一次腺房細胞の単離:マウス膵臓から腺房細胞を単離する方法

- 膵臓腺房細胞は、さまざまな消化酵素を含む外分泌細胞です。時々、発癌性シグナル伝達に応答して、腺房細胞は管細胞に転換します。この乳管細胞は、後で癌性になる可能性があります。したがって、腺房細胞を分離して、膵臓がんの進行における腺房細胞の役割を研究することが重要です。

安楽死させたマウスから膵臓を分離することから始めます。抗生物質を補給したバランスの取れた塩溶液を含む計量ボートに膵臓を追加します。はさみを使って膵臓を細かく刻み、膵臓組織をチューブに加えます。次に、チューブ内の膵臓片にコラゲナーゼ溶液を加えます。

コラゲナーゼは、組織をつなぎとめるコラーゲンを消化し、組織が細かく砕けるようにします。次に、血清含有培地をチューブに加え、組織を氷の上に置きます。これにより、コラゲナーゼの作用を止めることができます。

組織と培地を2回ろ過し、そのたびにフィルターのメッシュサイズを徐々に小さくして、微細な組織懸濁液を得る。最後に、得られた懸濁液を遠心分離して、ペレット中の腺房細胞を回収します。上清を取り除き、さらなる分析のために腺房細胞を保存します。次のプロトコルでは、安楽死させたマウスの膵臓から腺房細胞を単離します。

- 安楽死させたマウスから膵臓を解剖するには、まずマウスの足をポリスチレン製の蓋に固定し、尾が研究者の方を向くように向きを変え、腹部に70%エタノールを噴霧します。オートクレーブ鉗子を使用して正中線で毛皮と皮膚を持ち上げ、オートクレーブ鋏で尿道口から横隔膜胸郭領域まで毛皮と皮膚を切開します。左右に追加の切開をして毛皮と皮膚を切り取り、腹腔がはっきりと見えるようにします。

次に、腹膜の内壁を中央と右と左に切り込み、臓器から引き離します。鉗子を使用して腸を持ち上げ、マウスの左側に移動すると、暗赤色の楕円形の脾臓に付着した淡いピンクの膵臓が見えるスペースができます。膵臓組織は柔らかく、海綿状の質感になります。胃に沿って走り、腸と絡み合っている膵臓を切り取ります。

脾臓を膵臓から分離し、10ミリリットルのHBSSと1Xペニシリン-ストレプトマイシンを含む50ミリリットルのチューブに膵臓を配置し、層流フードに移します。チューブの内容物を空の計量ボートに注ぎ、鉗子を使用して膵臓を渦巻いて洗浄します。次に、鉗子を使用して、膵臓をペニシリン-ストレプトマイシンを含むHBSSを含む2番目の計量ボートに移動し、渦巻き状に再度洗浄します。

膵臓をHBSSとペニシリン-ストレプトマイシンを含む3番目の計量ボートに移し、膵臓を5ミリメートル以下に切断し始めます。計量ボートの内容物を新しい50ミリリットルのチューブに注ぐには、まず鉗子を使用して、ボートが傾いているときに膵臓片を液体に移動します。ピースがボートに取り付けられなくなったら、その内容物をチューブに注ぎます。鉗子で残っている破片を拾い上げ、チューブ内の鉗子を洗います。

チューブを重力931倍、摂氏4度で2分間遠心分離した後、5ミリリットルのピペットを使用してHBSSと浮遊脂肪を除去します。HBSSで希釈したコラゲナーゼ5ミリリットルを加えます。チューブを閉じ、チューブをプラスチックパラフィンフィルムで包んで蓋を密閉します。インキュベーターに入れ、摂氏37度で220RPMで20分間振とうすると、濁った溶液とわずかに残った組織片が得られます。

解離を止めるには、チューブを氷の上に置き、5%FBSを含む5ミリリットルの冷たいHBSSを追加します。重力931倍、摂氏4度で2分間遠心分離した後、5ミリリットルのピペットで上清を除去します。ペレットを5%FBSを含む10ミリリットルのHBSSに再懸濁し、再び重力931倍で摂氏4度で2分間遠心分離します。

5ミリリットルのピペットを使用して上清を取り除き、5%FBSを含む別の10ミリリットルのHBSSでこの手順を繰り返します。次に、ペレットを5%FBSを含む5ミリリットルのHBSSに再懸濁します。P1000ピペットを使用して、細胞懸濁液を一度に1ミリリットルずつろ過し、500マイクロメートルのメッシュを介して50ミリリットルのチューブに入れます。

メッシュを通して残りの膵臓細胞を洗浄するには、5%FBSを含むHBSSの5ミリリットルを追加します。次に、P1000ピペットを使用して、この濾液を一度に1ミリリットルずつ105マイクロメートルのメッシュを通し、50ミリリットルのチューブに通します。この細胞懸濁液を、30%FBSを含むHBSSを含む50ミリリットルのチューブに静かにピペットで移し、上部に細胞懸濁液の層を形成します。

この細胞懸濁液を重力の233倍、摂氏4度で2分間遠心分離し、上清を除去します。腺房細胞を含むペレットを1X Waymouthの完全培地に再懸濁します。