実験的転移とCTLの養子移入免疫療法のマウスモデル

この手順の全体的な目標は、腫瘍特異的なT細胞養子移植免疫療法の有効性を調べることです in vivo。これは、肺転移を確立するために、マウスに側尾静脈注射を介して腫瘍細胞を移植することによって最初に達成されます。手順の 2 番目のステップは、腫瘍特異的な細胞傷害性 T リンパ球 CTL を持つ腫瘍担架マウスを治療することです。

最後のステップは、腫瘍結節を視覚化および定量化する手段としてインディアインクを使用することです。最終的には、腫瘍のサイズを測定し、腫瘍結節の数を定量化することにより、さまざまな治療法のCIEを示す結果を得ることができます。こんにちは、私の名前はメアリー・ジマーマンで、ジョージア医科大学のケビン・ルー博士の研究室のメンバーです。

こんにちは、私の名前はShelene Hu.2年生で、Dr.Louの研究室でも働いています。生存曲線などの従来の方法に対するこの手法の主な利点は、この手順が定性的および定量的であることです。この技術の意味合いは、ヒトのがん患者におけるT細胞養子免疫療法を模倣しているため、がん治療にまで及ぶ可能性があります。

それでは、腫瘍細胞注射の前日に、1つのT75フラスコに1つのT75フラスコを1回10回7回まで播種しましょう。CMS 4 は、10% 血清を含有する RPMI 培地 10 ミリリットル中の細胞を満たしました。急速に成長する腫瘍細胞を得るためには、注射の日に摂氏37度で一晩インキュベートします。

培地を取り出し、PBSで細胞を一度すすぎ、次に0.05%トリプシンEDTAで摂氏37度で腫瘍細胞を5分間採取します。10%の血清を含む10ミリリットルのRPMI培地で反応を停止します。細胞を円錐形のチューブに移します。

細胞を1300 RPMでval legend RT遠心分離機で3分間スピンダウンします。室温で、スナットを取り出し、細胞を10ミリリットルの新鮮なXHB Ssに再懸濁して洗浄します。その後、再びスピンダウンし、同じ方法で再懸濁します。

血液上の腫瘍細胞を数えます。サイトメーター。HBSSで細胞を希釈して、各注入に必要な細胞が再懸濁されるようにします。総容量100マイクロリットルで、ビーカーで6〜8週齢のB SEAマウスを温め、温水に浸します。

尾静脈を拡張するには、マウスをベンチの尾静脈拘束具に置きます。マイクロシリンジを使用して、100マイクロリットルの腫瘍細胞を外側尾静脈に注入します。注射後の感染を避けるために敗血症技術を使用してください。.

出血が止まるまで、注射部位にわずかな圧力をかけます。.マウスをケージに戻し、腫瘍が目的の段階まで成長するのを待ちます。移管当日、ピペットを上下に動かして、調製した精製細胞傷害性Tリンパ球またはCTLを再懸濁します。

本文に記載されているように、1つのプレートからすべての細胞を15ミリリットルの円錐管に移し、体積が管の3分の2を超えないようにします。滅菌パスツールピペットを円錐管に挿入し、リンパ球の分離層を作ります。総体積が14ミリリットルに近づくまで、細胞の下に培地またはLSM

レイヤーを乱さないように注意してください。2000 RPMを室温で20分間遠心分離します。回転後にローターを減速するためにブレーキを使用せず、CTLを新しい15ミリリットルの円錐管に移します。

HBSSを約10ミリリットルの容量に加えます。洗うために。細胞を1300RPMで5分間スピンダウンします 室温でHBSSを注射に必要な細胞密度に再懸濁します。

注入あたりの総量を100マイクロリットルに保ちます。このビデオで前述したのと同じテールインジェクション技術を使用します。腫瘍担持マウスにCTLを注入するには、マウスをケージに戻し、CTLが腫瘍と相互作用するのを待ちます。

マウスは通常、CTL処理の14〜21日後に分析のために犠牲にされます。肺の転移を視覚化するには、犠牲にしたマウスを発泡スチロールボードの上に背中に置きます。脚を固定して、気管へのアクセスを妨げないようにします。

腹部中央部から70%エタノールを腹側にスプレーします。.はさみを使用して、胸郭を通って唾液腺に向かって正中線に沿って切ります。気管を露出させます。

鉗子を使用して、気管の周囲の組織を取り除きます。200マイクロリットルのピペットチップを片手で先端を保持している気管の下に通します。気管をそっと持ち上げて体から離します。

プラットフォームを180度回転させます。50ミリリットルの注射器を使用して、気管を介して肺にインディアインクを注入します。強い抵抗を感じるまで、インクで肺を完全に膨らませます。

はさみを使って気管を切断します。一対の鉗子を肺の下にスライドさせ、マウスから持ち上げます。化学薬品のヒュームフード内の1リットルのビーカーの水で肺を短時間すすぎます。

肺を5ミリリットルのFTI溶液を含むガラス製インスタレーション胆汁に移します。.腫瘍組織は、黒い肺に白い結節として現れます。数分後、腫瘍をカウントし、FTI溶液で無期限に開始できるようになりました。ここは。

乳がんをトランスフェクトしたマウスの肺。細胞株4 T-1は腫瘍を示す白い斑点を示しています。K 79 Eに対するIRF 8優性陰性免疫をトランスフェクションしたマウスは、腫瘍細胞の増強された転移能を示す。

これらの画像は、CTL養子移植免疫療法の有効性の組織学的解析を示しています。生理食塩水を注射した担腫瘍マウスは、6日後に複数の腫瘍を示し、矢印で示されました。一方、腫瘍特異的T細胞を注射したマウスは、同じ実験で腫瘍の減少を示しました。

インドのインク処理は、CTL養子縁組移植の有効性を測定する簡単な方法を提供します。ここでは、腫瘍を有する肺の白い腫瘍結節は、CTL養子移植を成功裏に受けた肺と明確に区別し、結節を数えることで、組織学では不可能な程度の定量化が可能になります。この手順を試みるときは、より簡単で正確な尾静脈注射のためにマウスを温めることを忘れないでください。

このビデオを見た後、腫瘍のサイズと数を定量化するためのこの簡単な手順を通じて治療の有効性を評価する方法についてよく理解しているはずです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。