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- スフェロイドは、3次元のin vitro細胞培養モデルです。免疫蛍光染色では、まず、必要な細胞タイプのスフェロイド培養物をマルチウェルプレートで作製します。先端がオリフィスの幅の広いマイクロピペットを使用して、せん断力による破裂を避けながら回転楕円体を回収します。
次に、スフェロイドを固定して透過処理し、個々の細胞を透過性にします。次に、タンパク質を含む溶液とインキュベートして、細胞表面上の非特異的なタンパク質相互作用部位をブロックします。スフェロイドを目的の一次抗体カクテルで処理します。抗体が細胞表面の標的分子に結合するまでインキュベートします。
次に、一次抗体に特異的な蛍光標識二次抗体溶液でスフェロイドを標識します。最後に、スフェロイドを適切な蛍光DNA結合色素で処理し、細胞核を染色します。レーザー走査型蛍光顕微鏡を使用して、スフェロイドの複数の光学断面を異なる光学面で画像化します。
撮影された画像は、蛍光標識された核と目的の抗原を反映しています。関連するソフトウェアを使用してスタックをマージし、3Dスフェロイドの最終的な合成画像を取得します。次のプロトコルでは、膵臓線維芽細胞のスフェロイドおよび刺激剤、TGFベータ1の存在下で培養された癌関連線維芽細胞の免疫蛍光染色を行います。
- まず、ピペットの先端を切り落とし、オリフィスを大きくします。インキュベーションが完了したら、このカットピペットチップを使用して、実験条件または分析するタンパク質ごとに、スフェロイドを1.5ミリリットルの反応チューブ1本に集めます。スフェロイドを1,000倍gで約30〜60秒間遠心分離します。メチルセルロースを含む上清をピペッティングで慎重に取り除き、ペレット化されたスフェロイドを乱さないように注意してください。
- スフェロイドを反応チューブに移す際には特に注意が必要です。先端を切ってせん断応力力がないことを確認してください。また、すべての回転楕円体を集めることも重要です。洗浄ステップでは、誤嚥によってスフェロイドを失わないように注意してください。
- スフェロイドを50マイクロリットルの1X PBSで洗浄するには、1,000 gで30〜60秒間遠心分離した後、ピペッティングでPBSを慎重に除去します。染色するタンパク質に応じて、スフェロイドを50マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドでPBSに室温で20分間固定します。
前述のように、スフェロイドをPBSで洗浄します。0.1% Triton XをPBS溶液で室温で4分間細胞に透過処理します。次に、前述のように、スフェロイドをPBSで3回洗浄します。5% FBSと2% BSAを含むPBSをスフェロイドに添加し、室温で1時間インキュベートして、非特異的なタンパク質相互作用部位をブロックします。
次に、スフェロイドを30マイクロリットルの一次抗体とPBS溶液(2.5%FBSおよび1%BSA)で摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、前述のようにPBSでスフェロイドを3回洗浄します。
この後、スフェロイドを30マイクロリットルの二次抗体とPBSで2.5%FBSおよび1%BSAの室温で90分間インキュベートします。前述のように、PBSでスフェロイドを3回洗浄します。
次に、細胞を30マイクロリットルのDAPI染色溶液と室温で4分間インキュベートします。前述のように、PBSでスフェロイドを1回洗浄します。ガラスパスツールピペットを使用して、PBSの滴でスライドガラス上にスフェロイドを置きます。レーザー走査型顕微鏡を使用して、蛍光顕微鏡でスフェロイドを10倍の倍率でイメージングします。Zスタックの異なる光学面におけるスフェロイドの異なる光学断面を取ります。
