Name: 核輸送の1分子イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: 学ぶ核輸送の1分子イメージング法。蛍光顕微鏡を用いてHeLa細胞の核膜孔複合体を通過する単一分子の動態を可視化し、輸送時間や効率を定量的に解析する技術を解説します。

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このプロジェクトは、研究能力向上グラント（ボーリンググリーン州立大学）によってサポートされていました。

<ol><li>Ma, J., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Snapshots+of+Three-Dimensional+Distribution+of+Transient+Interactions+in+Nuclear+Pore+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Snapshots of Three-Dimensional Distribution of Transient Interactions in Nuclear Pore Complex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Sarma, A., Goryaynov, A., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Imaging+of+the+Calcium-Regulated+Nuclear+Pore+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Imaging of the Calcium-Regulated Nuclear Pore Permeability.</a> , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Yang, W., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+single+molecules+transiting+through+nuclear+pore+complexes+using+narrow-field+epifluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing single molecules transiting through nuclear pore complexes using narrow-field epifluorescence microscopy.</a> Methods. 39, 316-328 (2006).</li>
<li>Yang, W., Gelles, J., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+single-molecule+translocation+through+nuclear+pore+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Imaging of single-molecule translocation through nuclear pore complexes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12887-12892 (2004).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ケアは、実験中にNEと単一分子の適切な共存を保証するために注意する必要があります。信号が低い貧しいラベルまたは退色が原因である場合は特に、高い信号対雑音比を提供することも重要です。ローカライズの精度は、バックグラウンドノイズ（アウトフォーカス蛍光、CCDの読み出しノイズ、暗電流とその他の要因に起因する）によって制限されます。

核輸送の1分子イメージング

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

単一分子蛍光顕微鏡のアプローチの有用性は過去10年間、生物学的反応を理解する上で非常に無駄であることが実証されています。細胞内の深い高時間空間分解能で分子間相互作用の調査は、ために個々の分子から生じる本質的に弱い信号に挑戦し続けている。 Yangらによる最近の作品。狭い視野落射蛍光顕微鏡、単一分子レベルでの核 - 細胞質間輸送の可視化を可能にすることを示した。信号に依存し、独立した貨物分子の単一分子のアプローチ、このような核輸送の時間と効率性などの重要な動力学、、によって得られている。ここでは0.4ミリ秒と12 nmの改良された時空間分解能を持つ方法論的アプローチのためのプロトコルを説明した。改良された解像度は、私たちは半無傷の細胞で核膜孔複合体（NPC）を通じて一時的な能動輸送と受動拡散のイベントをキャプチャすることができました。我々は、このメソッドは、他の結合と細胞内トラフィッキングのイベントを解明することに使用されることを期待しています。

単一分子顕微鏡は、核輸送への新たな洞察を提供approch。

単一分子蛍光顕微鏡法のアプローチの有用性は、...にわたる生物学的反応を理解する上で非常に有益であることが証明されています。

細胞の核膜には約2000個の核膜孔複合体が存在し、RNA、リボソーム、特定のタンパク質、炭水化物、シグナル分子などの水溶性分子の輸送を可能にしています。透過性の細胞に標識した貨物分子を添加することで、核膜孔を通過する単一分子の移動を蛍光顕微鏡で可視化できます。局在化に加え、輸送時間、インポートおよびエクスポート効率、進入頻度などの時空間的特性を決定するには、タイムラプス画像が必要です。こんにちは、ボウリンググリーン州立大学生物学部の単一分子顕微鏡研究室の博士課程学生、アレックス・オヴです。私はAsha P Shemaです。単分子顕微鏡ラボの修士課程の学生です。私はJumaです。こちらの単分子顕微鏡ラボのポストドクター研究員です。本日は、HeLa細胞における核膜孔複合体（NPC）を通過する核輸送の単分子イメージングの手順をご紹介します。当研究室では、この手法を用いて、さまざまな分子の核膜孔複合体を介した輸送を研究しています。それでは、始めていきましょう。核輸送実験用のタンパク質を調製するため、核輸送貨物タンパク質の産生に関与する遺伝子を発現するように形質転換されたJM 1 0 9 E. coliをLB培地で培養し、IPTGで誘導します。細胞が対数増殖期に達し、光学密度（OD）が0.7から0.8になったら、培養液を4°Cで6,000 ×gにて15分間遠心分離し、上清を捨ててペレットの重量を測定します。その後、アフィニティー精製および解析に適したタンパク質を抽出するため、細胞を1gあたり10mLのCeltic Bで再懸濁します。次に、適切な量のプロテアーゼカクテルをmidsole DNAs oneとbeta me capto ethanolに加えます。この混合物を氷上で暗所に置き、30分間撹拌します。その後、4°Cで25,000 ×gにて20分間遠心分離を行います。遠心分離後、クロマトグラフィーの準備として、上清を新しいボトルに移します。400 µLのニッケルNTAおよびアセトンを4本のマイクロ遠心チューブに分注します。16,000 ×gで3分間遠心分離します。上清を廃棄します。次に、溶解洗浄バッファーを400 µL加えます。最終洗浄の後、前述の洗浄ステップを3回繰り返します。ニッケルNTAを溶解バッファーで再懸濁し、4本すべてのチューブを細胞上清が入ったボトルに加えます。得られた混合物を、遮光容器に入れて氷上で60分間、ゆっくりと攪拌します。蛍光タンパク質の光退色を防ぐため、エコパッククロマトグラフィーカラムをアルミホイルで包んで準備します。また、カラムの下にラックを設置し、12本の回収チューブを配置します。混合液を60分間攪拌した後、SNAニッケルNTA混合液を10 millilitersロードし、完全に通過させます。その後、分画回収を開始します。次に、10

single-molecule-imaging-of-nuclear-transport

Research

JoVE Journal

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核輸送の1分子イメージング

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