0 閲覧数 • 6:26 分 • April 30th, 2023
- 腫瘍浸潤では、末梢腫瘍細胞が上皮間葉転換(EMT)を受け、細胞外マトリックス(ECM)が局所的に分解されます。腫瘍細胞とECMとの相互作用をin vitroで研究することができます。
これらの相互作用を研究するには、膵臓腫瘍細胞に由来する予め形成されたスフェロイドを、コラーゲン足場、埋め込み蛍光トレーサープローブおよび培地を含むプレートに移します。腫瘍スフェロイドはプロテアーゼを放出し、コラーゲンを分解してECMの剛性を低下させ、ECM内のトレーサープローブが自由に動きます。
プレートを希望の時間インキュベートします。光学顕微鏡でサンプルを観察し、コラーゲン足場内のサンプルポイントのグリッドを見て、それらからのビデオデータを記録します。スフェロイドの近くのマトリックスの領域は、コラーゲンの分解が最大になります。したがって、プローブの動きが増加しています。対照的に、スフェロイドから遠い領域はコラーゲンの分解が少なく、プローブ分子の動きが制限されます。
トレーサー粒子の軌道を測定することによりECMのレオロジー特性を調べるこの技術は、粒子追跡マイクロレオロジーまたはPTMとして知られています。次のプロトコルでは、膵臓がん幹細胞を同定し、メトホルミンの効果を評価するために球体形成アッセイを行います。
まず、2ミリリットルのバイアル2本を備えた層流フード内にワークステーションを準備します。バイアル 1 には腫瘍スフェロイドが含まれ、バイアル 2 は無細胞コントロールになります。カルボン酸修飾された直径1ミクロンの蛍光トレーサープローブの希釈混合物を調製し、25部の滅菌水に2部のストックプローブを加えます。
冷蔵庫から1ミリリットルあたり3.1ミリグラムのウシコラーゲンのボトルを取り出し、氷の上に置きます。125マイクロリットルのコラーゲンを分量し、続いて50マイクロリットルの希釈したトレーサープローブ溶液をバイアル1に分注します。プローブを分散させるために短時間渦
巻く。次いで、フェノールレッドを含有する適切な細胞培養培地235マイクロリットルを総量410マイクロリットルに加え、短時間ボルテックスした後、205マイクロリットルを取り出してバイアル2に入れる。次に、約2マイクロリットルの1モル水酸化ナトリウムをバイアル1に加えて、溶液を中性pHに戻します。渦を少し混ぜます。その後、混合物が硬化し始めないように、すぐにアイスラックに戻します。
腫瘍スフェロイドを含むウェルから40マイクロリットルの培地を静かに取り出します。次のステップを実行する間、この40マイクロリットルを保持します。ウェルをチェックして、前の手順でスフェロイドが除去されたかどうかを確認します。そうでない場合は、40マイクロリットルをウェルに戻し、前の手順を繰り返します。
そうであった場合は、スフェロイドを含む40マイクロリットルをバイアル1に加えます。バイアル1を穏やかに攪拌してから、混合物を60マイクロリットルの部分で96ウェルプレートの3つの別々のウェルに移します。混合物を添加した後、顕微鏡で各ウェルを検査し、どのウェルにスフェロイドが含まれているかを判断します。
次に、約2マイクロリットルの1モル水酸化ナトリウムと40マイクロリットルの細胞培養培地をバイアル2に加え、ボルテックスしてから、この混合物の60マイクロリットルを96ウェルプレートの空のウェルに分注し、無細胞コントロールとして標識します。プレートを摂氏37度のインキュベーターに入れ、少なくとも1時間硬化させます。
サンプルポイントのグリッドを作成するには、まず、サンプルプレートをインキュベーターから顕微鏡ステージに移します。加熱ステージが利用できない場合は、サンプルが室温まで平衡化するまで10分間待ちます。低倍率の対物レンズでサンプルを観察し、サンプルが無傷でイメージングの準備ができていることを確認します。ウェル内の腫瘍の位置を決定し、これを透過光画像で文書化し、その後の空間的共レジストレーションのために
記録します。通常、回転楕円体の周りの同心円状のリングに分布した各ウェルの20個のサンプルポイントは、十分に詳細な結果を生成します。ステージを各目的の位置に移動し、顕微鏡インターフェースソフトウェアを使用してx座標とy座標を記録します。
顕微鏡を高倍率の対物レンズに切り替え、トレーサープローブの励起波長に適したフィルターキューブを選択します。作成したポイントのリストを使用して、グリッド内の最初のポイントに移動します。フォーカスを調整してウェルの底を見つける前に、上に移動してフィールドを見つけます view いくつかの焦点が合ったトレーサープローブが含まれています。
強度ヒストグラムを観察し、露出強度と時間を調整して、画像が飽和しないようにしながら、可能な限り最大のダイナミックレンジを提供します。フレームあたり 20 から 30 ミリ秒のフレーム レートでビデオ シーケンスを取得し、適切な命名規則で保存します。記録中は、顕微鏡やテーブルに触れないでください。
グリッド内の各サンプルポイントに対して録音を繰り返します。次に、このプロセスを繰り返して、実験の各ウェルのグリッドを構築し、縦断的なモニタリングの期間中、各時点についてプロセス全体を繰り返します。