Name: 核輸送の1分子イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: 学ぶ核輸送の1分子イメージング法。蛍光顕微鏡を用いてHeLa細胞の核膜孔複合体を通過する単一分子の動態を可視化し、輸送時間や効率を定量的に解析する技術を解説します。

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このプロジェクトは、研究能力向上グラント（ボーリンググリーン州立大学）によってサポートされていました。

<ol><li>Ma, J., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Snapshots+of+Three-Dimensional+Distribution+of+Transient+Interactions+in+Nuclear+Pore+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Snapshots of Three-Dimensional Distribution of Transient Interactions in Nuclear Pore Complex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Sarma, A., Goryaynov, A., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Imaging+of+the+Calcium-Regulated+Nuclear+Pore+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Imaging of the Calcium-Regulated Nuclear Pore Permeability.</a> , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Yang, W., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+single+molecules+transiting+through+nuclear+pore+complexes+using+narrow-field+epifluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing single molecules transiting through nuclear pore complexes using narrow-field epifluorescence microscopy.</a> Methods. 39, 316-328 (2006).</li>
<li>Yang, W., Gelles, J., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+single-molecule+translocation+through+nuclear+pore+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Imaging of single-molecule translocation through nuclear pore complexes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12887-12892 (2004).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ケアは、実験中にNEと単一分子の適切な共存を保証するために注意する必要があります。信号が低い貧しいラベルまたは退色が原因である場合は特に、高い信号対雑音比を提供することも重要です。ローカライズの精度は、バックグラウンドノイズ（アウトフォーカス蛍光、CCDの読み出しノイズ、暗電流とその他の要因に起因する）によって制限されます。

核輸送の1分子イメージング

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

単一分子蛍光顕微鏡のアプローチの有用性は過去10年間、生物学的反応を理解する上で非常に無駄であることが実証されています。細胞内の深い高時間空間分解能で分子間相互作用の調査は、ために個々の分子から生じる本質的に弱い信号に挑戦し続けている。 Yangらによる最近の作品。狭い視野落射蛍光顕微鏡、単一分子レベルでの核 - 細胞質間輸送の可視化を可能にすることを示した。信号に依存し、独立した貨物分子の単一分子のアプローチ、このような核輸送の時間と効率性などの重要な動力学、、によって得られている。ここでは0.4ミリ秒と12 nmの改良された時空間分解能を持つ方法論的アプローチのためのプロトコルを説明した。改良された解像度は、私たちは半無傷の細胞で核膜孔複合体（NPC）を通じて一時的な能動輸送と受動拡散のイベントをキャプチャすることができました。我々は、このメソッドは、他の結合と細胞内トラフィッキングのイベントを解明することに使用されることを期待しています。

単一分子顕微鏡は、核輸送への新たな洞察を提供approch。

単一分子蛍光顕微鏡法のアプローチの有用性は、...にわたる生物学的反応を理解する上で非常に有益であることが証明されています。

細胞の核膜には約2000個の核膜孔複合体が存在し、RNA、リボソーム、特定のタンパク質、炭水化物、シグナル分子などの水溶性分子の輸送を可能にしています。透過性の細胞に標識した貨物分子を添加することで、核膜孔を通過する単一分子の移動を蛍光顕微鏡で可視化できます。局在化に加え、輸送時間、インポートおよびエクスポート効率、進入頻度などの時空間的特性を決定するには、タイムラプス画像が必要です。こんにちは、ボウリンググリーン州立大学生物学部の単一分子顕微鏡研究室の博士課程学生、アレックス・オヴです。私はAsha P Shemaです。単分子顕微鏡ラボの修士課程の学生です。私はJumaです。こちらの単分子顕微鏡ラボのポストドクター研究員です。本日は、HeLa細胞における核膜孔複合体（NPC）を通過する核輸送の単分子イメージングの手順をご紹介します。当研究室では、この手法を用いて、さまざまな分子の核膜孔複合体を介した輸送を研究しています。それでは、始めていきましょう。核輸送実験用のタンパク質を調製するため、核輸送貨物タンパク質の産生に関与する遺伝子を発現するように形質転換されたJM 1 0 9 E. coliをLB培地で培養し、IPTGで誘導します。細胞が対数増殖期に達し、光学密度（OD）が0.7から0.8になったら、培養液を4°Cで6,000 ×gにて15分間遠心分離し、上清を捨ててペレットの重量を測定します。その後、アフィニティー精製および解析に適したタンパク質を抽出するため、細胞を1gあたり10mLのCeltic Bで再懸濁します。次に、適切な量のプロテアーゼカクテルをmidsole DNAs oneとbeta me capto ethanolに加えます。この混合物を氷上で暗所に置き、30分間撹拌します。その後、4°Cで25,000 ×gにて20分間遠心分離を行います。遠心分離後、クロマトグラフィーの準備として、上清を新しいボトルに移します。400 µLのニッケルNTAおよびアセトンを4本のマイクロ遠心チューブに分注します。16,000 ×gで3分間遠心分離します。上清を廃棄します。次に、溶解洗浄バッファーを400 µL加えます。最終洗浄の後、前述の洗浄ステップを3回繰り返します。ニッケルNTAを溶解バッファーで再懸濁し、4本すべてのチューブを細胞上清が入ったボトルに加えます。得られた混合物を、遮光容器に入れて氷上で60分間、ゆっくりと攪拌します。蛍光タンパク質の光退色を防ぐため、エコパッククロマトグラフィーカラムをアルミホイルで包んで準備します。また、カラムの下にラックを設置し、12本の回収チューブを配置します。混合液を60分間攪拌した後、SNAニッケルNTA混合液を10 millilitersロードし、完全に通過させます。その後、分画回収を開始します。次に、10 millilitersの溶解洗浄バッファーを加えます。完全に通過させます。その後、10 millilitersのIZOバッファーを加え、通過させます。分画の回収を継続します。次に、0.5 mLの溶出バッファーを流し、12分画すべてが回収されるまで溶出バッファーの通液を繰り返します。どの分画に最も高濃度のタンパク質が含まれているかを確認するため、各分画を4 µLずつページゲルに供し、クマシー染色を行います。標準的な手順に従い、最も濃度の高い画分を合わせ、溶出バッファーで事前に洗浄した孔径10 kilo daltonsのnano step Filterに500 microliters分を加えます。16,000 times gravityで5分間遠心分離し、タンパク質を濃縮します。バッファーを除去し、残ったタンパク質画分を撹拌した後、さらに500 microlitersをフィルター遠心分離機に加えます。同様に、選択したすべての分画について操作を繰り返します。次に、濃縮タンパク質の最終容量を溶出バッファーで約 50 µL に調整します。その後、マイクロピペットでフィルター表面から穏やかに攪拌しながら回収し、イオン交換カラムおよびサイズ排除カラムに供して超高純度タンパク質を得て、最終的なタンパク質濃度を決定します。次に、Alexa 555やAlexa 647などの過剰な補助反応性有機染料を用いて、カーゴ分子をラベルします。これは、GFP固有の緑色蛍光が光安定性に欠け、また細胞の自家蛍光とスペクトルが重複するため、核輸送の単分子イメージングに使用できないためです。ラベル化されたタンパク質は、実験の前日に25 µLずつの数分画に分けて、-80 °Cで保存する必要があります。オートクレーブ滅菌したカバーガラスを滅菌済みの35 mmペトリ皿に置き、その上に9 mLのDMEMをピペッティングします。次に、細胞培養液を1 mLピペッティングし、使用するカバーガラス上に均一に滴下します。ここで使用する細胞は、GFP標識された膜タンパク質POM 1 21を発現するようにあらかじめ遺伝子工学的に構築されています。その後、ディッシュを二酸化炭素インキュベーターに12時間置いておきます。実験当日、フローチャンバーの準備を開始します。次に、インキュベーターから細胞コーティング済みのスライドを取り出し、スライドを乾燥させ、真空グリースを用いて固定します。自作のアルミフレームに取り付けますが、準備中に細胞が乾燥しないようにすることが極めて重要です。10 mLのプラスチック製シリンジを用いて、ピンセットでカバーガラスの両側にシリコンを2本線状に塗布します。シリコンを2本線状に塗布した小さな準備済みカバーガラスを、細胞コーティング済みスライドの上に反転させて置き、軽く押し付けてフローチャンバーを作成します。1枚の細胞コーティング済みスライド上に2つの独立したチャンバーを準備する場合、交叉汚染を防ぐために、密閉性が十分であることを確認することが不可欠です。次に、チャンバー同士を密閉するため、スライドの上端から下端まで、チャンバー間にシリコングリスを数本線状に塗布します。また、チャンバーの外側にも同様にグリスを数本線状に塗布してください。細胞の乾燥を防ぐため、フローチャンバーにDMEMを加えます。次に、綿棒を用いてスライドの底部を水で2回、続いて100% ethanolで2回洗浄します。フレームを顕微鏡に固定します。25 µLの輸送バッファーをフローチャンバーに加え、ウィッキングさせることで2回洗浄します。出口側に小さなフィルターペーパーを当て、25 µLのdigitoninを用いて細胞を約2分間1回透過させます。透過の状態は明視野でリアルタイムにモニタリングしてください。最後に、核の浸透圧による腫脹を防ぐため、1.5% polyvinypyrrolidone（PVP）を添加したトランスポートバッファー25 µLで細胞を洗浄します。顕微鏡下で透過させた細胞を探し、明るい緑色の蛍光リングを確認します。次に、細胞の赤道面にフォーカスを合わせ、蛍光標識されたカーゴ分子を添加する前に画像をキャプチャします。核膜の領域を選択し、完全にフォトブリーチングされるまで633 nmのヘリウムネオンレーザーで照射し、オートフルオレッセンスを除去します。通常、これには2分以上の時間を要します。1.5% PVPを含む輸送バッファーで希釈した標識デキストランサンプルを25 µL、フローチャンバーに添加し、フィルターペーパーのウィックを用いてチャンバー内に広げます。透過性細胞である輸送カーゴタンパク質を添加する際は、激しい動きによってフォーカスが容易に乱れるため、細心の注意を払ってください。フォトブリーチングを回避し、フォトブリーチングを受けていない新しい単一分子が核膜に接近できるように、光学チョッパーを約5 Hzで動作させます。サンプル分子を添加した後、核膜孔複合体を通る転位を捉えるため、単一分子転位の一連の動画を取得する必要があります。転位分子の輸送軌跡を照射し、正しく実行されているかを確認するために、633 nmのヘリウムネオンレーザーを使用します。このプロトコルにより、核膜孔複合体と相互作用する単一の貨物分子の転位を示す一連の画像を取得することが可能です。透過した後、1〜21個の細胞を用いました。個々の移行するデキストラン分子の空間的な軌跡を追跡することで、核膜を通過する拡散の詳細なステップを区別することができます。ここでは、赤色のスポットとして示される単一のデキストラン分子が細胞質から始まり、緑色のピクセル線で示される核膜と相互作用し、最終的にこちらの核内に到達した、細胞質から核への移行イベントを示しています。デキストラン分子が細胞質から始まり、核膜と相互作用し、細胞質に戻りました。この例では、デキストラン分子が核から始まり、核膜と相互作用し、核に戻りました。そしてここでは、デキストラン分子が核から始まり、核膜と相互作用し、細胞質で終わりました。個々の透過デキストラン分子の空間的な軌跡を追跡することで、核膜を介した拡散の詳細なステップを区別することができます。青い線と白抜きの点で示されたイベントの軌跡を決定し、黒い線で示された核膜に重ね合わせました。緑色と赤色の線は、核膜から細胞質側および核側へ100 nanometer離れた距離を表しています。核膜孔複合体を通過する単一分子の転位を、10ナノメートルの分解能と400マイクロ秒の時間分解能で可視化する方法について説明しました。この手順において、可能な限り最大の信号対雑音比を確保することが不可欠である点に留意してください。また、単一分子実験の実施中は、フォーカスが容易に乱れる可能性があるため、細心の注意を払う必要があります。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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