Name: トランスジェニックの世代 C.エレガンスバイオリスティック変換による (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: 学ぼう、バイオリスティック法によるC. elegansトランスジェニック作製プロトコル。金粒子にDNAを結合させて線虫を照射し、新規トランスジェニック系統を確立する効率的な手法を解説します。

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この作品は、ピッツバーグ大学とNIHの助成金AG028977からアルフにシード資金によってサポートされていました

概要伝統的にトランスジェニックワームは、Cに導入遺伝子DNAをマイクロインジェクションすることによって生成されたelegansの生殖系列1,2,3,4。成功しながら、このアプローチは、特殊な機器やワームの解剖学とマイクロインジェクション技術と経験の開発が必要。さらに最近では遺伝子銃砲撃は生殖細胞系列5,6に外来DNAを導入するDNAでコーティングされた金粒子を使用する代替アプローチとして開発されました。このアプローチは成功するために実践の面でより短い時間投資が必要です。 Cの微粒子銃爆撃成功は、動物の大量を必要とするので、トランスジェニックワームを生成するために線虫は、個々のワームのレベルの低効率を有する。これらは、いくつかの方法で栽培が、我々は関与してプレートの作業と数を減らすために卵のプレートを使用することができます。我々のプロトコルは、卵のプレートやワームの準備から始まり、その後、バイオラッドPDS-1000/Heヘプタシステムを使用して砲撃のプロトコルに焦点を当てています。我々はBerezikovら7の仕事の一部が我々のプロトコルを適応した。 爆撃で、UNC - 119遺伝子は通常、トランスジェニック動物のためのマーカーとして使用されます。この変異を有するワームの株がひどくまとまりのないものであり、かろうじて移動、外観がみすぼらしいです、とdauer幼虫8を形成することはできません。 dauerは、不利な条件下での生殖成人に開発を遅らせるために使用されている代替の幼虫期である、とdauerへのエントリは複数の遺伝子9によって規制されています。 UNC - 119の遺伝子を持ついくつかの菌株はC.から入手できます。 elegansの遺伝学センター（CGC、ミネアポリス、ミネソタ州）。オリジナルDP38株（UNC - 119（ED3））も、下流の実験に影響を与える可能性のある関係のないdauer形成構成（DAF - c）の変異を運ぶ。いくつかのラボではこの突然変異をoutcrossedている、とHT1593株はCGCから入手可能です。我々はトランスジェニック動物は、DP38株を識別するために、いくらか簡単であることがわかるとトランスジェニック動物を作成する場合に、この菌株を使用する傾向があります。必要な場合には、我々は、DAF - C変異を削除するには、トランスジェニックワームを異系交配させるためにHT1593を使用してください。導入遺伝子を準備している間私達が成長しているプレートの在庫を維持できるようにDP38ワームが成長するために取得するプロトコル内の最も遅いステップの一つです。 対象の遺伝子と一緒にUNC - 119マーカーの発現は、正常な運動性と体の大きさ5の救助に基づいて導入遺伝子を発現する動物を簡単に識別することができます。 UNC - 119遺伝子は小さなCのためにいくつかの情報源、およびベクトルUNC - 119のゲノムDNAを使用して、UNC - 119プロモーターとcDNA、およびゲノムDNAから得ることができます。 briggsiae遺伝子は、8,10を使用している。我々は最近、相同組換え11およびトランスジェニック動物12を生成するためのCre - LOX組み換えによるUNC - 119遺伝子を運ぶためにワームのfosmidsを変更する方法により、アンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミドにUNC - 119カセットを追加するために単純なプロトコルを説明した。プラスミドはAddgene社（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）から入手可能である。 単一の砲撃を行うことに伴う労力は重要ではあるが、管理している間、1日のうちに複数の砲撃を行うに関与して追加の作業は最小限に抑えられます。その結果、我々は日常的に各を生成するために必要な作業を減少させるトランスジェニックワームの生産をクラスタ化する。 1。エッグプレートの準備彼らの運動障害ではプレートの他の部分はまだ食べ物が含まれている間、板の部分に餓死する傾向があるため、UNC - 119変異体ワームは、標準のNGMプレート上で増殖することは困難です。卵のプレート上に厚い食品層がUNC - 119ワームがより簡単にクロールするとすべての板7を乗っ取ることができるように卵のプレートは、この問題を解決する。卵プレートも少ないプレートが13を必要とされるようにワームの大量の成長を支援するという利点があります。通常5卵のプレート一砲撃のためにワームを成長させるために十分である。下のレシピは約50枚になりますが、必要に応じてより少ないように半減することができます。 我々はプレート内で抗生物質や抗真菌薬の両方を使用してのみプレートをシーディングするための次亜塩素処理によって生成された卵を使うので、卵のプレートは、容易に汚染されることができる。 1日目： <ol><li> 500ミリリットル瓶でLB（400 mL）を準備する。 20分のためのオートクレーブ。 </li><li> 2％寒天を1リットルNGAを使用して、〜50 10センチメートルNGAのプレートを注ぐ。我々は200μg/ mLの13にリットルとストレプトマイシンあたりナイスタチン10 mLを加える。 </li><li> 200μg/ mlのストレプトマイシンを含むLBでOP50 - 1 40mLの一晩培養して成長する。この株は、ストレプトマイシン耐性とCGCから入手可能です。 </li><li>用500mLにボトルをオートクレーブ次の日。 </li></ol> 2日目： <ol><li>滅菌瓶に10鶏の卵の別の卵黄。我々は、卵黄のセパレータを（ターゲットを含む家庭用店舗、で入手可能）を使用します。シェイク。 </li><li> LBと400MLにボリュームをもたらす。振る</li><li> 1時間60℃でインキュベートする。 </li><li>室温まで冷却。 </li><li> OP50 - 1の40mlのを追加。振る</li><li>プレート当たりの混合物の5〜8 mLを配布する。 </li><li>プレートは室温で一晩沈殿することができます。 </li></ol> 3日目： <ol><li>静かにプレートから残留液を捨てる。室温で一晩上ふたで乾燥することができます。 </li></ol> 4日目： <ol><li>必要になるまで4℃ボックスやビニール袋や店舗° Cにプレートを置く。これらのプレートは、1〜2ヶ月のために使用するためにOKのように見える。 </li></ol> 2。種まきエッグプレート<ol><li>最近飢えプレートに集中OP50を追加することで、6センチメートルNGAプレート上DP38ワームを展開します。単一の爆​​撃のために、私たちは種子5卵のプレートに〜6小さなプレートを使用してください。複数の爆撃のために、我々は、卵のプレートを播種する前に代わりにシード2濃縮ペプトンのプレートに小さなプレートを使用してください。 </li><li>次亜塩素酸13,14の使用を介してDP38ワームから卵を隔離する。滅菌S -基底またはM9バッファ13,14の卵を再懸濁します。 </li><li>卵板の適切な数に卵を（プレートあたり&gt; 10,000）を追加します。砲撃に使用する70から10日間20 ° Cで卵のプレート上でワームが成長する。プレートは、ワームは、プレートから食べ物をクリアするために始めた後に使用できるようになります。これらのプレートは、餓死することが非常に困難ですし、長い期間のために成長すると、ワームの歩留まりが向上します。 </li></ol>砲撃我々は、事前に金の株式を用意し、それが℃で使用するために4℃で保存されてください。また、必要に応じては、気づかれていないと10cm NGAプレートをスポットされています。汚点のないプレートは事前によく注ぎ、完全にワームで追加された液体の吸収を促進するために乾燥して許可する必要があります。 砲撃の日に、我々は、DNAでコーティングされた金粒子を準備最初に起動した後、ワームを洗い流してください。私たちは、その後、気づかれていないNGAプレートにワームを追加し、金粒子を洗浄、macrocarriersに転送することを終える。 金粒子の調製： <ol><li> 1.7mLチューブに金粒子の60mgを秤量し、15分間70％エタノールに浸漬。金粒子を沈殿させるために簡単にスピン。 </li><li>滅菌水で3回洗浄し、金を集めるために簡潔にするたびにスピン。 </li><li> 50パーセント滅菌グリセロール1mLのに金を再懸濁します。これは、株式、金粒子溶液であり、4℃で数ヶ月保存することができる</li></ol>ワーム： <ol><li> S -基底またはM9バッファーと卵板オフDP38ワームをフロートし、50mLのコニカルチューブに移す。 </li><li>ワームが底になるまでベンチでチューブを保持します。その後、バッファーを吸引除去し、新鮮なS -基底またはM9を追加。バッファがゴミの比較的明確になるまで、2〜3回洗浄する。 DNAのコーティングが完了するまで、この手順でワームを保つ。 </li><li>爆撃あたりのバッファのワームの約2〜3 mLを吸引しておきます。氷上で10センチメートル気づかれていないNGAのプレートに移す。 NGAのプレートが衝突前に完全に乾燥させる必要があるので、転送量を最小限に抑えることが重要です。ワームとプレートの表面全体を覆​​うようにしてください。 </li><li>プレートは氷上で乾燥することができます。氷は、乾燥しながら凝集からワームを防ぐことができます。 </li></ol>このステップは重要です：プレートはドライでなければならず、ワームは、均等にNGAのプレート上に分散した。氷の上にワームを保つことはプレート上に移動し、山に集約することを防ぎます。 DNA調製（一爆撃用）： <ol><li> 1.7mLチューブに混ぜる。 <ul><li> 50μlの金粒子。追加する前に徹底的に再懸濁します。 </li><li> 50μlのDNA（10 - 15ug）。我々は、環状または直鎖DNAの間にほとんど差を参照してください。通常、我々は、DNA精製（キアゲン社、バレンシア、カリフォルニア州）のためにキアゲンミディプレップカートリッジを使用してください。 </li><li> 50μlの2.5MのCaCl 2。このソリューションは、室温で数週間安定です。 </li><li> 20μlの0.1Mスペルミジン。 スペルミジンは、水溶液中で不安定である。我々は、-20℃で70μlスペルミジンのアリコートとストアを行う私たちは、その後、0.1M溶液を得るために右使用前に水1mLの追加。このソリューションは、それぞれの砲撃のために新しく調製する必要があります。 ボルテックスしながらのCaCl 2、DNAとスペルミジン/プロタミン滴ずつを追加し、我々は通常、低速で1.7mLチューブに金粒子渦と。リン酸カルシウムでトランスフェクションしている人にとっては、このテクニックはよく知られている。 我々はまた、プロタミンの代わりに非常に良い結果が15とスペルミジン使用している。我々は、水に新鮮な溶液（1mg/mL）を準備し、私たち電子50μlのではなく、スペルミジンの20μlの。我々はプロタミンを使用する場合、我々は通常、代わりに氷の上に置くの10分間室温で混合物をインキュベートする。プロタミンは、冷凍保管する必要はありませんし、粉は液体の代わりになります。 </li></ul></li><li> 30分間氷上で混合物をインキュベートし、定期的に懸濁液中の金粒子を保つために混ぜる。その後簡単に回転し、上清を吸引除去する。 </li><li> 300μl70％エタノールで洗う。簡単にスピン。 </li><li> 1mLの100％エタノールで洗浄する。簡単にスピン。 </li><li> 170μlの100％エタノールに再懸濁します。 </li></ol> macrocarriersの準備： <ol><li> 2 - プロパノール7 macrocarriers（バイオラッド、ヘラクレス、CA）をすすいでください。ティッシュペーパーの上に置き、室温でそれらを乾燥させて。 </li><li>各macrocarrierの中心にDNA /金の混合物の20μlのを追加。懸濁液中の金を維持するためにピペッティングの前に渦の右側にしてください。 </li><li>エタノールが蒸発してみましょう。 </li></ol> 3。砲撃実験は、システムを介してヘリウムをフラッシュする前に、空白の砲撃を行ってください。 <ol><li>真空ポンプと密接な真空ポンプのトラップをオンにします。我々は、オイルフリー真​​空ポンプを使用してください。 </li><li>ヘリウムタンクをオンにします。その圧力が≥2200psiかどうかをチェック。 </li><li> 2 - プロパノールのウェットラプチャーディスクは、（1350 PSI）、ヘプタアダプタのキャップを保持に配置する。 </li><li> PDS - 1000のシステムにアダプタをネジ込み、付属のトルクレンチで締めます。 </li><li>ホルダーとシート、それら提供されたツールでに7 macrocarriersを置きます。その後、ホルダーへのヘプタの停止画面と底を置く。上から二番目の棚に上のホルダーと場所を反転します。 macrocarriersの金の斑点の側は、この時点では下向きにする必要があります。 </li><li>ヘプタアダプタのコンセントを備えたmacrocarrierホルダーの上部の穴を合わせます。 </li><li>衝撃チャンバー内で最も低い棚の上のワーム（蓋のオフ）でコーティングされたNGAのプレートを置きます。 </li><li>完全にPDS - 1000で真空流量のノブを開きます。チャンバーは、水銀を26に達するまでVACボタンを押してください。その後、真空を維持するために位置を保持するために切り替えます。 </li><li>ディスクが破裂するまで、発射ボタンを押したままにします。圧力が1350psiに達したときに発生します。時々これが発生する50〜20秒かかります。ボタンを離します。 </li><li>チャンバー（排気口の位置）から真空を解放し、プレートを取り外します。 </li><li>真空とヘリウムをオフにします。 </li><li>ラインはヘリウムを（ヘリウムゲージが0 psiをマークする）が含まれていないまで、数回起動。 </li><li> PDS - 1000システムの電源を切ります。 </li></ol>爆撃後のワームの回復： <ol><li> ℃で20分間20℃で砲撃プレートにしておきます。 </li><li> 10mLのS -基底またはM9バッファーでプレートからワームをフロートさせます。 </li><li> 10センチメートル斑点NGAプレート - 20に0.5mLをワームを置く。 </li><li>救出ワームをチェックする前に20℃で約2週間° Cまたは室温（22〜24 ° C）を残す。 </li><li>解剖顕微鏡でUNC - 119（+）の表現型を持つワームの画面。救出ワームが非救出ワーム以上生存の優位性を持っているので、プレートが飢えている後にスクリーニングするための最適な時間です​​。 </li><li>救出ワームが含まれている各10cmのプレートから一個の行を生成します。 </li></ol> 4。代表的な結果トランスジェニック動物を得ることに関して持つプロトコルの成功は、特定の遺伝子に依存する。プロモーターの場合：GFPレポータートランスジーン私たちは20行まで取得している。より多くの典型的な結果は3-10行です。アップトランスジェニック系統の30％に統合された行ですが、これはランダムで、統合されたラインが特に望まれている場合我々は一日に複数の爆撃を実行します。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

微粒子銃砲撃はC.を含む、多くの生物に外来DNAを導入する簡単な方法です。 エレガンス 1,5,6,7,16。それは、CaCl 2の存在下でDNAと複合体を形成する金粒子に依存しています。このようなスペルミジンなどのカチオン性ポリアミンは、生体内のヌクレアーゼ分解からDNAを保護する。スペルミジンは不安定な分子なので、-20℃で小分けに格納し、右側の爆撃を実行する前に解決することが重要です。我々は砲撃のプロトコルで説明されているように、プロタミンは、外来DNA 15を提供するスペルミジンの代わりに使用できます。プロタミンは、室温でより安定しているとの代わりに粘性の高い液体の粉体であるという利点があります。 UNC - 119救助遺伝子は遺伝子と同じプラスミド上またはコーティング前に導入遺伝子の金粒子と混合されている別々のプラスミド上のシスにいずれにも配置できます。つまたは複数のプラスミドの混合は通常正常であるが、我々と他の複数のプラスミドを持つワームの砲撃は、い...

The volume for a solution in, <a href="http://www.jove.com/video/2090">Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation</a>, was incorrect.

Erratum: Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

<table><tbody><tr><td>金粒子</td><td>Inbio gold</td><td>BD021</td><td>1micron</td></tr><tr><td>Midiprepキット</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>スペルミジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4139</td><td></td></tr><tr><td>プロタミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4505</td><td></td></tr><tr><td>マクロキャリア</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2335</td><td></td></tr><tr><td>PDS-1000/He Hepta System</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>破裂円盤</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2330</td><td></td></tr><tr><td>ニスタチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1638</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトマイシン</td><td>MP Biomedicals</td><td>100556</td><td></td></tr></tbody></table>

トランスジェニックの世代 c.エレガンスバイオリスティック変換による

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

自由生活線虫C.を使用して多数の研究所虫は急速に増加している。この生物学的モデルの人気は急速な世代時間と短い寿命、簡単かつ安価な保守、完全に配列ゲノム、およびRNAiリソースおよび変異動物の配列に起因する。 C.のさらに、分析エレガンスのゲノムは、ワームの研究は、全体のマウスや培養細胞で行われた研究に重要な補助であることを示唆しているワームや高等脊椎動物の間に大きな類似性を、明らかにした。ワームの研究の強力かつ重要な部分は、遺伝子の局在性と機能を研究するトランスジェニック動物を使用する機能です。トランスジェニック動物は、ワームの生殖細胞のマイクロインジェクションを介して、または微粒子銃砲撃の利用を通じて作成することができます。砲撃は、新しい技術であり、ラボの数にはあまり馴染みがあります。ここでは、Bio - Rad社製PDS - 1000システムを使用して金粒子と微粒子銃爆撃によりトランスジェニックワームを生成する単純なプロトコルを記述する。両性生殖細胞へのDNAのマイクロインジェクションと比較して、このプロトコルは、ワームの解剖学的構造を識別したり、マイクロインジェクションを行うことに関して持つオペレータからの特別なスキルを必要としないという利点があります。さらに、複数のトランスジェニック系統は、通常、単一の爆撃から取得されます。また、マイクロインジェクションとは対照的に、微粒子銃爆撃は体外アレイと統合された導入遺伝子の両方でトランスジェニック動物を生成します。統合されたトランスジェニック系統を取得する機能は、外来DNAを統合する変異原性プロトコルの使用を避けることができます。結論では、微粒子銃爆撃、特にマイクロインジェクションで熟練になるために必要な時間と労力を投資に興味のない研究者のために、トランスジェニック動物の生成のための魅力的な方法になります。

トランスジェニックワームは一般的に使用されています<em&gt; C.エレガンス</em&gt;研究。説明するには、DNAでコーティングされた金粒子と微粒子銃砲撃を使用してワームに導入遺伝子を導入するために、効果的な、まだ、単純なプロトコルです。労力と砲撃の結果は、トランスジェニック動物の生成のためのマイクロインジェクションに匹敵する。

トランスジェニックの世代 C.エレガンスバイオリスティック変換による

自由生活線虫C. elegansを利用する研究室の数は急速に増加しています。この生物学的モデルが普及しているのは、迅速な...

この手順の全体的な目的は、バイオティクスまたはジーンガン・トランスフェクションを用いて形質転換虫を作製することです。まず、大量の虫を育成し、次に金粒子にDNAをコーティングして虫にbombardment（粒子銃射撃）を行い、その後、形質転換した子孫を単離・救出することで、新たな形質転換系統を確立します。こんにちは、ピッツバーグ大学医学部のAlfred Fisher博士の研究室のDaniel Owaです。本日は、トランスジェニック線虫を作製する手順をご紹介します。私たちは、転写因子による遺伝子調節を研究するためにこの手順を用いています。それでは始めていきましょう。卵プレートの調製は、Nystatinおよびstrep mycinを添加したNGA培地に2%agarを混ぜたものを注ぐことから始めます。10〜50 cmのプレートを用い、室温で乾燥させます。次に、500 mLボトルに入れた400 mLのLB培地と、250 mLフラスコに入れた40 mLのLB培地をオートクレーブで滅菌します。また、空の500 milliliterボトルを20分間オートクレーブ滅菌します。滅菌後、LB培地40 millilitersにストレプトマイシンを加え、最終濃度を200 micrograms per milliliterに調整します。その後、e coli株を接種します。OP 50-1を使用します。培養物を37°Cで一晩培養します。翌日、鶏卵10個分の卵黄を滅菌済みの500 milliliterボトルに入れます。LB培地を用いて容量を400 millilitersまで合わせ、振盪して均一な溶液にします。この溶液を60 degrees Celsiusで1時間インキュベートします。LB混合液が室温まで冷却されたら、40 millilitersのELI培養液をボトルに加え、振盪します。次に、5〜8 mLの培養液を準備したNGAプレートにピペットで分注します。室温で一晩乾燥させます。翌日、残っている液体を捨て、さらに室温で一晩乾燥させます。この時点で、プレートを4°Cで1〜2ヶ月間保存するか、直ちに線虫を播種することができます。DP 38 CL個体群を拡大させるには、最近飢餓状態にしたDP 38線虫を含む6 cmのNGAプレートに、濃縮したE. coli OP 50を播種して培養します。DP 38線虫から卵を単離するために、次亜塩素酸アルカリ溶液を使用します。手順については、添付のプロトコルに記載されています。卵を分離した後、Sバジル緩衝液またはM9緩衝液に懸濁させます。準備した10 cmの卵プレートにそれぞれ10,000個以上の卵を加え、20 °Cで7〜10日間、虫を育成させます。線虫が餌を食べ始めたら、パーティクルガンによる導入の準備が整ったことになります。導入用の金粒子にDNAをコーティングするため、1.7 mLチューブに60 mgの金粒子を加えます。次に70% ethanolを加え、金粒子を15分間浸漬させます。チューブを短時間遠心分離し、金粒子をペレット化します。エタノールをデカンテーションで除いた後、滅菌水で金粒子を3回洗浄します。金を1 mLの50%滅菌グリセロールに再懸濁します。金粒子ストック溶液は4 °Cで数ヶ月間保存可能です。次に、s basilまたはM lineバッファーを用いて、卵プレートから虫を浮かせて回収します。その後、それらを50 mLコニカルチューブに移します。線虫をチューブの底に沈殿させます。次に、残りのバッファーを用いて、チューブから2〜3 mLのバッファーを残してすべて吸引します。虫を、氷上で均一に冷却した10センチメートルの無斑点NGAプレートに移します。虫をプレート全体に分散させて配置してください。その後、プレートを氷上で完全に乾燥させます。これにより、乾燥過程で線虫が凝集するのを防ぎます。ボンバードメント操作の前に、線虫が均等に分布し、プレートが完全に乾燥していることが重要です。DNAコーティング金粒子を調製するために、再懸濁した金粒子 50 µL を 1.7 mL チューブに加えます。金粒子を遠心分離し、上清を除去します。次に、10〜15 µgの精製した目的の環状または直鎖状DNAと、調製直後の0.1 M精子アミン20 µLの混合液を加えます。最後に、チューブを緩やかにボルテックスしながら、2.5 M塩化カルシウム50 µLを加え、金粒子を懸濁状態に保つために時々混ぜながら、混合液を氷上で30分間インキュベートします。30分後、金粒子混合液を遠心分離します。上清を速やかに吸引し、300 µLの70% ethanolで洗浄した後、1 mLの100% Ethanolで洗浄します。最後に、DNAコーティング金粒子を170 µLの100% ethanolに再懸濁します。各ボンバードメントに使用する、金粒子を保持するためのマクロキャリア7個を2-propanolで洗浄し、室温で乾燥させます。DNAと金の混合液をボルテックスします。次に、各マクロキャリアの中心に20 µLずつ分注します。エタノールを蒸発させてください。ラプチャーディスクをHectorアダプターに挿入し、アダプターをボンバードメント装置に固定します。次に、7つのマクロキャリアをホルダーに配置し、付属のツールを使用して固定します。続いて、Hectorストップスクリーンと底板をホルダーに取り付けます。ホルダーを裏返し、マクロキャリアの金色のスポットがある面を下に向けてください。そして、上から2番目の棚に配置します。マクロキャリアホルダー上部の穴を、Hectorアダプターの出口に合わせてください。線虫がコーティングされたNGAプレートから蓋を取り外し、ボンバードメントチャンバーの最下段棚に設置します。真空流量ノブを完全に開き、チャンバー内が26 inches of mercuryに達するまで真空ボタン（vac button）を押し続けます。その後、ホールド位置に切り替えます。真空を維持したまま、ディスクが破裂するまで発射ボタン（fire button）を押し続けます。圧力が1,350 PSIに達するとこれが起こり、5秒から20秒かかる場合があります。ボタンを離し、ベント位置に切り替えてチャンバー内の真空を解除し、プレートを取り出します。ヘリウムの真空をオフにします。次に、ヘリウムライン内の空気が抜け、ヘリウムゲージが0 PSIを示すまで、数回発射ボタンを押します。最後にPDS 1000システムをオフにします。これで線虫への形質転換が完了したため、粒子銃照射後に個体を回収し、インキュベートすることができます。プレートを20 °Cで20分間静置します。次に、10 mLのS basilまたはM nineバッファーを用いてプレートから虫を回収し、0.5 mLずつの虫懸濁液を10 cmのスポットNGAプレートに接種します。その後、プレートを室温で約2週間放置します。導入遺伝子によるUNC-19表現型のレスキューを確認し、レスキューされた個体が含まれる10 cmプレートごとに1系統ずつ個別のラインを確立させます。形質転換動物の取得に関する本プロトコルの成功率は、使用する導入遺伝子によって異なります。プロモーターGFPレポーター導入遺伝子の場合、最大で20系統を取得しています。より一般的な結果としては、3〜10系統が得られます。形質転換系統の最大30%が組み込み系統となりますが、これはランダムであるため、組み込み系統を特に必要とする場合は、1日に複数回の粒子銃法（ボンバードメント）を実施します。図は、代表的な10 cmプレートに示された、トランスジェーンのボンバードメントによって救済された19匹の変異虫を示しています。レスキューされた虫は、非形質転換個体と比較してサイズが大きく、運動能が大幅に改善していることで識別できます。1つのプレートに19個の変異体が存在します。far one GFPトランスジーンで形質転換されレスキューされた虫を単離すると、GFPが発現します。この導入遺伝子は、形質転換虫の腸および下皮においてGFPを強く発現させます。この特定の導入遺伝子は虫の染色体に組み込まれており、子孫の100%がこの導入遺伝子を発現します。以上の手順を用いて、C. elegansへのバイオバリスティック法による遺伝子導入を行う方法を説明しました。十分な数の線虫を飼育し、新鮮な培地を使用することが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆さんの実験の成功をお祈りいたします。

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