オルガノイドエレクトロポレーション:プラスミドDNAを消化管オルガノイドにトランスフェクションする方法

- オルガノイドは、組織特異的幹細胞に由来する小さな三次元細胞培養物です。それらはゲノム的に安定していますが、トランスフェクションによって遺伝的に改変可能であり、したがって遺伝子研究に最適です。トランスフェクションでは、特定の培地を用いたマルチウェル培養プレートにオルガノイドを播種し、所望の期間インキュベートします。次に、オルガノイド細胞の解離を助けるために、解離混合物をプレートに加えます。混合物をチューブに移し、遠心分離機にかけます。オルガノイドペレットを、蛍光標識プラスミドDNAを含むエレクトロポレーションバッファーに再懸濁します。バッファーは細胞を安定させ、電気的ストレスによる細胞死を防ぎます。

混合物をキュベットに移し、細胞をエレクトロポレートします。細胞膜を横切る電気インパルスは、プラスミドDNAの細胞への取り込みを促進するための一時的な細孔形成をもたらします。エレクトロポレーション後、直ちに細胞懸濁液に培地を加え、混合物をチューブに移します。次に、細胞を遠心分離します。ペレットを地下マトリックスに再懸濁し、重合のためにマルチウェルプレートに移します。プレートを蛍光顕微鏡下に置き、細胞内の蛍光を確認すると、効率的なトランスフェクションが確認されます。次のプロトコルでは、消化管オルガノイドをトランスフェクションするためのエレクトロポレーションを行います。

- エレクトロポレーション後の播種のために摂氏37度で48ウェルプレートを予温することから始め、次に原稿の指示に従って基礎およびオルガノイド培養特異的培地を調製します。エレクトロポレーションサンプルごとに5ウェルのオルガノイドを48ウェルプレートで培養します。ウェルあたり10マイクロモルのY27632で230マイクロリットルの解離試薬を調製します。顕微鏡でオルガノイドをモニターします。ウェルから培地を取り出し、調製した解離混合物中でオルガノイドを機械的に解離します。エレクトロポレーションサンプルごとに5つのウェルを1つの15ミリリットルチューブにプールします。

チューブの内容物をボルテックスして混合し、10〜15個の細胞のクラスターが発生するまで摂氏37度で5〜15分間インキュベートし、顕微鏡で解離を確認します。抗生物質を含まない基礎培地を最大10ミリリットル追加して消化を止めます。チューブを450倍gで5分間遠心分離します。上清を捨て、4ミリリットルのエレクトロポレーションバッファーで細胞を2回洗浄します。洗浄のたびに上清を遠心分離して廃棄します。洗浄後、オルガノイドペレットを30マイクログラムのプラスミドDNAを含む100マイクロリットルのエレクトロポレーションバッファーに再懸濁します。

完全なDNA-オルガノイド混合物をエレクトロポレーションキュベットに分注します。気泡を避けてください。テキスト原稿に記載されているようにエレクトロポレーションパラメータを設定し、キュベットを指で軽くたたいて細胞を優しく混合します。キュベットをキュベットチャンバーに入れ、エレクトロポレーターのインピーダンスボタンを押してインピーダンス値をメモします。スタートボタンを押してエレクトロポレーションプログラムを開始し、表示される電流、電圧、およびエネルギーの値を制御します。

エレクトロポレーション後、直ちに抗生物質を含まない500マイクロリットルの培地を細胞に加え、ピペッティングで上下に混合します。サンプルを新しい15ミリリットルチューブに移し、キュベットを基礎培地ですすいで残りの細胞を採取し、細胞を室温で40分間インキュベートします。細胞を450倍gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。ペレットを100マイクロリットルの地下マトリックスに再懸濁し、予熱した48ウェルプレートに20マイクロリットルの滴を播種します。

プレートを摂氏37度で10分間インキュベートして重合し、Y27632およびCHIR-99021を添加した培地250マイクロリットルをウェルあたりに加えます。トランスフェクション効率を決定するには、24〜48時間後に顕微鏡下のトランスフェクションコントロールで蛍光を確認します。