Name: 急性腎障害を研究するためにゼブラフィッシュ幼生の静脈内Microinjections (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-04T17:32:00.000+00:00
Duration: 15 min 55 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ幼生へのゲンタマイシン静脈内マイクロインジェクションによる急性腎障害モデル構築法。免疫組織化学で腎小管損傷を可視化し、腎毒性メカニズムと修復機構の研究に応用できる。

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この作品は、衛生研究所（NIH）助成金R01DK069403とP30DK079307の米国の国民の協会によって資金を供給された。

<ol><li>Hentschel, D. M., Park, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+renal+failure+in+zebrafish%3A+a+novel+system+to+study+a+complex+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), F923-F929 (2005).</li>
<li>Majumdar, A., Lun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+no+isthmus+reveals+a+role+for+pax2.1+in+tubule+differentiation+and+patterning+events+in+the+pronephric+primordia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish no isthmus reveals a role for pax2.1 in tubule differentiation and patterning events in the pronephric primordia.</a> Development. 127 (10), 2089-2098 (2000).</li>
<li>Weinstein, B. M., Stemple, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gridlock%2C+a+localized+heritable+vascular+patterning+defect+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Gridlock, a localized heritable vascular patterning defect in the zebrafish.</a> Nat Med. 1 (11), 1143-1147 (1995).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , University Oregon Press. Oregon. (1993).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

このビデオの記事では、ゼブラフィッシュ幼生におけるゲンタマイシンの媒介近位尿細管の損傷を作成することで、AKIのモデルのための静脈内マイクロインジェクション法を示した。心膜および/または総浮腫の形成にこの損傷は、その結果、水のバランスを調節することができないことを反映。我々はまた、細胞極性の喪失や損傷した腎臓の近位尿細管の混乱を示す、差別化された腎臓の尿細管を（マジュムダールら、2000）マーク抗体による免疫組織化学実験を説明した。静脈内microinjectionsは、ゼブラフィッシュ幼生の血流中に水溶性物質を提供するための効率的な方法を表しています。この手法は、様々な物質を導入するための優れたツールであり、蛍光マーカーのユニフォームの注射の助けを借りて、一貫性のある結果を可能にする、何度も繰り返すことができます。

<table><tbody><tr><td>&amp;alpha;6F マウスモノクローナル抗体</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ブロックホルダー EBH-2</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>15899</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスキャピラリ</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100-6</td><td></td></tr><tr><td>キャピラリーチューブ R-6 カスタムガラスチューブ</td><td>Drummond Scientific</td><td>9-000-3000</td><td></td></tr><tr><td>触媒粉末</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>02618</td><td></td></tr><tr><td>Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>155-165-003</td><td></td></tr><tr><td>デキストラン 10k ルシファーイエロー、リシン固定可能</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D1825</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>まつ毛</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>113</td><td></td></tr><tr><td>硫酸ゲンタマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8648</td><td></td></tr><tr><td>ガラスバイアル 4ml</td><td>Weathon</td><td>225012</td><td></td></tr><tr><td>鉄板</td><td>Narishige International</td><td>IP</td><td></td></tr><tr><td>JB-4 包埋溶液 A</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226A</td><td></td></tr><tr><td>JB-4 包埋溶液 B</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226B</td><td></td></tr><tr><td>ジョイスティック式マイクロマニピュレーター</td><td>Narishige International</td><td>MN 151</td><td></td></tr><tr><td>マグネチックスタンド</td><td>Narishige International</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>手動マイクロシリンジポンプ</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクション装置</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>PV820</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>ミクロトーム</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Shandon Finesse</td><td></td></tr><tr><td>軽質ミネラルオイル</td><td>Fisher Scientific</td><td>0121-1</td><td></td></tr><tr><td>ピペットプラー</td><td>Kopf Instruments</td><td>720</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック成形カップトレイ</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>16643A</td><td></td></tr><tr><td>カミソリブレード</td><td>VWR international</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>スライドウォーマー</td><td>Labline Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ステージマイクロメーター</td><td>WARD&amp;rsquo;s Natural Science</td><td>94 W 9910</td><td></td></tr><tr><td>傾斜台</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TB 1</td><td></td></tr><tr><td>トリカイン粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>Leica Microsystems</td><td>S6F</td><td>解剖顕微鏡</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>Leica Microsystems</td><td>M205FA</td><td>蛍光顕微鏡</td></tr></tbody></table>

急性腎障害を研究するためにゼブラフィッシュ幼生の静脈内microinjections

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

このビデオの記事では、nephrotoxicantとしてゲンタマイシンを使用してAKIのゼブラフィッシュモデルを説明します。テクニックは、2 DPFのゼブラフィッシュでの静脈内microinjectionsで構成されています。この手法は、時間あたり15〜20魚の注入を可能に、ゼブラフィッシュ幼生の血流中に可溶性物質を提供する効率的で迅速な方法を表します。 AKIの研究に加えて、このマイクロインジェクション技術はまた、血管造影などの実験研究の他のタイプに使用することができます。我々は減少し、腎機能の視覚的な措置に必要な機器からの技術の詳細なプロトコルを提供しています。さらに、我々はまた、腎臓の尿細管マーカーで幼生ゼブラフィッシュの埋め込みプラスチックと切片を固定、全体のマウント免疫組織化学のプロセスを示しています。浮腫、近位尿細管上皮細胞における細胞極性の喪失、および尿細管の形態学的混乱：私たちは、ゲンタマイシンを注射したゼブラフィッシュの幼虫は、一貫性のあるAKIとの形態的特徴を示して実証する。

我々は2日後fetilization（DPF）急性腎障害（AKI）を誘導するためにゼブラフィッシュの幼虫にアミノグリコシド、ゲンタマイシンを、マイクロインジェクションのテクニックを説明します。我々はまた、AKIの媒介の損傷を可視化するためにゼブラフィッシュ幼生の埋め込みプラスチックと切片全体のマウント免疫組織化学のための方法を、説明します。

急性腎障害を研究するためにゼブラフィッシュ幼生の静脈内Microinjections

このビデオ論文では、腎毒性物質としてゲンタマイシンを用いた急性腎障害（AKI）のゼブラフィッシュモデルについて解説します。この手法は、静脈内へのマイクロインジェクションで構成されており……

この手順の全体的な目的は、腎毒性物質としてAMGグリコシドであるゲンタマイシンを用い、ゼブラフィッシュに急性腎不全モデルを作製することです。まず、受精後2日目のゼブラフィッシュ幼魚の総前主静脈にゲンタマイシンを注入します。次に、受精後4日目の注入済み幼魚において、emu表現型のスコアリングを行います。手順の3番目のステップでは、受精後4日目のゼブラフィッシュを、腎尿細管上皮マーカーに対する抗体を用いて免疫組織化学染色処理します。手順の最終ステップでは、ゼブラフィッシュの幼魚を切片化し、細胞極性の喪失および尿細管構造の崩壊による尿細管の損傷を可視化します。最終的に、腎上皮抗体を用いた免疫組織化学染色により、損傷した腎尿細管セグメントを示す結果を得ることができます。こんにちは。ピッツバーグ大学発生生物学部のNeil Hari研究室のCarala San Cosentinoです。本日は、受精後2日目のゼブラフィッシュ幼魚にアミノグリコシド系抗生物質であるGentamycinをマイクロインジェクションする手順をご紹介します。当研究室では、ゼブラフィッシュ幼魚に急性腎障害を誘発させるためにこの手法を用いています。それでは、始めていきましょう。まず、計画している実験の3日前から成体ゼブラフィッシュを交配させます。受精後2日目の胚をステージングするために、5 mM 塩化ナトリウム、0.17 mM 塩化カリウム、0.33 mM 塩化カルシウム、0.33 mM 硫酸マグネシウムを用いてE3培地を調製します。胚を回収し、28.5 °Cに設定したインキュベーター内で、温めたE3水を入れたペトリ皿に配置します。1日目の最後に、ペトリ皿から死滅した胚を取り除きます。胚を1つのペトリ皿あたり80〜100個に分けて分注します。電極プラーを用いてキャピラリーチューブを引き、先端径が約10〜20 µmになるようにガラス注入針を作製します。引き出した後、キャピラリーを実体顕微鏡の下に置き、定規を用いて針に沿って約1 mm間隔の線を10本、油性マジックで書き込みます。針はクレイランプを置いた大きなペトリ皿に保管してください。次に、火を用いて保持ピペットを作成します。薄壁ホウケイ酸ガラスキャピラリーの先端の研磨。長いピンセットでガラスキャピラリーを保持し、キャピラリーの先端を炎の淡青色の内炎部分に垂直に1〜2秒間かざして加熱します。キャピラリーを回転させ、均一に融解させます。この操作を数回繰り返し、その後、ステージマイクロメーターを用いてキャピラリーを検査します。キャピラリーの外径は0.4から0.5 mmである必要があります。キャピラリーとホルダーの準備が完了したら、製造元の指示に従って、手動マイクロシリンジポンプにミネラルオイルを満たしてください。磁気スタンドを介して鉄板に接続されたジョイスティックマニピュレーターに、ピペットホルダーを挿入します。腎毒性注入混合液を20 µL調製します。対照rvaには、Gentamicin 2.4 nLとLucifer yellow dextran 17.6 nLを用います。ゲンタマイシンを生理食塩水に置換します。注入顕微鏡の近くに、注入前に腎毒性混合液および対照混合液を滴下するための、2 mLのミネラルオイルを入れた30 mmペトリ皿を2枚準備します。400 mgのトリカ粉末を97.7 mLの2回蒸留水および2.1 mLの1 M TRISに溶解し、pH 7に調整して麻酔薬を調製します。このストック溶液を4.2 mLのEloquaとともにフリーザーで保存します。トリカインを麻酔薬として使用するには、4.2 mLのトリカインストック溶液を100 mLのE3溶液で希釈し、室温に置いておきます。解剖顕微鏡下で幼魚を注入の準備とするため、微細ピンセットを用いて卵膜を手動で除去します。室温に温めたトリカインが入ったペトリ皿にゼブラフィッシュ幼魚を移し、麻酔をかけます。ゼブラフィッシュの幼魚を少なくとも15分間、tricaに曝露させます。マイクロインジェクションを開始する前に、カミソリの刃を用いてインジェクション針の先端を開口させます。刃をわずかに傾けてベベルを作成し、先端の開口径が約10～20 µmになるようにカットします。マイクロインジェクション装置の電源とエアサプライをオンにします。ニードルをニードルホルダーに挿入します。オイルを満たしたペトリ皿に注入溶液を10 µL滴下し、ニードルに充填します。顕微鏡下でマニュアルピコポンプの電源を入れ、針先をサブバージ（浸漬）させます。液滴内でピコポンプをベント設定にし、針内に液を満たします。これには数分かかります。溶液が針の中に速く流れ込む場合は、チップの直径が大きすぎ、注入精度が低下します。針に溶液を満たした後、ピコポンプを「hold」に設定して針を校正し、次にピコポンプのスイッチを「gated」に設定します。フットペダルを押し、針から溶液を吐出させ、メニスカスが1 mmの目盛りから次の目盛りまで移動するのにかかる時間を秒単位で記録します。この操作を3回繰り返し、平均時間を30（1 mmの直線距離に相当するナノリットル単位の体積）で除して、溶液1 nLを注入するのに必要なミリ秒数を算出します。レンジ期間ノブをこの数値に合わせ、ゲート時間スイッチを「timed」に切り替えます。これで、ペリスタルティックポンプが1 nanoliterの溶液パルスを投与するように設定されました。次に、幼虫の入ったペトリ皿を顕微鏡の下に配置します。幼虫をペトリ皿の中央に集め、顕微鏡の焦点を合わせます。ホールド用ピペットをマイクロインジェクターの反対側にある手動マイクロシリンジポンプに装着し、その先端をペトリ皿の顕微鏡の焦点面まで進めます。ホールド用ピペットの先端がペトリ皿の底に触れ、ほぼ水平になるよう、かなり浅い角度で曲げてください。顕微鏡の倍率を上げ、ハンドル付きの超極細アイラッシュを使用します。ゼブラフィッシュ幼魚の背面を下にして、卵黄が保持ピペットに非常に近い位置にくるように配置します。手動マイクロシリンジポンプを制御するマイクロメータードライブを反時計回りに回し、卵黄を保持ピペットに吸引してゼブラフィッシュ幼魚を固定します。卵黄が破裂する可能性があるため、マイクロメーターを回しすぎないように注意してください。保持ピペットに深く引き込まれすぎた場合は、卵黄の上の皮下にある共通基枢静脈に焦点を合わせます。ここは血流が非常に盛んな部位です。注入装置のマイクロマニピュレーターを使用して操作します。針を形成中の総前主静脈へと導きます。総前主静脈は非常に浅い位置にあるため、挿入後に針を少し引き戻す必要があります。保持用ピペットで幼虫のヨーク部分を適切に固定していれば、針の挿入時に幼虫が回転することはありません。フットペダルを押して、溶液を1 nanoliter注入します。その後、保持ピペットから幼魚を放し、幼魚用飼育水に戻します。マイクロインジェクションが成功したかを確認するため、ゼブラフィッシュ幼魚の心臓にLucifer yellow dextranが存在するかをモニターします。蛍光顕微鏡下で、ルシファーイエローは循環系内で約20分間視認可能です。受精後4日目に、幼魚を新鮮なE3培地に戻します。10〜15匹のゼブラフィッシュ幼魚を4 mLのガラスバイアルに入れ、1 mLのジエンズ固定液で室温にて4時間固定します。メタノール濃度を段階的に変化させたPBST（0.5%）を用いて、20%から75%、25%、50%、50%、25%、75%、100% PBSTの順に幼魚を再水和させます。その際、バイアル内の溶液をピペッティングで取り除き、新しい溶液を同じバイアルに添加します。バイアルあたり1 mLの溶液を使用します。各溶液に20分間浸します。幼虫を空気にさらしてはいけません。幼虫が常に少量の溶液に浸かっている状態にしてください。溶液を交換する際は、PBTを除去し、1% DMSO、0.5%～10%の正常ヤギ血清を含むブロッキング溶液PBS 1mLに置き換え、4℃のシェーカー（mutator）で3時間反応させます。その後、幼虫を2mLのEppendorfチューブに移します。ブロッキング血清を除去し、300 µLの一次抗体（1:25に希釈したモノクローナルナトリウムカリウムTPS α6F上清）および300 µLのインキュベーション溶液（1% DMSO、0.5% Tween 20、2%正常ヤギ血清含有PBS）に置換します。その後、振盪機を用いて4 °Cで一晩インキュベートします。一次抗体を除去し、室温で1 mLのインキュベーション溶液を用いて、振盪機を使用しながら1回30分間、計3回の洗浄を行います。次に、インキュベーション溶液で1:500に希釈した二次抗体とともに、室温で2時間インキュベートします。その後、PBTで30分間ずつ3回洗浄し、段階的なエタノール系列に10分ずつ浸漬させて幼虫を脱水します。JB-4包埋溶液A 25 mLと触媒0.24 gを用い、20〜30分間溶解させて浸透溶液を調製します。この溶液は4 °Cで最大1ヶ月間保存可能です。100% ethanolを除去し、プラスチック浸透液に交換します。チューブを4 °Cのローテーターに設置し、幼虫がチューブの底に沈むまで約30分間、浸透させます。幼虫を包埋するために、プラスチック成形カップトレイを解剖顕微鏡の下に配置します。幼虫を、幼虫が浸るのに十分な量の浸透液とともにカップに移します。プラスチック包埋剤は小さなプラスチックチューブ内で調製します。通常、1つのカップにつき1匹の幼虫を用いて、一度に4～5匹の幼虫を包埋し、5 mLの包埋用プラスチックを調製します。浸透液1mLにつき、JB-4埋め込み溶液Bを35 µL加えます。プラスチック製ペーストピペットまたはピペットを用いて、数回ピペッティングし、JB-4が適切に重合するように十分に混合します。5 mLの埋め込み樹脂を調製した後、円筒形サンプルの浸透樹脂をペーストピペットで取り除きます。カップに埋め込み樹脂を満たします。このとき、ブロックホルダーが試料にしっかりと固定されるよう、樹脂がカップから溢れ出るようにしてください。ゼブラフィッシュの腎尿細管を検出するには、横断切片が最適です。幼魚は垂直に包埋する必要があります。ハンドル付きのアイラッシュまたは微細ピンセットを用いて、頭を下にして固定してください。プラスチックが十分に硬くなり、幼虫が位置から動かなくなるまで、定期的に幼虫を垂直に配置します。これには約20〜30分かかります。その後、カップの上にEVH 2ブロックホルダーを設置し、重合が完了するまでトレイを4 °Cで一晩静置します。試料をミクロトームのチャックホルダーにセットし、スライドウォーマーを45 °Cに設定します。脱イオン水をビーカーに注ぎ、切片作成前にミクロトームの近くに配置します。幼虫の完全な横断面が得られるように、ブロックの向きを調整してください。方向調整レバーを回転させ、バックライトを使用して標本の位置を調整します。頭部を通して厚い切片を作成してください。各幼虫について、眼の同等な切片が採取されるようにブロックの方向を調整します。切片に胸鰭が現れたところが、前腎管の開始点です。ここから、ブロックから約32枚の4 micronの切片を切り出します。ピンセットで切片を回収し、ピンセットが水に触れないように注意しながら、水が入ったビーカーの中に切片を落としてください。切片が水面に触れるとすぐに広がります。ここで、スライドガラスを用いて切片を回収します。スライドガラスを45度の角度で水中に挿入し、ハンドル付きのアイラッシュを用いて切片に近づけ、切片の端のみに触れるようにして回収します。スライドガラスをスライドウォーマーで完全に乾燥するまでインキュベートし、落射型蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を用いて切片を観察・撮像します。正しく実施された場合、上の画像に示すように、注入された幼魚の血管系に蛍光ルシフェラーゼ黄色デキストランが認められます。下の画像のように注入が深すぎると、注入物が卵黄嚢に見られたり、心臓が穿刺されて過剰な出血が起こったりすることがあります。ここでは、ゲンタマイシンによる腎毒性の結果として、幼魚に心膜浮腫が生じている様子が見られます。上段のコントロール群の幼魚には心嚢水腫は見られません。しかし、ジェンタマイシンを注入すると、中段および下段のパネルの矢印で示されているように、ゼブラフィッシュ幼魚の80%に中等度または重度の水腫が現れます。ここでは表現型に基づく分類システムを使用しており、中等度の水腫を持つ幼魚は、明らかな心嚢水腫を示すが、その他の観察可能な表現型は認められないものと定義しています。Na+/K+-ATPaseに対する腎尿細管抗体を用いた解析において、重度の浮腫を伴う幼魚では、心膜および体幹の浮腫、体幹循環の欠如、および軽度から中等度の軸湾曲が認められます。損傷した尿細管は横断面で可視化され、パネルAおよびBの対照群と比較して、パネルCおよびDでは細胞極性の明らかな消失と尿細管の破綻が認められます。このパターンは、複数の横断面を比較した際の一貫した結果です。解剖学的指標として、扇状鰭および近位曲尿細管を使用しています。ゼブラフィッシュの稚魚において急性腎不全を誘発させる方法について解説しました。この手順を行う際は、直径10〜20 µmの注射針を使用することが重要です。適切なサイズを得るために、保持ピペットを数本ファイアポリッシングする必要があるかもしれませんが、一度適切なものができれば、数回の注射セッションにわたって使用できるため、そのまま使い続けることができます。また、マイクロシリーズJA装置内に気泡が入らないようにすることが重要です。気泡があると、システムの精度が低下するためです。最後に、腎管の完全な横断切片を得るために、包埋時に魚を垂直に配置してください。以上で完了です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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