PDAC幹細胞単離:膵臓腫瘍から癌幹細胞を単離する方法

- 膵臓がん幹細胞またはCSCは、自己再生可能ながん細胞のサブセットであり、腫瘍全体を生じさせる可能性があります。CSCは、線維芽細胞、免疫細胞、内皮細胞などの他の細胞と、サイトカインや成長因子などの細胞外マトリックス成分からなる、十分に保護されたニッチに存在します。このような環境で細胞間で起こる相互作用は、CSCの増殖と腫瘍増殖の増加を助けます。

CSCの特性を研究するために、膵臓腫瘍からCSCを分離します。まず、CSC増殖培地中のヒト膵臓腫瘍組織から細胞懸濁液を採取します。次に、主に線維芽細胞とCSCからなる懸濁液をゼラチンコーティングプレート上に播種し、所望の期間インキュベートします。線維芽細胞はゼラチン表面に付着し、細胞懸濁液中に浮遊するCSCを残します。

少量の細胞懸濁液を取り、トリパンブルーを加えます。この混合物を血球計算盤にピペットで移し、生細胞の数を数えます。トリパンブルーは死んだ細胞に入り、それらを青く染め、生きた細胞を無色のままにします。最後に、詳細な分析のために CSC を保存します。

次のプロトコルでは、膵臓腫瘍から CSC を分離します。

- 無菌バイオセーフティキャビネット内の膵管腺癌から癌幹細胞を単離するには、無菌メスと鉗子を使用して、1ミリリットルの滅菌PBSを含む60 x 15ミリメートルの培養皿でヒト腫瘍をミンチし、必要に応じてPBSのさらに3〜4ミリリットルを追加し、組織が完全に解離するまで。

組織懸濁液を滅菌円錐管に移し、PBSを最終容量5ミリリットルに加えます。次に、解離器でサンプルを機械的に均質化し、遠心分離機にかけ、均質化した組織をコラゲナーゼで摂氏37度で消化します。

1時間後、細胞を遠心分離し、ペレットを10ミリリットルの完全培地に再懸濁します。細胞懸濁液を40マイクロメートルのストレーナでろ過し、細胞を再びスピンダウンして、今度はペレットを5ミリリットルのACKに再懸濁します。

室温で5分後、遠心分離により赤血球溶解バッファーを除去し、ペレットをがん幹細胞培地に再懸濁します。次に、ゼラチンでコーティングされた皿の上で細胞を摂氏37度でインキュベートし、急速に付着する線維芽細胞の大部分を取り除きます。1時間後、上清を回収し、生存可能な膵臓がん細胞の数を定量化します。