磁気的にバイオプリントされた3Dスフェロイド共培養:癌細胞と線維芽細胞の共培養法

- 磁気バイオプリント3D共培養では、磁場の影響下で複数の細胞タイプが3D構造またはスフェロイドを形成します。培養をセットアップするには、まず、がん細胞と線維芽細胞の単一細胞懸濁液を適切な培地で調製します。次に、生体適合性磁性ナノ粒子を両方の懸濁液に加えます。これらのナノ材料には、正に帯電したポリL-リジン残基が含まれており、静電相互作用を介して磁性粒子の細胞膜への非特異的結合を促進します。

インキュベートして、がん細胞と線維芽細胞の磁化を最大化します。続いて、両方の細胞懸濁液を所望の比率で混合する。この細胞ナノ粒子懸濁液を、細胞付着を防ぐために特別に最適化された細胞忌避性培養プレートに移します。このセットアップを磁気ドライブにマウントし、インキュベートします。磁力は、磁化されたがん細胞と線維芽細胞の凝集またはバイオプリンティングをウェルの底にある3Dスフェロイド構造に導きます。

スフェロイドが形成されたら、磁石を取り外し、3D共培養物を目的の体積まで成長させます。このプロトコルでは、磁気バイオプリンティング技術を使用して、膵臓癌細胞とPS1活性化膵臓線維芽細胞からの三次元共培養スフェロイドの生成を実証します。

標準的な無菌組織培養技術を使用して、目的のがん細胞と線維芽細胞を適切な増殖培地でT75フラスコで培養します。細胞が70%から80%のコンフルエントに達したら、PBSの5ミリリットルで1回培養物を洗浄し、フラスコあたり0.05%トリプシンEDTAの2ミリリットルでフラスコ表面から細胞を37°Cで5分間剥離します。

顕微鏡で剥離を確認した後、フラスコあたり8ミリリットルの成長培地でトリプシンを非アクティブ化します。.そして、細胞を数回ピペットで動かして、カウント用の単一細胞懸濁液を生成します。遠心分離により細胞を回収し、新鮮な増殖培地中にペレットを1ミリリットルあたり10〜6番目の細胞濃度で再懸濁します。

細胞を磁化するには、細胞100マイクロリットルあたり10マイクロリットルのNanoShuttlを増殖培地に追加し、溶液を穏やかに攪拌します。チューブを数回静かに反転させ、cell-NanoShuttleミックスを24ウェルプレートの個々のウェルに移します。細胞を室温で2時間インキュベートし、穏やかに振とうして、NanoShuttleが細胞表面に結合するのを促進します。結合インキュベーションの終了時に、各磁化細胞懸濁液をピペッティングで穏やかに混合し、培地150マイクロリットル当たりの4番目の磁化がん細胞または線維芽細胞の1.5倍に濃度を調整する。

線維芽細胞とがん細胞を2対1の比率で混合し、ウェルあたり合計150マイクロリットルの播種細胞を調製します。細胞撥水剤の96ウェルプレートを、より薄い磁石を備えた96ウェル磁気スフェロイドドライブの上に置き、150マイクロリットルの細胞混合物を各ウェルに播種します。すべての細胞を播種したら、磁気スフェロイドドライブを取り付けたまま、プレートを摂氏37度、CO2濃度5%で一晩インキュベートします。翌朝、磁気ドライブを取り外し、細胞をインキュベーターにさらに最大7日間戻します。