膵臓細胞におけるカルシウム動態のイメージング:膵島における細胞質カルシウム濃度のリアルタイム変化を研究する技術

- 膵島は、グルコースの恒常性を維持する上で重要な役割を果たすホルモン産生膵臓細胞のクラスターです。グルコース濃度が上昇すると、カリウムイオンチャネルの閉鎖が引き起こされ、カリウムイオンの排出が妨げられ、膜の脱分極につながります。その結果、電位依存性のカルシウムイオンチャネルが開き、カルシウムイオンの流入が可能になります。この細胞質カルシウム濃度の増加は、インスリンなどのホルモンの放出を刺激します。リアルタイムで、細胞質カルシウム動態を画像化するために、適切なカルシウム指示色素を充填したいくつかの膵島を、事前に組み立てられた細かいメッシュのスペーサー壁の間に移します。

倒立顕微鏡のイメージングチャンバー内にセットされたカバースリップにメッシュを逆さまに配置します。粗いメッシュとウェイトを配置して、細胞を固定します。イメージング溶液をチャンバーに加えます。次に、目的のブドウ糖または試験ホルモンを導入するための灌流システムを設定します。細胞内では、プリロードされた蛍光カルシウムインジケーターが細胞質カルシウム濃度の増加を報告します。カルシウムイオンに結合すると、指示分子は蛍光発光の大幅な増加を示します。次のプロトコルでは、グルコース灌流に応答したマウスの膵島におけるカルシウム動態のリアルタイムイメージングを示します。

- イメージングのために島を固定するには、倒立顕微鏡用のイメージングチャンバーを組み立て、チャンバー内にガラスカバースリップを配置します。ガラスチャンバーのインターフェースが防水であることを確認し、カバーガラスが顕微鏡の対物レンズの手の届く範囲にあることを確認してください。次に、20 X 20ミリメートルの正方形の細かいメッシュと粗いメッシュをカットし、45〜50マイクロメートルの厚い粘着テープを使用して、細かいメッシュに2つのスペーサー壁を作成します。粗いメッシュと重りを35ミリメートルのイメージング溶液のシャーレに浸し、細かいメッシュを解剖顕微鏡の下に置きます。

スペーサーの壁を逆さまにし、スペーサーを上に向けて細かいメッシュを回し、P20ピペットを使用して2つのスペーサー間でいくつかの島を移します。時計職人の鉗子を使用して、倒立顕微鏡のイメージングチャンバー内にメッシュを逆さまに置き、スペーサーが下を向いてチャンバーカバースリップに直接座るようにし、スペーサーとカバースリップの中央にあるメッシュの間の島を閉じ込めます。

- メッシュが十分に水和されており、サンプルの横方向の動きを引き起こす可能性のある過剰な量の溶液が含まれていないことに注意してください。

- 次に、粗いメッシュと重りをチャンバー内の細かいメッシュの上に置き、チャンバーにイメージング溶液を追加します。膵島を固定したら、倒立顕微鏡でイメージングモードと対物レンズを選択し、膵島のあ