実験的転移とCTLの養子移入免疫療法のマウスモデル

本手順の全体的な目的は、腫瘍特異的T細胞養道的移入免疫療法のin vivoにおける有効性を検証することです。まず、マウスの側尾静脈に腫瘍細胞を注入して肺転移を成立させます。次に、腫瘍を担持したマウスに対し、腫瘍特異的細胞傷害性Tリンパ球（CTL）を用いて治療を行います。

最終ステップでは、腫瘍結節を可視化し定量化するための手段としてインディアインクを使用します。最終的に、腫瘍サイズの測定および腫瘍結節数の定量化を通じて、異なる治療法のCIEを示す結果を得ることができます。こんにちは、私はジョージア医科大学のKevin Lu博士の研究室に所属しているMary Zimmermanです。

こんにちは、シェリーン・フーです。私は大学2年生で、ルー博士の研究室に所属しています。生存曲線などの従来の方法と比較して、この手法の主な利点は、定性と定量の両方の解析が可能であることです。この技術の意義は、ヒトの癌患者におけるT細胞養子免疫療法を模倣しているため、癌治療への応用が期待できる点にあります。

それでは始めていきましょう。腫瘍細胞を注入する前日に、10%血清を含む10 mLのRPMI培地を用いて、T75フラスコに最大1×10⁷個のCMS4met細胞を播種します。増殖速度の速い腫瘍細胞を得るため、注入当日まで37°Cで一晩インキュベートします。

培地を除去し、細胞をPBSで1回洗浄した後、0.05% trypsin EDTAを用いて37 °Cで5分間、腫瘍細胞を回収します。10% serum含有RPMI培地 10 mLを加えて反応を停止させます。その後、細胞をコニカルチューブに移します。

室温のval legend RT遠心機を用い、1300 RPMで3分間細胞を遠心分離します。室温で上清を除去し、細胞を10 mLの新鮮な1 XHB Ssに再懸濁して洗浄します。その後、同様の手順で再度遠心分離および再懸濁を行います。

hemo.Cytometerを用いて腫瘍細胞数を計測する。各注入に必要となる細胞数が再懸濁されるように、HBSSで細胞を希釈する。温水に浸したビーカー内で、6〜8週齢のB SEAマウスを合計100 µLの容量で温める。

尾静脈を拡張させるため、マウスをベンチ上の尾静脈拘束具に固定します。マイクロシリンジを使用して、100 µLの腫瘍細胞を尾静脈の外側へ注入します。注入後の感染を防ぐため、無菌操作を行ってください。

出血が止まるまで、注射部位を軽く圧迫してください。マウスをケージに戻し、腫瘍が目的のステージまで成長するまで待ちます。移入当日、ピペッティングを行い、調製した精製細胞毒性Tリンパ球（CTL）を再懸濁させます。

本文に記載されている通り、1枚のプレートからすべての細胞を15 mLのコニカルチューブに移し、液量がチューブの3分の2を超えないようにします。滅菌済みパストールピペットをコニカルチューブに差し込み、総量が14 mL近くになるまで、細胞の下にリンパ球分離培地（LSM）を層として加えます。

層を乱さないように注意してください。室温で 2000 RPM にて 20 分間遠心分離します。遠心後、ブレーキを使用してローターを減速させないでください。CTLを新しい 15 milliliter のコニカルチューブに移します。

HBSSを約10 mL加えます。洗浄するため、細胞をカウントし、室温で1300 RPMで5分間遠心分離します。その後、注射に必要な細胞密度になるようにHBSSで再懸濁します。

1回あたりの注入全量を100 µLに維持します。本ビデオの前の手順で示したものと同じ尾静脈注入の手法を用いてください。CTLを腫瘍担持マウスに注入した後、マウスをケージに戻し、CTLを腫瘍に作用させます。

通常、CTL処置の14～21日後にマウスを安楽死させ、解析を行います。肺転移を可視化するため、安楽死させたマウスをスチロフォームボードの上に仰向けに置きます。気管へのアクセスを妨げないよう、脚をピンで固定してください。

腹部中央から、腹側を70%ethanolで噴霧します。はさみを用いて、肋骨を通り正中線に沿って唾液腺に向かって切開します。気管を露出させます。

ピンセットを使用して、気管周囲の組織を取り除きます。片手で200 µLのピペットチップを持ち、気管の下に差し込みます。気管をゆっくりと持ち上げ、体から離します。

プラットフォームを180度回転させます。50 mLのシリンジを使用して、気管から肺にインディアインクを注入します。強い抵抗を感じるまで、インクで肺を完全に膨らませてください。

はさみで気管を切断します。ピンセットを肺の下に滑り込ませ、マウスから肺を取り出します。化学薬品用ドラフトチャンバー内で、1リットルの水を入れたビーカーを用いて肺を短時間すすぎます。

肺を5 mLのFTI溶液を含むガラス製容器に移します。黒色の肺の上に、腫瘍組織が白い結節として現れます。数分後、腫瘍のカウントが可能になり、その後はFTI溶液中で無期限に保存できます。

乳癌を移植したマウスの肺。細胞株 4T1 では、腫瘍を示す白い点が見られます。IRF8 ドミナントネガティブ変異体 K79E を導入したマウスでは、腫瘍細胞の転移能が亢進しています。

これらの画像は、CTL養子移殖免疫療法の有効性に関する組織学的解析を示しています。生理食塩水を注入した腫瘍担持マウスでは、6日後に矢印で示される複数の腫瘍が認められました。一方、腫瘍特異的T細胞を注入したマウスでは、同一の実験において腫瘍の減少が認められました。

インディアインク処理により、CTL養子移入の有効性をより簡便に測定することが可能です。ここでは、腫瘍担持肺上の白い腫瘍結節が、CTL養子移入に成功した肺と明確に区別されており、結節数を数えることで、組織学的検査では不可能な定量的な評価が可能になります。この手順を行う際は、より容易かつ正確に尾静脈注射を行うため、マウスをウォーミングアップさせることが重要であることに留意してください。

このビデオを視聴することで、腫瘍のサイズと数を定量化するこの簡便な手順を通じて、治療の有効性を評価する方法を十分に理解することができたはずです。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。