0 閲覧数 • 4:24 分 • April 30th, 2023
- 後根神経節またはDRGは、末梢から中枢神経系にメッセージを中継する感覚ニューロンです。対照的に、筋神経叢ニューロンは腸の蠕動運動に関与しています。
膵臓がんなどのがん状態では、これらのニューロンは形態学的および機能的に変化します。ニューロンの形態変化を研究するには、ラミニンタンパク質で事前にコーティングされたカバースリップに神経細胞を播種し、マルチウェルプレートに配置し、神経基礎培地を細胞にトッピングします。
ラミニンタンパク質は神経突起の成長を促進します。細胞を一晩インキュベートします。次に、膵臓癌組織抽出培地を最初の3つのウェルに添加し、健康な膵臓組織抽出培地を後続の3つのウェルに加える。プレートをインキュベートします。次に、ニューロンに結合するニューロン特異的抗体マーカーを使用して免疫組織化学染色を行います。カバースリップをスライドガラスに置き、スライドを倒立顕微鏡の下に置きます。ソフトウェアを使用して神経突起密度を測定します。
膵臓がん組織抽出物で培養されたDRGニューロンは、通常、健康な膵臓組織抽出物よりも高い神経突起密度を示します。対照的に、腸神経叢ニューロンは、健康な膵臓組織抽出物よりも長い神経突起を形成します。次のプロトコルでは、新生仔マウスのDRGおよび筋腸神経叢ニューロンに対してin vitro神経可塑性アッセイを実施します。
- 細胞を培養用に調製するには、血球計算盤を使用してニューロンとグリアの総数を推定します。次に、24ウェルプレートの13mmプレコートカバースリップに細胞を播種します。使用されるコーティングは、実験の目的によって異なります。次に、ウェルに神経基底培地をトッピングし、細胞をウェルに一晩付着させます。翌日、組織抽出物添加培地、または細胞株上清添加培地を解凍します。
次に、DRGから播種培地を吸引し、オプションでPBSで非常に穏やかに洗浄します。次に、組織抽出物を添加した培地または細胞株上清を補充した培地を細胞上にゆっくりとピペットで移し、100μg/ミリリットルを生成します。次に、組織抽出物または細胞株上清に供給された培地で細胞を摂氏37度で48時間増殖させます。48時間後、培地を吸引し、免疫染色のために4%パラホルムアルデヒドで固定します。
二重免疫蛍光染色には、ニューロン特異的マーカーとグリア特異的マーカーを使用します。形態計測には、CCDカメラを搭載した倒立型光学顕微鏡と自動ソフトウェアを組み合わせて神経突起密度を測定します。200倍の倍率を使用して、50 X 50ミクロンのグリッドを重ね合わせ、交差する繊維で測定された正方形あたりの繊維密度を数えることにより、神経細胞培養の神経突起密度を測定します。各カバーガラス上の4〜5枚の代表的な顕微鏡写真で、最も密集した成長の4つの異なる領域についてこの分析を繰り返します。
神経突起と周辺核をマークすることにより、各カバースリップからランダムに選択された30の孤立ニューロンから神経突起伸長、ニューロンあたりの平均枝数、平均枝長、および核周囲サイズを測定します。