慢性二光子用薄型頭蓋骨のウィンドウテクニック in vivoでイメージング

HIVに感染した成人患者では、神経炎症が正常なシナプス信号伝達を妨げ、抽象化、言語流暢性、注意、学習、新しい情報の習得、および記憶に関する困難を含む神経認知機能欠損を引き起こします。HIV-1 tatは炎症性分子の分泌を誘導し、これによりHIV感染患者に見られるシナプス機能不全を模倣させることができます。本研究では、ミクログリアを含む単核細胞にGFPを発現させた成マウスを用い、薄頭蓋二光子顕微鏡を用いてHIV-1 tat誘導性の神経炎症を調査します。

tatの注入後のミクログリアの反応を生体内でイメージングすることができます。得られた画像では、ミクログリア突起の短縮と肥厚、食細胞様のカップ状構造の形成、および脳微小血管における末梢単球のトラフィッキングが示されています。こんにちは、ロチェスター大学のハリス・ガルバード研究室および神経発達・疾患センターのダン・マーカーです。

こんにちは。ロチェスター大学神経生物学・解剖学部門、Esca研究室のEF Trombleyです。こんにちは。同じくAlbas研究室のShain Luuです。今日は、薄い頭蓋骨標本を用いた2光子イメージングの手順をご紹介します。

この手順を用いて、慢性神経炎症の研究を行います。それでは、ここに示す実験を開始しましょう。ここでは、ミクログリアを含む単核細胞系譜においてGFPを発現するOTが使用されます。

特定のプロジェクトのニーズに合わせて、異なる系統のマウスを使用することができます。フェンタニル、ミダゾラムを用いて麻酔をかけたマウスの手術準備を開始します。まず、尾部をピンチするなどの疼痛刺激に動物が反応しなくなっていることを確認してください。

麻酔後の低体温症を防ぐため、動物をヒーティングパッドの上に置きます。次に、眼球を湿潤に保つため、保護用の眼軟膏を動物の目に塗布します。すべての手術器具は、オートクレーブまたはガラスビーズ滅菌器で滅菌されている必要があります。さらに、器具を70%ethanolに浸して消毒してください。

ハサミを使用して動物の頭皮から被毛を除去し、10%ポビドンヨード溶液と70%エタノールを用いて患部を消毒します。小さなハサミを使用して、頭蓋骨から4〜5mm後方から開始し、眼の前方まで至る頭皮の正中線切開を行い、手術を開始します。この切開は、2光子イメージング中にマウスの頭部を固定するプレートの接着に皮膚が干渉しない十分な長さにする必要があります。

次に、100% ethanolを浸した滅菌綿棒を用いて、頭蓋骨上の膜を乾燥させます。その後、精細ピンセットでそれらを掻き出します。膜が除去されていない場合、ヘッドプレートの固定が不安定になります。

解剖顕微鏡下で、薄層化させる領域を特定します。頭蓋縫合線の直上に位置する関心領域は、頭蓋骨の安定性が低く、その下の太い血管や髄膜が観察窓から得られる関心領域の画像に干渉するため、避けてください。その後、綿棒を用いて、10% 塩化鉄溶液で再び頭蓋骨を処理します。

ヘッドプレートの下にある観察窓の縁に、perma bond 910 接着剤を薄く塗布します。次に、接着剤を密着させるため、動物の頭蓋骨の目的の領域に合わせてプレートを軽く押し当てて配置します。その後、シリンジを用いて観察窓の縁に少量のアクリル樹脂を塗布します。

最後に、漏れを防ぐため、観察窓の縁に少量の Tite 4 54 を塗布します。ヘッドプレートをアニマルホルダーにネジで固定し、解剖顕微鏡下で安定性を確認します。ピンセットで軽く触れて、ヘッドプレートに対して頭蓋骨が動かないことを確認してください。

薄層化の準備として、観察窓に生理食塩水を一滴滴下し、漏れがないことを確認します。滅菌綿棒と圧縮空気を用いて頭蓋骨を乾燥させます。マイクロドリルを用い、IRF 0 0 7ドリルビットで頭蓋骨を薄層化します。

4,000 RPMで、直径2～2.5 mmの円形領域を非常に慎重に薄くし始めます。頭蓋骨とほぼ平行に、軽いスイーピング動作のみで行ってください。

直接的な下方向への圧力をかけないでください。20～30秒ごとにドリルを停止し、圧縮空気を用いて骨粉を除去してください。このようにドリル操作を中断することで頭蓋骨を冷却し、下層の脳組織への熱誘導性損傷を防ぎます。

穿孔が進むにつれて、Diploと呼ばれるより湿った棘状骨層への移行に注意してください。この層に達したら、ドリル操作には細心の注意を払ってください。時折、薄い部分に生理食塩水を滴下し、解剖顕微鏡下で観察して頭蓋骨の薄さを確認してください。

生理食塩水はさらに放熱を促進します。頭蓋骨を薄くしていくと、より小さな血管が見えてきます。生理食塩水下で歯科用マイクロブレードを使用し、最終的な薄層化を行ってください。

マイクロブレードを使用することで、頭蓋骨の安定性に関する触覚フィードバックをより詳細に得ることができます。これにより、ドリルのみの場合よりもはるかに薄い作製が可能になります。イメージングに最適な頭蓋骨の厚さは 10 to 30 micrometers です。

薄層化プロセス全体には、通常15分から30分かかります。頭蓋骨ウィンドウを薄くする際は、エピ蛍光顕微鏡下で頭蓋骨の薄さを何度も確認してください。可視化されたミクログリアや血管系の鮮明さと深さは、イメージングの準備が整ったかどうかを判断する良好な指標となります。

ウィンドウの準備が整ったら、直径1 mmのガラスピペットを使用して、頭蓋骨の薄い領域にCyアクリル接着剤を少量滴下し、その上にカバーガラスを慎重に載せます。次に、頭蓋骨を軽く押して余分な接着剤を押し出します。この際、視野を妨げる可能性があるため、カバーガラスとの間に気泡が入らないように注意してください。乾燥後、2光子イメージングの準備として、マイクロブレードを用いてカバーガラスの上に残った接着剤を慎重に除去します。

薄い頭蓋皮質ウィンドウを生理食塩水で覆い、エピ蛍光下で目的領域を特定します。その後の領域イメージングを可能にするため、写真用カメラを使用して撮影を行います。ここでは、920 nanometersに調整されたTiサファイアレーザーを備えたカスタムメイドの2光子顕微鏡を使用しています。

蛍光は、全視野検出モードの光電子増倍管（PMT）および581/80エミッションフィルターを用いて検出します。イメージングセッション全体を通して20倍の水浸レンズを使用します。対物レンズのレーザー出力の最大値を50から65 milliwattsの間に設定してください。

次に、皮質層の第1層または第2層の、皮質表面から150 µmまでの範囲で関心領域を選択します。再イメージングを容易にするため、1倍、2倍、および3倍のデジタルズームで同一視野の写真を撮影してください。血管は、その後のイメージングセッションにおいて同一の視野を容易に見つけるためのランドマークとして利用できます。

3倍のズームで、1回あたり80〜90のZステップ、ステップサイズ0.69 µmとして、最大30分間、5分おきに複数のZスタックを取得します。これにより、Zスタックの取得間隔におけるミクログリアの形態と挙動を十分にサンプリングすることが可能になります。Zスタックの取得間に、生理食塩水の量と麻酔深度を確認してください。必要に応じて、注射中の投与前からシリンジや針への薬剤沈着を防ぐため、処置中に麻酔カクテルの初回投与量の3分の1をブースター投与することができます。

35ゲージの針と10 µLのマイクロボリュームシリンジにサイジング溶液を吸引して満たし、内壁をシロナイズします。溶液を室温で5分間静置した後、シリンジから溶液を排出し、プランジャーを取り外してシリンジと針を完全に乾燥させます。最後に、シリンジと針を脱イオン水で十分に洗浄します。

シロナイズ後、シリンジと針は再コーティングが必要になるまで6か月以上の期間使用可能です。注入当日に、シロナイズしたガラススライド上にTAT溶液を少量滴下します。シリコン処理したピペットチップを用い、この液滴から必要な量の溶液をマイクロボリュームシリンジに充填します。

ドリルビットを使用して、2光子画像を取得した薄い頭蓋骨皮質ウィンドウから吻側または外側に3 mm離れた位置に、直径0.5 mmの小さな開頭術を行います。この操作を行うには、まず頭蓋骨を慎重に薄くし、次に鋭いピンセットを用いて薄くなった骨層を除去します。

マイクロマニピュレーターを使用して、サイズ35ゲージの針とシリンジを開頭部位に合わせて配置します。次に、針を剥離面から700～900 µmの深さまで慎重に刺入します。マイクロプロセッサ制御のシリンジポンプを用い、分速80 nLの速度で3 µLを注入します。

この図は、薄い頭蓋骨皮質ウィンドウを植え込んだ後、剥離面から約50 µm下の深さで2光子イメージングを用いて可視化したGFP標識ミクログリアを示しています。ウィンドウ植え込みから15〜30分後の0日目、およびその7日後と17日後に撮影された単一の2光子断面像は、炎症刺激がない状態でもミクログリアが活性化したまま維持され、ウィンドウの透明性が保たれていることを示しています。これは、免疫エフェクター細胞と他の神経細胞タイプとの間の正常な相互作用および炎症時の相互作用の両方を調査する上で、本手法が有用であることを強調しています。

HIVニューロトキシンTATの注入後6時間および24時間に撮影したZ投影像では、活性化したミクログリアの顕著な形態的変化がin vivoで認められます。これは、神経炎症の急性および慢性モデルにおいて、ミクログリアの形態的変化をリアルタイムで観察できる我々の手法をさらに実証するものです。以上で、薄い頭蓋骨ウィンドウの作製方法と、それを用いた神経炎症の研究手法について解説しました。

前処理自体による損傷を防ぐため、頭蓋骨の処理には時間をかけて慎重に行うことが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆さんの実験の成功を願っております。