロールまたはモックコントロールと比較した際のサンプル値の有意性を示す統計的尺度です。計算は、ここに示されている式に従って行われます。ヒット選択の基準として、ネガティブコントロールであるバニラルシフェラーゼのシグナルを用い、すべてのeasy RNAサンプルのzcoを算出します。ここでは閾値を設定する必要があります。通常は、Zが2より大きいか、あるいは-2より小さいことを有意性の基準とします。ただし、研究対象となる生物学的プロセスやスクリーニングの目的に応じて、異なる閾値を適用する場合もあります。ヒット選別には、Qなどのより精緻な数学的評価手法を用いることも可能です。次に、選出されたヒットを二次スクリーニングおよびHIIT検証にかけます。一次スクリーニングに続き、選出されたHIIT遺伝子の二次スクリーニングを行うことで、実験的ばらつきによる偽陽性を排除します。まず、一次スクリーニングと同様の手順で選択したヒットを検証します。ただし、統計的な評価精度を高めるため、ヒットの反復回数を3回から5回に増やして設定してください。検証済みのヒットについては、一次スクリーニングと同じアッセイおよびリードアウトを用いますが、重複しない別のsiRNA、または化学合成siRNAなどの別の非重複サイレンシングトリガーを使用します。最終的に、種を越えた検証により、選択した遺伝子の妥当性を確認します。RNAiレスキューは、現在利用可能なRNAi表現型の検証におけるゴールドスタンダードです。簡潔に述べると、選択した遺伝子の別種からのオーソログをコードする細菌人工染色体（BAC）を細胞に安定的にトランスフェクトします。BACコンストラクトは、ゲノム上のコンテクストを維持したまま遺伝子を保持するため、ほぼ生理的な発現を可能にします。内因性遺伝子に対するRNAiは、オルソログ転写因子の発現を変化させないため、RNAiによる表現型がレスキューされます。最終的に、検証された候補についてさらに詳細な検討を行い、最終的なメカニズムの解明へと導きます。多くの場合、これらのより精緻な二次アッセイにおいてもRNAiを利用することが可能です。例えば、RNAi表現型のタイムラプス顕微鏡観察などが挙げられます。ここでは、ヒトゲノムから16,000以上の遺伝子をノックダウンした後、HeLa細胞のDNA量を測定した細胞周期スクリーニングの例を示します。その結果、細胞分裂に必要であると特定された主要なヒットは1,351件でした。二次スクリーニングでは、二次アッセイを用いて、独立した二次的なeasy RNAトリガーにより743個のヒットが検証されました。G2期停止を引き起こしたノックダウンと、有糸分裂停止を引き起こしたノックダウンが区別されました。最終的に、Lin 54遺伝子の役割が適切な細胞分裂に寄与していることを検証するため、種をまたいだRNAiレスキュー実験が行われました。さらに下流の実験により、Lin 54の枯渇が多くの細胞周期遺伝子の発現を変化させることが示されました。ここでは、ヒト組織培養細胞株におけるMission Easy RNAの高スループット・トランスフェクションのセットアップ方法と、細胞周期分布の解析方法について解説しました。この手順を行う際は、トランスフェクション条件およびアッセイを、個々の細胞系および生物学的プロセスに合わせて個別に最適化する必要があることに留意することが重要です。自動液体分注システムの使用が推奨されますが、特に小規模なスクリーニングにおいては不可欠ではありません。手動での操作でも十分に対応可能です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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