慢性二光子用薄型頭蓋骨のウィンドウテクニック in vivoでイメージング
September 19th, 2010
我々は繰り返しマウスミクログリアを可視化し、単球を循環させるための方法を説明します。 in vivoで経頭蓋二光子顕微鏡を用いて数時間、数日または数週間にわたって。我々は、HIV - 1調節タンパク質タットの隣接定位注入によって活性化することができる静止ミクログリアの断続的な観察を可能にする間伐 - 頭蓋骨のウィンドウを準備する方法を示します。
HIVに感染した成人患者では、神経炎症が正常なシナプスシグナル伝達を妨害し、抽象化、言語の流暢さ、注意学習、新しい情報、記憶の困難を含む神経認知障害を引き起こします。HIV 1 tatは炎症性分子の分泌を誘導し、これはここでHIV患者に見られるシナプス機能障害を模倣することができます。ミクログリアを含む単核細胞でGFPを発現する成体マウスを用いて、薄い頭蓋骨2光子顕微鏡を用いてHIV1tat誘発性神経炎症を調査します。
tat注入後のミクログリアの応答は、in vivoで画像化できます。得られた画像は、ミクログリアプロセスの短縮と肥厚、食細胞カップ様構造の形成、および脳の微小血管における末梢単球の輸送を示しています。こんにちは、ロチェスター大学のハリス・ガルバード研究室と神経発達・疾患センターのダン・マーカーです。
こんにちは、私はロチェスター大学の神経生物学および解剖学部門のエスカ研究所のEFトロンブリーです。こんにちは、同じくアルバス研究所のShain Luuです。今日は、薄い頭蓋骨調製物を使用した2光子イメージングの手順をご紹介します。
この手順を使用して、慢性神経炎症を研究します。それでは、ここに示す実験を始めましょう。ミクログリアを含む単核細胞系譜におけるOT発現GFPが用いられる。
特定のプロジェクトのニーズを満たすために、マウスの異なる系統を使用することができます。手術用のフェンタニル、ミダゾラムマイネ麻酔マウスの準備を開始します。まず、動物が尻尾のつまみなどの痛みを伴う刺激に反応しなくなったことを確認します。
麻酔後の低体温を防ぐために、動物を加熱パッドの上に置きます。次に、動物の目を保護用眼軟膏で覆い、目を湿らせます。すべての手術器具はオートクレーブまたはガラスビーズ滅菌器で滅菌され、器具を70%エタノールに浸してさらに消毒する必要があります。
はさみを使用して、動物の頭皮から毛を取り除き、10%ポビドンヨード溶液と70%エタノールを使用してその領域を消毒します。小さなハサミを使用して頭皮に正中線切開を行い、頭蓋骨に4〜5ミリメートルから始まり、目の前に向かって前進する手術を開始します。この切開は、2光子イメージング中にマウスの頭部を安定させるプレートの接着に皮膚が干渉しないように、十分に長くする必要があります。
次に、滅菌綿棒に100%エタノールを塗布して、頭蓋骨の上の膜を乾燥させます。細いピンセットでこすり落とします。メンブレンを取り外しないと、ヘッドプレートの取り付けが不安定になります。
解剖スコープの下で、薄くする領域を特定します。頭蓋縫合糸の上にある直接の関心領域は避けてください。これらの領域では頭蓋骨の安定性が低く、その下にある大きな血管や髄膜が関心領域の表示ウィンドウに送られる画像処理に干渉するためです。次に、綿棒を使用して、塩化第二鉄の10%溶液を使用して頭蓋骨を再度試してください。
パーマボンドの薄い層を置き、ヘッドプレートの下の表示ウィンドウの端の周りに9つの10接着剤を配置します。次に、プレートを動物の頭蓋骨の関心のある領域に軽く圧力で置き、接着剤を接着します。シリンジを使用して、表示ウィンドウの端に少量のアクリルを塗布します。
最後に、表示ウィンドウの端に少量のTite 4 54を塗ります。漏れを防ぐため。ヘッドプレートをアニマルホルダーにねじ込み、解剖顕微鏡で安定性を確認します 一対の鉗子で軽く探ることにより、ヘッドプレートに対して頭蓋骨が動かないようにする必要があります。
生理食塩水を一滴垂らします view薄くなる準備のために漏れがないことを確認します。滅菌綿棒と圧縮空気を組み合わせて頭蓋骨を乾かします。IRF 0 0 7ドリルビットを使用して頭蓋骨を薄くします。
4, 000 RPMで。直径2〜2.5ミリメートルの円形領域を非常に穏やかに薄くし始めます。頭蓋骨とほぼ平行な軽いスイープモーションのみを使用してください。
直接下向きの圧力は使用しないでください。20〜30秒ごとに穴あけを停止し、圧縮空気を使用して骨粉塵を取り除きます。これらの穴あけの中断により、頭蓋骨が冷えるため、下にある脳組織に熱による損傷が生じません。
穴あけが進むにつれて、ディプロと呼ばれる湿ったとげのある骨層への移行に注目してください。この層に到達したら、ドリルに特に注意してください。時々、薄い領域に生理食塩水を置き、解剖スコープの下で観察することにより、頭蓋骨の薄さを確認します。
生理食塩水はさらに熱放散を可能にします。頭蓋骨が薄くなると、小さな血管系が見えるようになります。歯科用マイクロブレードを使用して、生理食塩水下での最終的な薄化を実現します。
マイクロブレードは、頭蓋骨の安定性について、より触覚的なフィードバックを提供します。これにより、ドリル単体の場合よりもはるかに薄い準備が可能になります。イメージングに最適な頭蓋骨の厚さは10〜30マイクロメートルです。
間伐プロセス全体には通常15〜30分かかります。落射蛍光下での頭蓋骨の薄さを何度も確認しながら、薄い頭蓋骨の窓を作ります。目に見えるミクログリアと血管系の鮮明さと深さは、ウィンドウがイメージングの準備ができている時期についての良い指標を提供します。
窓の準備ができたら、直径1mmのガラスピペットを使用して、薄い頭蓋骨の部分にCyアクリル接着剤を少量滴下し、その上にカバーガラスを慎重に下げます。次に、頭蓋骨をそっと押して余分な接着剤を絞り出し、視界を遮る可能性のあるカバーガラスと頭蓋骨の間に気泡が形成されるのを防ぎます。乾いたら、マイクロブレードを使用して、2光子イメージングの準備として、カバーガラスの上部に残った接着剤を慎重に取り除きます。
薄い頭蓋骨皮質窓を生理食塩水で覆い、エピ蛍光の下で関心のある領域を特定します。その後のエリアのイメージングを可能にするには、イメージング用の写真カメラを使用して写真を撮ります。ここに示されているのは、920ナノメートルに調整されたtiサファイアレーザーを備えたカスタムメイドの2つの光顕微鏡を使用しています。
蛍光は、全視野検出モードの光増倍管またはPMTと5 81 80蛍光フィルターを使用して検出されます。イメージングセッション全体で20倍水没レンズが使用されます。対物レンズのレーザー出力の最大出力を50〜65ミリワットに設定します。
次に、皮面から最大150マイクロメートル下の皮質層1つまたは2つに関心のある領域を選択します。再イメージングを容易にするために、1 x 2 x と 3 x デジタル ズームで同じ視野の写真を撮ります。血管は、その後のイメージングセッションで同じ視野を簡単に見つけるためのランドマークとして機能します。
3 x のズームで、それぞれ 80 から 90 の Z ステップと 5 分ごとに 0.69 マイクロメートルのステップで最大 30 分間、複数の Zacks を取得します。これにより、Zacksの獲得間の経時的なミクログリアの形態と行動の良好なサンプリングが可能になり、生理食塩水のレベルと麻酔の深さを確認できます。必要に応じて、注射前の注射日中に注射器と針にタットが沈着するのを防ぐために、手術中に麻酔カクテルの元の用量の3分の1の追加投与を行うことができます。.
35ゲージの針と10マイクロリットルのマイクロボリュームシリンジの内側のライニングをサイジング液を引き出し、針とシリンジの両方を満たすまでサイジング溶液を吸引することで、サイジングしました。溶液を室温で5分間放置してから、シリンジから溶液を空にし、プランジャーを取り外して、シリンジと針を完全に乾かします。最後に、シリンジと針を脱イオン水で完全に洗います。
サイロ化すると、シリンジと針は、再コーディングが必要になるまで6か月以上使用できます。注射の日に、TAT溶液を少量垂らして、サイロ化したスライドガラスの上に置きます。シリコン処理されたピペットチップを使用して、この滴から必要な量の溶液をマイクロボリュームシリンジにロードします。
ドリルビットを使用して、直径0.5ミリメートルの小さな開頭術を、3ミリメートルの吻側または2つの光子画像が得られた薄い頭蓋骨皮質窓の外側のいずれかで行います。これを行うには、頭蓋骨を慎重に薄くします。次に、鋭利な鉗子を使用して、骨の薄い層を取り除きます。
マイクロマニピュレーターを使用して、サイズの35ゲージの針とシリンジを開頭術に並べます。次に、針を剥離面から700〜900マイクロメートルの深さまで慎重に進めます。マイクロプロセッサ制御のシリンジポンプを使用して、毎分80ナノリットルで3マイクロリットルを送達します。
この図は、剥離表面から約50マイクロメートル下にある薄い頭蓋皮質窓を移植した後、2光子イメージングで視覚化されたGFP標識ミクログリアを示しています。薄い頭蓋皮質窓の移植後15〜30分後の0日目に撮影された単一の2つの光子切片、および7日後と17日後に撮影されたものは、炎症性傷害がない場合にミクログリアが活性化されたままである間、窓が透明なままであることを示しています。このことは、免疫エフェクター細胞と他の神経細胞タイプとの間の正常相互作用と炎症性相互作用の両方を調査するためのこの方法の有用性を強調しています。
In vivoでは、HIV神経毒TATの注射後6時間および24時間で撮影されたZ投影は、活性化されたミクログリアの顕著な形態学的変化を示しています。さらに、神経炎症の急性および慢性モデルでミクログリアの形態学的変化をリアルタイムで研究する能力を実証します。薄い頭蓋骨の窓を準備し、それを使用して神経炎症を研究する方法を示しました この手順を行うとき。
頭蓋骨の手入れをするときは、準備自体による損傷を防ぐために時間をかけることを忘れないでください。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。
概要
この研究では、経頭蓋二光子顕微鏡法を用いたマウスのミクログリアおよび循環モノサイトの生体内可視化法を提示します。この技術により、HIV-1制御タンパク質Tatに対するマクログリア活性化の観察を長期間にわたって可能にします。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 免疫学
- 顕微鏡学
背景
- HIV感染は神経炎症および認知機能障害と関連しています。
- ミクログリアは脳の免疫反応において重要な役割を果たします。
- 経頭蓋二光子顕微鏡法により脳細胞のリアルタイムイメージングが可能になります。
- HIV-1 Tatタンパク質は脳に炎症反応を誘導します。
研究の目的
- ミクログリアの振る舞いを生体内で観察する方法を開発すること。
- HIV-1 Tatがミクログリア活性化に与える影響を評価すること。
- 神経炎症のメカニズムについての洞察を提供すること。
使用した方法
- イメージング用に頭蓋を薄くした窓の準備。
- 単核細胞にGFPを発現する成体マウスの使用。
- ミクログリア応答のイメージングに経頭蓋二光子顕微鏡法の使用。
- 神経炎症を誘導するためのHIV-1 Tatの注入。
主な結果
- Tat注入後のミクログリアのプロセスに顕著な形態学的変化が見られました。
- 活性化したミクログリアにおいて、食作用杯様の構造が観察されました。
- 脳微小血管において末梢モノサイトのトラフィッキングが認められました。
- この方法により細胞動態の長期観察が可能になりました。
結論
- 頭蓋を薄くした準備は、ミクログリアの生体内イメージングに効果的です。
- HIV-1 Tatはミクログリアの形態と振る舞いに顕著な変化を誘導します。
- この技術は神経炎症プロセスの理解を深める可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables chronic, minimally invasive imaging of microglial dynamics in vivo, addressing a key limitation in neuroinflammation research where traditional approaches induce confounding activation. By providing a stable imaging window for weeks, it supports longitudinal assessment of target engagement and phenotypic screening in neurodegenerative disease models. The technique enhances predictive confidence in preclinical de-risking by allowing repeated, quantitative readouts of microglial morphology and motility without surgical artifacts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing microglial responses to neurotoxic proteins like Tat in real time.
- Operational Value: Supports functional target validation through longitudinal tracking of microglial morphology and motility in disease-relevant systems.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing drug-induced effects from procedure-related artifacts in neuroinflammatory models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized, reproducible biological systems for quantitative imaging of microglial activation states.
- Operational Value: Enables assay readiness through stable, repeatable imaging sessions over weeks, reducing variability in compound screening.
- Scalability: Facilitates platform reuse for evaluating multiple compounds or genetic perturbations in the same animal cohort.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Models HIV-associated neurocognitive disorder and other neurodegenerative diseases with neuroinflammatory components using disease-relevant systems.
- Preclinical Validation: Supports risk-adjusted advancement decisions by enabling chronic observation of microglial changes in response to inflammatory stimuli.
- Biomarker Alignment: Correlates imaging-derived microglial phenotypes with functional outcomes, supporting translational biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, enabling iterative assessment of microglial modulators in neuroinflammatory contexts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by imaging microglial process dynamics and phagocytic cup formation in vivo.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs such as microglial motility, process thickness, and phagocytic activity for compound comparison.
- Analytics: Enables statistical analysis of time-lapse Z-stacks to quantify microglial activation states and morphological shifts.
- Translational Research: Connects microglial imaging to neurodegenerative disease models, supporting preclinical continuity in HAND and related disorders.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for chronic neuroinflammation studies across multiple experimental arms and timepoints.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in microglial activation studies.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through chronic, stable window preparation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing longitudinal, artifact-free data on target modulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neuroinflammatory candidates based on durable, quantifiable imaging endpoints.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine stereotactic surgery, cranial window preparation, and two-photon microscopy.
- Depends on precision instrumentation including microdrills, siliconized syringes, and tuned Ti:sapphire lasers.
- Necessitates cross-team standardization for consistent skull thinning depth (10–30 μm) and imaging parameters across sessions.
- Involves adaptation considerations when applying to different mouse strains or disease models beyond CX3CR1 GFP/+.
- Practical limitations include the need for careful anesthetic management and avoidance of direct downward pressure during skull thinning to prevent tissue damage.
