コラゲナーゼ灌流による膵島単離:膵島細胞を単離するための酵素的方法

- 膵臓の膵島細胞は、内分泌機能に関与する必須ホルモンを産生します。膵島を隔離するには、まず、安楽死させたマウスを固定し、その腹腔を外科的に露出させます。肝臓と腸を脇に払い、総胆管を見つけて固定します。膵臓と総胆管の結合によって形成された管であるVaterの膨大部を特定します。

次に、コラゲナーゼ酵素溶液を総胆管に注入します。管からの逆流は膵臓をうまく膨らませ、膵臓組織のコラゲナーゼ誘発解離を促進します。膵臓をより多くのコラゲナーゼ溶液を含むチューブに切除します。組織を機械的に切り刻み、インキュベートしてコラゲナーゼによる組織消化を助けます。

均質な懸濁液が得られたら、コラゲナーゼ活性を阻害するタンパク質を含む溶液を添加して酵素消化を停止します。遠心分離機で組織ペレットを採取します。ペレットを適切な密度勾配培地に再懸濁し、その上に適切なバッファーを層状にし、遠心分離して勾配層を生成します。

密度勾配媒体とバッファーとの間に形成された層から膵島を収集します。最後に、養殖のために健康な島を選びます。次のプロトコルでは、コラゲナーゼ投与とそれに続く密度勾配遠心分離によるマウス膵島の単離を実証します。

- マウスの四肢を仰臥位にテープで固定し、体に70%エタノールをスプレーすることから始めます。カバーガラス鉗子と湾曲した手術用ハサミを使用して、腹部の皮膚を水平に約3センチ切開し、皮膚を引っ張って開いて腹壁を露出させます。腹部腹膜に3〜4センチメートルの垂直切開を行い、膵臓を完全に露出させ、マウスを解剖顕微鏡の下に置きます。

肝葉を上向きに押して、淡いピンク色の管のように見える胆管を露出させ、腸を右腰部と腸骨領域から腹腔の右側にゆっくりと移動して、胆管と肝動脈を露出させます。Schwartz Micro Serrefinesを使用して、総胆管をできるだけ肝臓の近くに慎重にクランプし、十二指腸乳頭に位置し、膵管と総胆管の結合によって形成されるVaterの膨大部を特定します。

マイクロアドソン鉗子を使用して総胆管をぴんと張った状態で引っ張り、新たに調製したコラゲナーゼP溶液の3ミリリットルを含む3ミリリットルの注射器に取り付けられた30ゲージ半インチの針をVaterの膨大部に挿入し、針を血管と平行な管に血管の約4分の1の長さで押し込みます。針が所定の位置に配置されたら、マイクロアドソン鉗子で針を安定させ、3ミリリットルのコラゲナーゼP溶液をゆっくりと着実にダクトに注入します。膵臓の頭、首、体、尾の領域が完全に膨らんでいる場合、注射は成功したと見なされます。

- 膨大部への適切な挿入と総胆管のカニューレ挿入は、消化収穫を成功させるために重要です。管壁に穴を開けると、アイソレーションの有効性が低下します。

- 湾曲したマイクロアドソン鉗子を使用して、膨らんだ膵臓を脾臓から始まり、胃に向かって十二指腸に沿って慎重に引き出します。次に、3ミリリットルの氷冷コラゲナーゼP溶液を含む50ミリリットルの消化チューブに膵臓を入れます。膵島を収穫するには、まず、細い手術用ハサミを使用して膵臓を3〜5秒間切り刻み、その後、チューブを摂氏37度の水浴に毎分100〜120回転で12〜13分間置きます。

インキュベーションの終了時に、チューブを約30秒間静かに振とうして、溶液が均一になるまで組織を破壊します(細かい砂のような膵臓組織粒子によって確認されます)。組織が消化されたらすぐに、チューブを氷の上に置き、40ミリリットルの氷冷停止溶液を加えて酵素反応を終了します。ペレットを穏やかに乱した後、スイングバケット遠心分離機で消化組織をスピンダウンし、その後、洗浄ごとに20ミリリットルの新鮮な停止溶液で2回の遠心分離を行います。

最後の洗浄後、ペレットを40ミリリットルの氷冷HBSSに再懸濁してさらに3回の洗浄を行い、最後の洗浄後にペレットを5ミリリットルの室温密度勾配溶液に再懸濁します。溶液が均質化されるまでチューブを低速で短時間ボルテックスしてから、さらに5ミリリットルの室温密度勾配をチューブに加えます。次に、10mmピペットを使用して、室温10mmのHBSSをチューブに滴下しながらゆっくりとゆっくりと加え、グラジエントの形成を可能にし、スイングバケット遠心分離機を使用して密度グラジエント分離によって細胞集団を単離します。

遠心分離の最後に、10ミリリットルのピペットを使用し、冷たいHBSSで事前に濡らして、密度勾配とHBSSの間の5〜10ミリリットルの膵島層を収集します。膵島を、20ミリリットルの新鮮で氷のように冷たいHBSSが入った新しい50ミリリットルのチューブに移し、スイングバケツ遠心分離機で遠心分離して細胞を回収します。ペレットを乱さずに、上清の最後の3ミリリットルを除くすべてを慎重に吸引し、洗浄ごとに20ミリリットルの新鮮なHBSSで少なくともさらに3回膵島を洗浄します。

最後の洗浄後、上清を摂氏4度のRPMI 1640培地の37ミリリットルと交換し、チューブを静かに回転させてペレットを取り除きます。すぐに膵島を100ミリメートルのペトリ皿に注ぎ、チューブを5ミリリットルの新鮮なRPMI 1640培地で洗浄して残りの膵島を収集し、他の膵島と洗浄液をプールします。

次に、解剖顕微鏡と20マイクロリットルのピペットチップを使用して、ペトリ皿から健康な球形または長方形の黄金色の小島を選び、10ミリリットルの完全なRPMI 1640培地を含む新しいペトリ皿に移します。すべての膵島が収集されたら、膵島を摂氏37度、加湿空気中の二酸化炭素5%の滅菌インキュベーターに一晩置きます。